CN103099838A

CN103099838A - 取自鲜蒲公英的抗乙肝病毒组合物及其在制备抗乙肝病毒药物中的应用

Info

Publication number: CN103099838A
Application number: CN 201310032574
Authority: CN
Inventors: 贾晓斌; 施亚琴; 成旭东
Original assignee: SUZHOU HAIJINSHA BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SUZHOU HAIJINSHA BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-01-29
Filing date: 2013-01-29
Publication date: 2013-05-15

Abstract

本发明涉及鲜蒲公英抗乙肝病毒组合物及其在制备抗乙肝病毒药物中的应用，属于中药领域。该组合物中包括鲜蒲公英多糖组分、酚酸组分和黄酮组分，特征是多糖组分、酚酸组分和黄酮组分的重量比为2-40∶3-70∶2-50。优化方案的酚酸组分以咖啡酸、绿原酸、异绿原酸A为代表性成分；黄酮组分以木犀草苷、槲皮素、木犀草素为代表性成分；咖啡酸、绿原酸、异绿原酸A、木犀草苷、槲皮素、木犀草素的重量比为0.25-10∶2-40∶0.25-20∶0.5-20∶0-10∶1.5-20。本发明以新鲜蒲公英为原料，经大孔树脂对有效组分进行分离纯化、富集，将有效组分混合得鲜蒲公英抗乙肝病毒组合物，工艺简便，能有效治疗乙肝病毒引起的相关疾病，且成本低，能进行大规模生产。

Description

取自鲜蒲公英的抗乙肝病毒组合物及其在制备抗乙肝病毒药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种药物组合物，具体涉及一种取自鲜蒲公英的抗乙肝病毒的药物组合物，以及该组合物在制备抗乙肝病毒药物中的应用，属于中药领域。

背景技术

乙型肝炎是乙型肝炎病毒引起的、以肝脏炎性病变为主并引起多器官损害的一种传染性疾病。乙肝病毒感染的人群患上肝硬化和肝癌的相对危险至少增加1000倍，最终导致死亡。全世界约有20亿人感染过HBV，慢性肝炎患者超过3.5亿，我国是乙肝的高发区，据统计我国约有1.3亿HBV携带者。乙肝的治疗已成为世界各国共同关心的问题。尽管HBV疫苗的出现在一定程度上缓解了HBV感染人群的增加，但仍有大量已感染HBV的患者急需得到更有效的治疗。

抗病毒治疗是治疗HBV感染的关键。目前临床上应用和正在临床研究中的抗乙肝病毒药物主要为干扰素和核苷类似物(如α-干扰素和拉米夫定)。但是这些药物有一定的副作用，价格昂贵且易产生耐药性，故临床应用具有一定的局限性。因此，需要积极开发治疗乙型肝炎的新药。在我国，中药用于HBV感染的治疗已有悠久的历史。中药治疗乙肝具有种类、数量较多，价格低廉，毒副作用小等优势，因此从中筛选出有效成分已经成为当前抗乙肝病毒新药研发的热点。目前已报道的抗乙肝病毒的复方制剂有小柴胡汤、复方六月雪、复方大黄等；单味药有鹿角草、姜黄、雪灵芝、三叶青、黄芪等。

蒲公英系菊科多年生草本植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.Mazz.、碱地蒲公英Taraxacum sinicum Kitag.据报道全世界约有2000多种(小种观点，大种观点统计约300多种)，我国有70种、1变种，全国各地均有分布，又称蒲公草、婆婆丁、地丁、黄花地丁等，具有清热解毒，消肿散结，利尿通淋的功效。用于疔疮肿毒，乳痈，瘰疬，目赤，咽痛，肺痈，肠痈，湿热黄疸，热淋涩痛。现代药理研究表明，蒲公英具有广谱抑菌，利胆保肝，抗内毒素，健胃和免疫促进等作用。

蒲公英属药材含有多种药理活性成分，主要包括酚酸类、黄酮类、多糖、香豆素类、倍半萜内酯类、三萜类、植物甾醇类、色素类、挥发油等成分，其中酚酸和黄酮类成分最为丰富。目前文献报道蒲公英共含有19种酚酸类化合物，以咖啡酸、绿原酸等为主；16种黄酮类化合物，以木犀草苷、木犀草素、槲皮素为主。

近年来有关蒲公英药理活性的报道，主要是针对蒲公英干药材，没有相关研究涉及对鲜蒲公英的抗乙肝病毒组合物及其在制备抗乙肝病毒药物中的应用。蒲公英属药材作为一种清热解毒药物在临床上长期使用，疗效确切。蒲公英具有多种药理活性，但其发挥不同药理作用的药效物质基础不尽相同。另外，蒲公英发挥抗乙肝病毒功效的物质基础并不是一类成分单独组成，而是通过多类别组分协同作用，多组分多靶点共同发挥疗效。因此，本发明从中医药整体性的角度出发，在组分结构理论的指导下，结合药物体外抗乙肝筛选模型，对鲜蒲公英抗乙肝病毒的物质基础进行确认，并对物质基础中各组分的配伍配比关系进行质量控制研究，以达到最佳的抗乙肝病毒疗效。

发明内容

本发明从整体药效出发，比较了鲜、干蒲公英抗乙肝病毒的药效差异，发现鲜蒲公英的药效明显优于干药材。因此，本发明以鲜蒲公英为原料，目的是提供一种具有抗乙肝病毒药用价值的鲜蒲公英有效组分组合物，并公开其在制备抗乙肝病毒药物中的应用，开发抗乙肝病毒相关制剂及保健品。

本发明所述的取自鲜蒲公英的抗乙肝病毒有效组分组合物，主要包括鲜蒲公英多糖组分、酚酸组分和鲜蒲公英黄酮组分，其中多糖组分、酚酸组分和黄酮组分的重量比为2-40∶3-70∶2-50。

其中，所述的酚酸组分以咖啡酸、绿原酸、异绿原酸A为代表性成分；所述的黄酮组分以木犀草苷、木犀草素、槲皮素为代表性成分；所述的咖啡酸、绿原酸、异绿原酸A、木犀草苷、槲皮素、木犀草素的重量比为0.25-10∶2-40∶0.25-20∶0.5-20∶0-10∶1.5-20。

进一步优化，本发明中多糖组分、酚酸组分和黄酮组分的重量比为3-25∶8-40∶5-30；咖啡酸、绿原酸、异绿原酸A、木犀草苷、槲皮素、木犀草素的重量比为0.25-5∶5-20∶2.5-15∶2-10∶0-8∶3-12。

更优化和更具体的方案是多糖组分、酚酸组分和黄酮组分的重量比为5-15∶15-30∶7-20；咖啡酸、绿原酸、异绿原酸A、木犀草苷、槲皮素、木犀草素的重量比为1-4∶8-16∶6-10∶2-6∶1-5∶4-9。

本发明推荐的最佳比例为，多糖组分、酚酸组分和黄酮组分的重量比为9.3∶21.9∶15.1；咖啡酸、绿原酸、异绿原酸A、木犀草苷、槲皮素、木犀草素的重量比为2.5∶11.3∶8.1∶4.8∶3.9∶6.4。

本发明提供的鲜蒲公英抗乙肝病毒有效组分组合物，以新鲜蒲公英全草为原料，按以下步骤制备得到：

步骤1：采新鲜蒲公英全草，洗净，榨汁，药渣用蒸馏水浸泡3-10h，继续榨汁1-2次；

步骤2：榨汁液浓缩、分离、干燥；

步骤3：取榨汁液干燥粉末用蒸馏水溶解，过AB-8型、HP20型、D101型、HPD600型、HPD826型或NKA-9型大孔树脂柱，蒸馏水洗脱得提取物I；10％-30％体积百分比的乙醇洗脱得提取物II，浓缩、干燥得鲜蒲公英酚酸组分；50％-70％体积百分比的乙醇洗脱得提取物III，浓缩、干燥得鲜蒲公英黄酮组分；

步骤4：将提取物I干燥，加适量的蒸馏水复溶，再加入Savage试剂除去蛋白，离心，得上清液；再用40-95％乙醇溶液沉淀，所得沉淀复溶后透析，冷冻干燥即得鲜蒲公英多糖组分；

步骤5：将鲜蒲公英多糖组分、酚酸组分和黄酮组分混合，获得组合物。

本发明中鲜蒲公英抗乙肝病毒有效组分组合物的制备，优先选择离心分离和常压过滤进行沉淀或析出物与液体分离；样品浓缩采用低温减压浓缩工艺，浓缩温度≤50℃；干燥方法采用冷冻干燥。

本发明组合物制备抗乙肝病毒药物以常规药用制剂的形式来使用，所述组合物与制剂学允许的辅料混合，制成颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、针剂、粉针剂、口服液等剂型，按照药用制剂生产领域中任何已知的方法可以制备口服使用的所需制剂，用于临床的抗乙肝病毒药物。

上述制剂中可含有辅助物质，如稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂等；

常用的稀释剂如淀粉、微晶纤维素、糊精、乳糖等；常用的润湿剂包括蒸馏水、乙醇；黏合剂有淀粉浆、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚维酮等；常用的崩解剂有干淀粉、交联聚维酮、羧甲淀粉钠；润滑剂有硬脂酸镁、微粉硅胶、聚乙二醇类、滑石粉。

上述的制剂可按照各种制剂常规的制备工艺制成。

本发明利用HepG2.2.15细胞筛选模型，对鲜、干药材整体，及鲜蒲公英榨汁液经大孔树脂分离得到的组分配伍组合物进行了药效筛选，结果说明，鲜药材抗乙肝病毒的药效明显优于干药材；具有本发明结构比的鲜蒲公英组合物均具有较好的抗乙肝病毒效果。

本发明的优点是：1、鲜蒲公英组合物具有抗乙肝病毒活性，该组合物及其抗乙肝病毒活性为首次报道。此药物其最大优点是天然产物，与现有抗乙肝病毒药相比，价格低廉，毒副作用小，可长期使用无反弹，有望开发为新型的抗乙肝病毒药物。2、鲜蒲公英组合物结合相关的制剂技术，开发价值高，生产方便，工艺简单，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为UPLC酚酸类组分含量测定谱图：1、咖啡酸；2、绿原酸；3、异绿原酸A

图2为UPLC酚酸类混合标准品谱图：1、咖啡酸；2、绿原酸；3、异绿原酸A

图3为UPLC黄酮类组分含量测定谱图：4、木犀草苷；5、槲皮素；6、木犀草素

图4为UPLC黄酮类混合标准品谱图：4、木犀草苷；5、槲皮素；6、木犀草素

图5为本发明提取分离流程图

具体实施方式

以下结合实施例及药效试验对本发明作进一步说明。

实施例1

取新鲜蒲公英全草5kg，洗净后放入榨汁机中榨汁，过滤、离心分离榨汁液和药渣，药渣用2倍量蒸馏水浸泡3h，继续榨汁1-2次，合并过滤、离心后的榨汁液，低温减压浓缩、冷冻干燥得冻干粉。将冻干粉用蒸馏水复溶以一定浓度上样到处理好的AB-8型、HP20型、D101型、HPD600型、HPD826型或NKA-9型大孑树脂柱，先用蒸馏水洗脱，收集洗脱液，低温减压浓缩，得提取物I，冷冻干燥，加适量的蒸馏水复溶，再加入Savage试剂除去蛋白，离心，得上清液；再用50％乙醇溶液沉淀，所得沉淀复溶后透析，冷冻干燥即得鲜蒲公英多糖组分；再用不同体积百分比的乙醇洗脱，收集10％-30％乙醇洗脱液，低温减压浓缩，得提取物II，冷冻干燥即得鲜蒲公英酚酸类组分；收集50％-90％乙醇洗脱液，低温减压浓缩，得提取物III，冷冻干燥即得鲜蒲公英黄酮类组分。将获得的三个组分混合即得鲜蒲公英抗乙肝病毒有效组分组合物，其中鲜蒲公英多糖组分、酚酸组分和黄酮组分的重量比为2-40∶3-70∶2-50；所述的咖啡酸、绿原酸、异绿原酸A、木犀草苷、木犀草素、槲皮素的重量比为0.25-10∶2-40∶0.25-20∶0.5-20∶0-10∶1.5-20。

实施例2

取新鲜蒲公英全草5kg，洗净后放入榨汁机中榨汁，过滤、离心分离榨汁液和药渣，药渣用3倍量蒸馏水浸泡6h，继续榨汁1-2次，合并过滤、离心后的榨汁液，低温减压浓缩、冷冻干燥得冻干粉。将冻干粉用蒸馏水复溶以一定浓度上样到处理好的AB-8型、HP20型、D101型、HPD600型、HPD826型或NKA-9型大孔树脂柱，先用蒸馏水洗脱，收集洗脱液，低温减压浓缩，得提取物I，冷冻干燥，加适量的蒸馏水复溶，再加入Savage试剂除去蛋白，离心，得上清液；再用60％乙醇溶液沉淀，所得沉淀复溶后透析，冷冻干燥即得鲜蒲公英多糖组分；再用不同体积百分比的乙醇洗脱，收集10％-35％乙醇洗脱液，低温减压浓缩，得提取物II，冷冻干燥即得鲜蒲公英酚酸类组分；收集50％-80％乙醇洗脱液，低温减压浓缩，得提取物III，冷冻干燥即得鲜蒲公英黄酮类组分。将获得的三个组分混合即得鲜蒲公英抗乙肝病毒有效组分组合物，其中鲜蒲公英多糖组分、酚酸组分和黄酮组分的重量比为3-25∶8-40∶5-30；所述的咖啡酸、绿原酸、异绿原酸A、木犀草苷、木犀草素、槲皮素的重量比为 0.25-5∶5-20∶2.5-15∶2-10∶0-8∶3-12。

实施例3

取新鲜蒲公英全草5kg，洗净后放入榨汁机中榨汁，过滤、离心分离榨汁液和药渣，药渣用4倍量蒸馏水浸泡8h，继续榨汁1-2次，合并过滤、离心后的榨汁液，低温减压浓缩、冷冻干燥得冻干粉。将冻干粉用蒸馏水复溶以一定浓度上样到处理好的AB-8型、HP20型、D101型、HPD600型、HPD826型或NKA-9型大孔树脂柱，先用蒸馏水洗脱，收集洗脱液，低温减压浓缩，得提取物I，冷冻干燥，加适量的蒸馏水复溶，再加入Savage试剂除去蛋白，离心，得上清液；再用70％乙醇溶液沉淀，所得沉淀复溶后透析，冷冻干燥即得鲜蒲公英多糖组分；再用不同体积百分比的乙醇洗脱，收集15％-30％乙醇洗脱液，低温减压浓缩，得提取物II，冷冻干燥即得鲜蒲公英酚酸类组分；收集50％-75％乙醇洗脱液，低温减压浓缩，得提取物III，冷冻干燥即得鲜蒲公英黄酮类组分。将获得的三个组分混合即得鲜蒲公英抗乙肝病毒有效组分组合物，其中鲜蒲公英多糖组分、酚酸组分和黄酮组分的重量比为5-15∶15-30∶7-20；所述的咖啡酸、绿原酸、异绿原酸A、木犀草苷、木犀草素、槲皮素的重量比为1-4∶8-16∶6-10∶2-6∶1-5∶4-9。

实施例4

取新鲜蒲公英全草5kg，洗净后放入榨汁机中榨汁，过滤、离心分离榨汁液和药渣，药渣用5倍量蒸馏水浸泡10h，继续榨汁1-2次，合并过滤、离心后的榨汁液，低温减压浓缩、冷冻干燥得冻干粉。将冻干粉用蒸馏水复溶以一定浓度上样到处理好的AB-8型、HP20型、D101型、HPD600型、HPD826型或NKA-9型大孔树脂柱，先用蒸馏水洗脱，收集洗脱液，低温减压浓缩，得提取物I，冷冻干燥，加适量的蒸馏水复溶，再加入Savage试剂除去蛋白，离心，得上清液；再用80％乙醇溶液沉淀，所得沉淀复溶后透析，冷冻干燥即得鲜蒲公英多糖组分；再用不同体积百分比的乙醇洗脱，收集10％-30％乙醇洗脱液，低温减压浓缩，得提取物II，冷冻干燥即得鲜蒲公英酚酸类组分；收集50％-70％乙醇洗脱液，低温减压浓缩，得提取物III，冷冻干燥即得鲜蒲公英黄酮类组分。将获得的三个组分混合即得鲜蒲公英抗乙肝病毒有效组分组合物，其中鲜蒲公英多糖组分、酚酸组分和黄酮组分的重量比为9.3∶21.9∶15.1；所述的咖啡酸、绿原酸、异绿原酸A、木犀草苷、木犀草素、槲皮素的重量比为2.5∶11.3∶8.1∶4.8∶3.9∶6.4。

实施例5鲜蒲公英组合物的化学指纹图谱和主要活性成分的含量测定

(1)酚酸类组分含量测定色谱条件：ACQUITY UPLC(美国Waters公司，包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Empower2色谱工作站)；色谱柱：ACQUITY UPLC BEH-C₁₈(100mm×2.1mm，1.7μm)；柱温为35℃；流速：0.3mL/min；检测波长：325nm；进样量：4μL；流动相：A为乙腈，B为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱条件：0～5min，A：2％～2％；5～9min，A：2％～3％；9～14min，A：3％～8％；14～28min，A：8％～20％；28～40min，A：20％～40％；色谱图见图1和图2。

以指标性成分咖啡酸、绿原酸、异绿原酸A的含量测定结果为依据，累积相似紫外吸收峰峰面积，根据峰面积与含量的关系，计算出本发明中总酚酸组分含量约占该溶剂部位整体含量的69.3％。

(2)黄酮类组分含量测定色谱条件：ACQUITY UPLC(美国Waters公司，包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Empower2色谱工作站)；色谱柱：ACQUITY UPLC BEH-C₁₈(100mm×2.1mm，1.7μm)；柱温为35℃；流速：0.3mL/min；检测波长：350nm；进样量：4μL；流动相：A为乙腈，B为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱条件：0～5min，A：2％～2％；5～9min，A：2％～3％；9～14min，A：3％～8％；14～28min，A：8％～20％；28～40min，A：20％～40％；色谱图见图3和图4。

以指标性成分木犀草苷、槲皮素、木犀草素的含量测定结果为依据，累积相似紫外吸收峰峰面积，根据峰面积与含量的关系，计算出本发明中总黄酮组分含量约占该溶剂部位整体含量的63.6％。

实施例6蒲公英组合物体外抗乙肝病毒研究

本实验采用经典的体外抗乙肝病毒药物筛选模型HepG2.2.15细胞模型，不同浓度的鲜、干药材整体及不同配比的鲜蒲公英组合物给药HepG2.2.15细胞数天，取其细胞上清液，分别测定其乙肝表面抗原(HBsAg)，e抗原(HBeAg)的分泌和HBV DNA的表达情况，来判断药物是否有效，同时实验过程中采用MTT法测定不同药物组的细胞毒性。综合以上实验设计，对鲜蒲公英组合物进行体外抗乙肝病毒的药效学研究，并以临床上应用得到证实的拉米夫定(3TC)作为阳性对照药物，以此评价鲜蒲公英组合物的抗乙肝病毒效果。

细胞毒性HepG2.2.15细胞复苏后，以含20％胎牛血清的MEM培养基培养于细胞瓶中，80％融合后，用胰酶消化1-4min，终止消化，弃上清，加适量培养基轻轻吹打，调整细胞浓度为5×10⁵/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，37℃，5％CO₂，24h，细胞贴壁后用于实验。吸除细胞上清，加入不同浓度的鲜、干蒲公英药材及不同配比的鲜蒲公英组合物，进行培养6d，每3天更换一次含药培养基，收集细胞上清于-70℃冰箱中备存，用于抗原及HBV DNA的检测。用MTT法检测药物对HepG2.2.15细胞的毒性作用，在酶标仪下于490/570nm 波长读取其OD值。实验重复3次。

鲜、干蒲公英药材及不同配比的鲜蒲公英组合物对HBsAg和HBeAg分泌的影响采用ELISA法测定细胞上清液中HBsAg和HBeAg的分泌情况，取阳性药3TC和鲜、干蒲公英药材及不同配比的鲜蒲公英组合物不同给药浓度的HepG2.2.15细胞上清，按照HBsAg、HBeAg酶联免疫试剂盒操作说明操作，用酶标仪，于λ450/630nm双波长读取相应的OD值，计算其对HBsAg和HBeAg的抑制率。

鲜、干蒲公英药材及不同配比的鲜蒲公英组合物对HBV DNA表达的抑制作用为进一步说明鲜蒲公英组合物具有一定的抗乙肝病毒作用，用荧光定量PCR试剂盒检测HBV DNA的表达水平。HBV DNA的提取、扩增等所有操作均按试剂盒说明书进行。

实验结果分析

(1)鲜、干蒲公英药材抗乙肝病毒药效分析

MTT细胞毒性分析对于鲜、干蒲公英药材抗乙肝病毒的分析，实验采用多个浓度进行分析，取10、30、60、100、200、300、400μg/mL的鲜、干蒲公英药材作用于HepG2.2.15细胞，每3天收集细胞上清并换新鲜含药培养基，于6d收集所有细胞上清，采用MTT法分析样品不同浓度对细胞毒性的影响。MTT的结果显示，鲜、干蒲公英药材的浓度小于等于60μg/mL时，细胞存活率＞95％。3TC阳性对照是通过多次实验筛选的抗乙肝病毒较佳的浓度，数据分析只采用100μg/mL3TC与实验样品对比分析。所以，实验样品选取10、30、60μg/mL三个浓度重复实验，不同浓度的鲜、干蒲公英药材及3TC的细胞毒性测定结果见表1。

鲜、干蒲公英药材对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用不同浓度的鲜、干蒲公英药材对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用见表2、表3。随着浓度的增加，鲜、干蒲公英药材对HBsAg和HBeAg的抑制率增加，当浓度为60μg/mL时，鲜药材对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为42.07％和31.84％；而干药材对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为30.37％和22.61％，由此分析，鲜、干蒲公英药材对HBsAg和HBeAg均有抑制作用，且呈现浓度依耐性，鲜蒲公英对HBsAg和HBeAg抑制作用优于干药材。

表1鲜、干蒲公英药材对HepG2.2.15细胞的毒性作用

表2鲜蒲公英对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg分泌的影响

与正常组比较，^*：p＜0.05，^**：p＜0.01

表3干蒲公英对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg分泌的影响

与正常组比较，^*：p＜0.05，^**：p＜0.01

鲜、干蒲公英药材对HBV DNA表达的抑制作用为进一步说明鲜、干蒲公英药材具有一定的抗乙肝病毒作用，本发明用荧光定量PCR试剂盒检测HBV DNA的表达水平。由表4和表5可知，鲜、干蒲公英药材对HBV DNA的抑制具有浓度依赖性，正常对照组HBV DNA的含量达到5.40×10⁵copies/mL，3TC100μg/mL连续作用6d，HepG2.2.15细胞上清液中HBV DNA下降到9.28×10³copies/mL，与对照组相比具有明显性差异；鲜、干蒲公英对HBV DNA的抑制作用在浓度为60μg/mL取得了最佳效果，HBV DNA分别下降到1.78×10⁴copies/mL和3.65×10⁴copies/mL，与对照组相比具有显著性差异，而与3TC对比则无显著性差异。表明鲜、干蒲公英样品和3TC连续处理6d，能显著抑制HBV DNA的合成，且鲜蒲公英的效果优于干药材。

表4鲜蒲公英对HepG2.2.15细胞中HBV DNA表达的影响

与正常组比较，^*：p＜0.05，^**：p＜0.01

表5干蒲公英对HepG2.2.15细胞中HBV DNA表达的影响

与正常组比较，^*：p＜0.05，^**：p＜0.01

(2)不同配比的鲜蒲公英组合物抗乙肝病毒药效分析

MTT细胞毒性分析对于不同配比的鲜蒲公英组合物抗乙肝病毒的分析，实验采用10、30、60μg/mL三个浓度作用于HepG2.2.15细胞，采用MTT法分析样品不同浓度对细胞毒性的影响。MTT的结果显示，不同配比的鲜蒲公英组合物在浓度为10、30、60μg/mL时，细胞存活率均＞95％。所以，实验样品选取10、30、60μg/mL三个浓度重复实验，不同浓度的鲜蒲公英组合物及3TC的细胞毒性测定结果见表6。

不同配比的鲜蒲公英组合物对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用不同浓度的鲜蒲公英组合物对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用见表7。随着浓度的增加，鲜蒲公英组合物对HBsAg和HBeAg的抑制率增加。由此分析，不同配比的鲜蒲公英组合物均对HBsAg和HBeAg有抑制作用，且呈现浓度依耐性。

表6不同配比的鲜蒲公英组合物对HepG2.2.15细胞的毒性作用

表7不同配比的鲜蒲公英组合物对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg分泌的影响

与正常组比较，^*：p＜0.05，^**：p＜0.01

不同配比的鲜蒲公英组合物对HBV DNA表达的抑制作用为进一步说明不同配比的鲜蒲公英组合物具有一定的抗乙肝病毒作用，本发明用荧光定量PCR试剂盒检测HBV DNA的表达水平。由表8可知，不同配比的鲜蒲公英组合物对HBV DNA的抑制具有浓度依赖性，在浓度为60μg/mL时对HBV DNA的抑制取得了最佳效果，与对照组相比具有显著性差异，而与3TC对比则无显著性差异。表明四种不同配比的鲜蒲公英组合物均能显著抑制HBV DNA的合成。

表8不同配比的鲜蒲公英组合物对HepG2.2.15细胞HBV DNA表达的影响

与正常组比较，^*：p＜0.05，^**：p＜0.01

除鲜蒲公英组合物体外药效试验的具体实例外，在抗乙肝病毒药物制剂方面，主要有以下实例：

实施例7

分别取鲜蒲公英多糖组分、酚酸组分和黄酮组分1800mg、2300mg、2400mg，加适量的淀粉糊精按制剂学胶囊剂的常规工艺制成小颗粒，填入1000粒胶囊，每粒含10mg活性成分。用法用量：口服，每次2粒，一日3次，小儿酌减，15天为一个疗程。

实施例8

分别取鲜蒲公英多糖组分、酚酸组分和黄酮组分2000mg、2600mg、2400mg，加适量的辅料，按制剂学片剂的常规工艺进行压片，制成500片片剂，每片含10mg活性成分的，作为抗病毒制剂或保健品。用法用量：口服，每次2片，一日3次，小儿酌减，15天一个疗程。

实施例9

分别取鲜蒲公英多糖组分、酚酸组分和黄酮组分2000mg、2800mg、2000mg，加适量蔗糖，加水稀释到1000mL，每瓶10mL，每瓶含鲜蒲公英组合物20mg。用法用量：口服，每次1瓶，一日3次，15天一个疗程。

实施例10

分别取鲜蒲公英多糖组分、酚酸组分和黄酮组分2400mg、1900mg、2700mg，加适量的蔗糖和糊精，按制剂学颗粒剂的常规工艺进行制备，每袋重0.5g，每袋含鲜蒲公英组合物20mg。用法用量：口服，每次1袋，一日3次，小儿酌减，15天一个疗程。

实施例11

药用制剂鲜蒲公英组合物制备成注射剂，以生产注射剂产品1000支为例，分别取鲜蒲公英多糖组分、酚酸组分和黄酮组分2100mg、2500mg、2300mg，加适量注射用甘露醇，按制剂学注射剂的常规工艺进行，每支含鲜蒲公英组合物10mg。用法用量：溶解在100mL注射液中，一日1次，小儿酌减，30天一个疗程。

Claims

1.一种取自鲜蒲公英的抗乙肝病毒有效组分组合物，其特征在于该组合物的组成包括鲜蒲公英多糖组分、鲜蒲公英酚酸组分、鲜蒲公英黄酮组分，其中多糖组分、酚酸组分、黄酮组分的重量比为2-40∶3-70∶2-50。

2.根据权利要求1所述的提取自鲜蒲公英的抗乙肝病毒有效组分组合物，其特征在于，所述的酚酸组分以咖啡酸、绿原酸、异绿原酸A为代表性成分；所述的黄酮组分以木犀草苷、木犀草素、槲皮素为代表性成分；所述的咖啡酸、绿原酸、异绿原酸A、木犀草苷、槲皮素、木犀草素的重量比为0.25-10∶2-40∶0.25-20∶0.5-20∶0-10∶1.5-20。

3.根据权利要求2所述的提取自鲜蒲公英的抗乙肝病毒有效组分组合物，其特征在于，所述的多糖组分、酚酸组分、黄酮组分的重量比∶3-25∶8-40∶5-30；所述的咖啡酸、绿原酸、异绿原酸A、木犀草苷、槲皮素、木犀草素的重量比为0.25-5∶5-20∶2.5-15∶2-10∶0-8∶3-12。

4.根据权利要求3所述的提取自鲜蒲公英的抗乙肝病毒有效组分组合物，其特征在于，所述的多糖组分、酚酸组分、黄酮组分的重量比∶5-15∶15-30∶7-20；所述的咖啡酸、绿原酸、异绿原酸A、木犀草苷、槲皮素、木犀草素的重量比为1-4∶8-16∶6-10∶2-6∶1-5∶4-9。

5.根据权利要求3所述的提取自鲜蒲公英的抗乙肝病毒有效组分组合物，其特征在于，所述的多糖组分、酚酸组分、黄酮组分的重量比∶9.3∶21.9∶15.1；所述的咖啡酸、绿原酸、异绿原酸A、木犀草苷、槲皮素、木犀草素的重量比为2.5∶11.3∶8.1∶4.8∶3.9∶6.4。

6.一种鲜蒲公英抗乙肝病毒有效组分组合物的制备方法，其特征在于按以下步骤制备得到：

步骤2：榨汁液浓缩、分离、干燥；

7.根据权利要求6所述的具有抗乙肝病毒作用的有效组分组合物的制备方法，其特征在于采用离心分离和常压过滤进行沉淀或析出物与液体分离；样品浓缩采用低温减压浓缩工艺，浓缩温度≤50℃；干燥方法采用冷冻干燥。

8.根据权利要求6所述的具有抗乙肝病毒作用的有效组分组合物的制备方法，在步骤4中，将鲜蒲公英多糖组分、酚酸组分、黄酮组分与制剂学允许的辅料混合，制成颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、针剂、粉针剂、口服液等剂型，其特征在于，药用辅料选自：稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂等，其中，

所述的稀释剂选自：淀粉、微晶纤维素、糊精、乳糖等；

所述的润湿剂选自：蒸馏水、乙醇；

所述的黏合剂选自：淀粉浆、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚维酮等；

所述的崩解剂选自：干淀粉、交联聚维酮、羧甲淀粉钠等；

所述的润滑剂选自：硬脂酸镁、微粉硅胶、聚乙二醇类、滑石粉。

9.一种取自鲜蒲公英的抗乙肝病毒组合物及其在制备抗乙肝病毒药物中的应用，其用途在于制备抗乙肝病毒制剂及保健品。