CN1698606A

CN1698606A - 喹诺里西啶类生物碱在制备抗乙肝病毒药物中的用途

Info

Publication number: CN1698606A
Application number: CN 200510026572
Authority: CN
Inventors: 陈道峰; 丁佩兰; 周佩; 黄海
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2005-06-08
Filing date: 2005-06-08
Publication date: 2005-11-23

Abstract

本发明属中药制药领域，涉及喹诺里西啶类生物碱在制备抗乙肝病毒药物中的新用途。本发明从豆科槐属(Sophora)植物苦参(S.flavescens)和山豆根(S.tonkinensis)中提取喹诺里西啶类生物碱并证实其抗HBV病毒活性。所述的喹诺里西啶类生物碱经与阳性对照拉米呋啶和目前临床用于治疗乙肝疾病的药物苦参碱和氧化苦参碱药理试验比较，结果证实具有显著的抗HBV作用，且有效浓度低，细胞毒性较小，本发明所述的化合物喹诺里西啶类生物碱，可进一步作为活性成分，制成新型治疗乙肝疾病的药物。

Description

喹诺里西啶类生物碱在制备抗乙肝病毒药物中的用途

技术领域

本发明属中药制药领域，涉及喹诺里西啶类生物碱在制备抗乙肝病毒药物中的新用途。

背景技术

乙肝病毒(HBV)感染是全球性的影响人类健康的主要疾病之一，全世界大约有3亿多人为慢性HBV携带者，我国约占半数。由于HBV感染可以导致慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌，因此已成为影响人类寿命的九大疾病之一。由于慢性HBV感染者较非携带者发生肝癌的相对危险率为217，因此在全世界每年大约有200万人死于乙肝引起的肝硬化和肝癌，而我国又是乙型肝炎的高发区，每年约有25万人死于与乙肝相关的慢性肝病(肝硬化与肝癌)。这给人民健康和国民经济带来巨大损失。因此，寻求高效低毒的抗HBV药物已成为刻不容缓的问题。

尽管药物化学工作者在筛选抗HBV药物的过程中进行了不懈的努力，但到目前为止人们还没有找到一种特效药来治愈HBV感染。临床上已获得FDA正式批准使用的α-干扰素和核苷类药物拉米呋啶只能在某种程度上获得治疗效果，对大多数病人还达不到治愈的目的，停止治疗后的“反跳”现象是医药工作者最感棘手的问题，所以开发研制高效、低毒、不“反跳”的抗HBV新药向药物化学工作者提出了挑战。在筛选抗HBV新药的过程中，越来越多的药物化学工作者把注意力转向了植物来源丰富，价廉易得，毒副作用小，分子结构复杂多样的天然化合物。

中药山豆根(Radix Sophorae tonkinensis)和苦参(RadixSophorae flavescentis)都是我国历史悠久的传统中药，为豆科(Leguminosae)槐属(Sophora L.)。从古至今，对其化学成分、药理作用和临床应用的研究一直十分活跃。山豆根始载于《开宝本草》，为中医喉科要药，具有泻火解毒、消肿利咽、止痛杀虫的功效，主治火毒蕴结、咽喉肿痛、齿龈肿痛等症。苦参始载于我国最早的医学文献《神农本草经》，列为中品，具有清肠燥湿、祛风杀虫的功效，主治湿热泻痢、肠风便血、黄疸、小便不利、水肿以及带下、阴痒、疥癣、麻风、皮肤瘙痒、湿毒疮疡等症。已知两种药材都含有喹诺里西啶类生物碱、异戊烯基类黄酮和齐墩果烯型三萜等成分，其中喹诺里西啶(quinolizidine)类生物碱是两种药材的药效物质基础。这类生物碱具有抗肿瘤、抗心律失常、抗微生物、抗溃疡、升白细胞等多方面的药理作用，另外还呈现出值得重视的抗病毒活性。药理实验表明山豆根总碱对咽喉部常见病毒CB，Adv，RSV有抑制作用，最小抑病毒浓度为24.41μg/mL，对流感、副流感病毒也有一定抑制作用。山豆根水煎剂和苦参粗提液在体内、外对柯萨奇病毒B(CVB)都有显著的抗病毒作用。另外氧化苦参碱有保肝降酶以及促进肝细胞再生和修复的作用，腹腔注射能降低HBV转基因小鼠肝脏内HBsAg和HBeAg的含量，并有抗HBV作用。苦参碱能降低脂多糖/D-氨基半乳糖(LPS/D-GalN)和脂多糖/痤疮丙酸杆菌(LPS/PA)引起的血清丙氨酸转氨酶(ALT)活性升高及小鼠对LPS/D-GalN和LPS/PA致死毒性敏感性，并抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞(PMφ)释放肿瘤坏死因子(TNF)。目前，临床上除了广泛应用药材的单方和复方制剂外，还出现了采用其总碱和单一生物碱制备的各种新剂型，用于治疗肝炎、脑炎等传染性疾病。如临床采用苦黄注射液、苦参素注射液(主要含氧化苦参碱)和肝炎灵注射液(山豆根总碱)等治疗急性黄疸型肝炎和慢性乙型肝炎均取得良好疗效。但至今未见其他喹诺里西啶类生物碱单体对抗HBV的作用及用于治疗乙肝的报导。

综观国内外的报导，均未见除苦参碱和氧化苦参碱之外的喹诺里西啶类生物碱的抗HBV药效及用其制备的抗HBV药物。

发明内容

本发明的目的是提供喹诺里西啶类生物碱在制备治疗乙肝药物中的应用。尤其是化合物槐果碱、氧化槐果碱、莱蔓碱或13，14-去氢槐定碱在抗乙肝病毒药物中的应用及其制备方法。

本发明根据多年的临床用药经验和“祛邪扶正”原则，应用现代药理筛选方法，对植物药中抑制HBV的活性物质进行研究，从豆科槐属(Sophora)植物苦参(S.flavescens)和山豆根(S.tonkinensis)中提取喹诺里西啶类生物碱并证实其抗HBV病毒活性。

本发明所述的活性生物碱类化合物具有如下式I的化学结构：

其中各取代基及化合物1-11的情况如表1所示：

表1

化合物	R₁	R₂	R₃	R₄	R₅	X	C₁₂-C₁₃	C₁₃-C₁₄
化合物	R₁	R₂	R₃	R₄	R₅	X	C₁₂-C₁₃	C₁₃-C₁₄	1234567891011	α-OHα-Hα-Hα-OHα-Hα-Hα-Hα-Hβ-Hα-Hα-H	α-Hα-Hα-Hα-Hβ-Hα-Hα-Hα-Hα-Hα-Hα-H	HHHHHOHHHHOHH	HHHHHHHHHHOH	HOHHHHHHHHHH	孤对电子孤对电子孤对电子孤对电子孤对电子孤对电子O孤对电子孤对电子孤对电子孤对电子	单键单键单键单键单键单键单键双键单键单键单键	单键单键双键双键单键单键双键单键双键双键双键

本发明涉及的喹诺里西啶类生物碱包括化合物(+)-槐花醇(1)、(-)-14β-羟基苦参碱(2)、(-)-槐果碱(3)、(-)-5α-羟基槐果碱(4)、(+)-别苦参碱(5)、(-)-9α-羟基苦参碱(6)、(+)-氧化槐果碱(7)、(+)-莱蔓碱(8)、(-)-13，14-去氢槐定碱(9)、(-)-9α-羟基槐果碱(10)和(+)-12α-羟基槐果碱(11)。

本发明的化合物通过下述方法制备：

所述山豆根为豆科槐属植物越南槐Sophora tonkinensisGapnep.的干燥根及根茎，主产于广西、贵州、云南、广东、江西等地，药用根和根茎，其味苦、性寒、有毒，具有清热解毒、消肿利咽的功效。取山豆根粗粉9kg，用1％硫酸(v/v)室温冷浸(15L×4次)至酸水液不呈生物碱反应，合并酸水提取液，经Na₂CO₃碱化至pH10~11后以氯仿等体积多次萃取完全，减压回收氯仿得总提取物135g，再经酸-碱法如上处理净化总碱得浸膏120g(提取率1.33％)。总碱浸膏120g干法上样进行硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯-乙醇-氨水梯度洗脱，所得流分以不同洗脱剂进行反复硅胶柱层析，分离得到(+)-苦参碱、(+)-氧化苦参碱、(+)-槐花醇(1)、(-)-14β-羟基苦参碱(2)、(-)-槐果碱(3)和(-)-5α-羟基槐果碱(4)。

其中，(+)-槐花醇((+)-sophoranol)(1)C₁₅H₂₄N₂O₂(264)，白色方晶(乙酸乙酯)，m.p.157-158℃，[α]²⁴ _D+55.3°(c0.10，MeOH)。UV(MeOH)λ_max(logε)nm：207(3.97)；IR(KBr)ν_maxcm^-1：3233，2936，2866，2809，2763，1630，1462，1441，1418，1333，1293，1257，1116，1087，1031；¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)δppm：4.33(1H，br d，J＝13.4 Hz，H-17α)，3.80(1H，m，H-11)，3.23(1H，d，J＝3.4Hz，H-17β)，2.88(1H，dt，J＝11.3，1.8Hz，H-10β)，2.76(1H，br d，J＝11.5Hz，H-2β)，2.63(1H，br s)，2.43(1H，ddt，J＝17.2，8.4Hz，H-14β)，2.28(1H，ddd，J＝17.2Hz，H-14α)，1.80～2.13(8H，m)，1.30～1.67(8H，m)；¹³C-NMR(CDCl₃，100MHz)δppm：(表2)；EI-MS m/z(％)：264([M]⁺，59)，248(12)，247(100)，245(45)，235(6)，222(12)，221(29)，208(5)，193(12)，178(3)，166(16)，153(6)，152(10)，148(12)，125(6)，112(30)，96(36)，55(20)，41(18)。

其中，(-)-14β-羟基苦参碱((-)-14β-hydroxymatrine)(2)C₁₅H₂₄N₂O₂(264)，淡黄色油状物，[α]²⁷ _D-7.8°(0.66，MeOH)。UV(MeOH)λ_max(logε)nm：207(3.94)；IR(CH₂Cl₂)ν_max cm^-1：3441，2934，2858，2807，2767，1634，1445，1336，1284，1281，1110，1069；¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)δppm：4.26(1H，dd，J＝12.8，4.0Hz，H-17α)，3.92(1H，dd，J＝11.5，5.1Hz，H-14α)，3.81(1H，m，H-11)，3.15(1H，t，J＝12.8Hz，H-17β)，2.83(1H，dm，J＝13.1Hz，H-10β)，2.79(1H，dm，J＝13.1Hz，H-2β)，2.17～2.25(2H，m)，2.07(1H，br s)，1.88～2.00(3H，m)，1.50～1.72(6H，m)，1.26～1.46(6H，m)；¹³C-NMR(CDCl₃，75MHz)δppm：(表2)；EI-MSm/z(％)：265(19)，264([M]⁺，100)，263(72)，247(3)，246(4)，235(13)，222(48)，221(55)，218(30)，193(57)，192(26)，178(20)，177(19)，162(10)，150(29)，149(15)，148(17)，137(14)，136(21)，122(12)，109(8)，98(12)，96(33)，80(8)，55(9)，41(11)；ESI-MS m/z：265.2([M+H]⁺)，287.2([M+Na]⁺)。

其中，(-)-槐果碱((-)-sophocarpine)(3)C₁₅H₂₂N₂O(246)，白色针晶(石油醚)，m.p.53-54℃，[α]²⁴ _D-16.0°(c0.10，MeOH)。UV(MeOH)λ_max(logε)nm：260(3.40)，207(4.02)；IR(KBr)ν_max cm^-1：3444，3304，2944，2925，2860，2805，2778，1660，1595，1436，1335，1124，1095，822；¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)δppm：6.45(1H，ddd，J＝9.8，5.0，3.8Hz，H-13)，5.89(1H，dt，J＝9.8，2.2Hz，H-14)，4.14(1H，dd，J＝12.9，4.7Hz，H-17α)，3.98(1H，dd，J＝16.9，9.6Hz，H-11)，3.17(1H，t，J＝12.9Hz，H-17β)，2.81(2H，m，H-2β，10β)，2.60(1H，m，H-6)，2.20(1H，m)，2.10(1H，br s)，1.36～2.00(12H，m)；¹³C-NMR(CDCl₃，100MHz)δppm：(表2)；EI-MS m/z(％)：247(13)，246([M]⁺，73)，245(100)，217(8)，203(18)，177(16)，160(7)，159(7)，150(28)，149(7)，148(10)，138(27)，137(10)，136(16)，134(7)，122(11)，110(8)，109(6)，98(11)，96(32)，80(7)，68(13)，41(15)；ESI-MS m/z：247.3([M+H]⁺)，269.2([M+Na]⁺)。

其中，(-)-5α-羟基槐果碱((-)-5α-hydroxysophocarpine)(4)C₁₅H₂₂N₂O₂(262)，白色细针晶(乙醚-正己烷)，m.p.178-180℃，[α]²⁰ _D-19.7°(c 0.10，MeOH)。UV(MeOH)λ_max(logε)nm：259(3.49)，207(4.08)；IR(KBr)ν_max cm^-1：3218，2939，2919，2869，2810，2764，1666，1612，1422，1294，1116，1091，1045，830；¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)δppm：6.49(1H，ddd，J＝9.8，4.8，3.9Hz，H-13)，5.92(1H，dt，J＝9.8，1.9Hz，H-14)，4.15(1H，br d，J＝13.7Hz，H-17α)，3.97(1H，dd，J＝18.1，8.3Hz，H-11)，3.34(1H，d，J＝13.7Hz，H-17β)，2.87(1H，brd，J＝11.4Hz，H-10β)，2.76(1H，br d，J＝11.4Hz，H-2β)，2.63(1H，dt，J＝18.3，5.1Hz，H-12α)，2.46(1H，br s)，2.27(2H，m)，1.99(1H，m)，1.89(1H，br s)，1.85(2H，m)，1.60(5H，m)，1.43(2H，m)；¹³C-NMR(CDCl₃，75MHz)δppm：(表2)；EI-MS m/z(％)：263(16)，262([M]⁺，100)，261(83)，245(61)，244(21)，243(31)，233(2)，219(15)，217(2)，203(2)，193(22)，166(17)，153(9)，152(14)，150(9)，136(23)，125(5)，124(23)，122(11)，112(14)，110(34)，109(22)，97(20)，96(89)，82(17)，68(26)，55(15)，41(32)；ESI-MS m/z：263.1([M+H]⁺)，285.2([M+Na]⁺)。

苦参为豆科槐属植物苦参Sophora flavescens Ait.的干燥根，全国各地均产，药用根，其味苦、性寒，具有清热燥湿、杀虫利尿的功效。取苦参粗粉14kg，用1％硫酸(v/v)室温冷浸(24L×4次)至酸水液不呈生物碱反应，合并酸水提取液，经Na₂CO₃碱化至pH10～11后以氯仿等体积多次萃取完全，减压回收氯仿得总提取物280g，再经酸-碱法如上处理净化总碱得浸膏250g(提取率1.8％)。总碱浸膏240g用少量氯仿(约200mL)溶解，加入10倍量体积的乙醚(2L)，轻轻摇晃2min，静置后析出淡黄色的颗粒状结晶。抽滤，滤液浓缩后再如上反复操作4次，合并粗晶(A)共70g，滤液浓缩得浸膏(B)165g。取粗晶(A)1.2g，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-氨水(10∶2∶1∶0.1)进行硅胶柱层析，得(+)-氧化苦参碱和(+)-氧化槐果碱(7)。将浸膏(B)150g干法上样进行硅胶柱层析，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-氨水梯度洗脱，所得流分以不同的洗脱剂进行反复的硅胶柱层析和薄层色谱制备，分离得到(-)-槐果碱(3)、(+)-别苦参碱(5)、(-)-9α-羟基苦参碱(6)、(+)-莱蔓碱(8)、(-)-13，1 4-去氢槐定碱(9)、(-)-9α-羟基槐果碱(10)和(+)-12α-羟基槐果碱(11)。

其中，(+)-别苦参碱((+)-allomatrine)(5)C₁₅H₂₄N₂O(248)，白色针簇晶(正己烷)，m.p.102-104℃，[α]²⁴ _D+73.5°(c0.10，MeOH)。UV(MeOH)λ_max(logε)nm：207(3.93)；IR(KBr)ν_maxcm^-1：3436，3255，2931，2881，2851，2805，2751，1632，1439，1418，1354，1307，1240，1163，1118，1073，1019；¹H-NMR(CDCl₃，500MHz)δppm：4.72(1H，dd，J＝12.5，3.8Hz，H-17α)，3.02(1H，dt，J＝9.6，5.4Hz，H-11)，2.90(1H，br d，J＝13.3Hz，H-10β)，2.87(1H，br d，J＝13.7Hz，H-2β)，2.44(1H，br d，J＝17.2Hz，H-14β)，2.29(1H，ddd，J＝17.2，5.8，5.7Hz，H-14α)，2.18(1H，t，J＝12.5Hz，H-17β)，1.96～2.10(3H，m)，1.83～1.89(2H，m)，1.68～1.74(5H，m)，1.60(1H，m)，1.49(2H，m)，1.39(1H，t，J＝9.5Hz)，1.31(1H，m)，0.88～1.00(2H，m)；¹³C-NMR(CDCl₃，125MHz)δppm：(表2)；EI-MS m/z(％)：249(8)，248([M]⁺，51)，247(100)，219(2)，205(4)，192(1)，177(37)，162(3)，150(28)，149(10)，148(9)，137(5)，136(15)，122(5)，109(2)，98(3)，96(7)，55(5)，41(4)。

其中，(-)-9α-羟基苦参碱((-)-9α-hydroxymatrine)(6)C₁₅H₂₄N₂O₂(264)，白色细针晶(石油醚-丙酮)，m.p.158-159℃，[α]²⁴ _D+62.0°(c 0.10，MeOH)。UV(MeOH)λ_max(logε)nm：206(3.96)；IR(KBr)ν_max cm^-1：3251，2936，2890，2849，2811，2762，1605，1484，1441，1341，1286，1134，1068；¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)δppm：4.39(1H，dd，J＝12.8，4.3Hz，H-17α)，3.84(1H，m，H-9β)，3.65(1H，m，H-11)，3.05(1H，m，H-10β)，2.98(1H，t，J＝12.8Hz，H-17β)，2.83(1H，br d，J＝10.7Hz，H-2β)，2.43(1H，br dt，J＝17.2，4.4Hz，H-14β)，2.25(1H，m，H-14α)，2.16(2H，m)，2.07(2H，m)，1.42～1.85(10H，m)，1.30(1H，dt，J＝12.4，4.7Hz)；¹³C-NMR(CDCl₃，100MHz)δppm：(表2)；EI-MS m/z(％)：264([M]⁺，100)，263(67)，247(16)，246(5)，235(9)，222(10)，221(13)，219(21)，208(15)，205(84)，193(19)，178(8)，166(35)，164(22)，153(10)，152(10)，114(11)，112(18)，98(9)，96(43)，55(28)，41(24)。

其中，(+)-氧化槐果碱((+)-oxysophocarpine)(7)C₁₅H₂₂N₂O₂(262)，白色棱晶(丙酮)，m.p.202-204℃，[α]²⁴ _D+61.5°(c0.10,MeOH)。UV(MeOH)λ_max(logε)nm：257(3.34)，207(3.91)；IR(KBr)ν_max cm^-1：3526，3386，3052，2966，2934，2906，2871，2192，1656，1596，1424，1321，942，823；¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)δppm：6.47(1H，ddd，J＝9.7，6.0，3.0Hz，H-13)，5.91(1H，dt，J＝9.7，1.2Hz，H-14)，5.09(1H，dt，J＝10.6，6.2Hz，H-11)，4.18(1H，t，J＝12.3Hz，H-17β)，4.07(1H，dd，J＝12.3，5.9Hz，H-17α)，3.07～3.26(5H，m，H-2α，2β，6，10α，10β)，2.60～2.81(3H，m)，2.10(1H，m)，1.96(2H，m)，1.50～1.86(6H，m)；¹³C-NMR(CDCl₃，100MHz)δppm：(表2)；EI-MS m/z(％)：262([M]⁺，2)，261(2)，246(51)，245(100)，243(28)，221(29)，217(6)，203(15)，177(15)，150(28)，148(19)，138(29)，137(10)，136(27)，122(16)，109(9)，98(12)，96(44)，41(33)。

其中，(+)-莱蔓碱((+)-lehmannine)(8)C₁₅H₂₂N₂O(246)，白色针簇晶(石油醚)，m.p.93-94℃，[α]²⁴ _D+87.0°(c 0.10，MeOH)。UV(MeOH)λ_max(logε)nm：206(3.84)；IR(KBr)ν_max cm^-1：3536，3414，3255，3047，2934，2887，2864，2800，2767，2738，1641，1472，1440，1332，1281，1127，1087，701；¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)δppm：5.87(1H，dm，J＝10.5Hz，H-12)，5.77(1H，dm，J＝10.5Hz，H-13)，4.48(1H，dd，J＝10.5，4.2Hz，H-11)，4.45(1H，dd，J＝12.5，4.4Hz，H-17α)，3.12(1H，t，J＝12.5Hz，H-17β)，2.94(2H，m，H-14α，14β)，2.79～2.87(2H，m，H-2β，10β)，2.13(1H，br s，H-10α)，1.94～2.03(3H，m)，1.69～1.78(4H，m)，1.35～1.60(5H，m)；¹³C-NMR(CDCl₃，75MHz)δppm：(表2)；EI-MS m/z(％)：247(16)，246([M]⁺，100)，245(70)，218(5)，217(11)，204(19)，203(53)，177(5)，160(11)，159(13)，150(22)，148(12)，137(10)，136(17)，122(12)，109(5)，98(9)，96(31)，80(13)，67(12)，41(16)；ESI-MSm/z：247.3([M+H]⁺)，269.2([M+Na]⁺)。

其中，(-)-13，14-去氢槐定碱((-)-13，14-dehydrosophoridine)(9)C₁₅H₂₂N₂O(246)，白色片晶(石油醚)，m.p.83-84℃，[α]²⁴ _D-39.0°(c 0.10，MeOH)。UV(MeOH)λ_max(logε)nm：256(3.18)，206(3.78)；IR(KBr)ν_max cm^-1：3452，3244，3047，2961，2928，2879，2860，2820，2756，1660，1594，1448，1125，1111，824；¹H-NMR(CDCl₃，500MHz)δppm：6.44(1H，dt，J＝9.7，4.8Hz，H-13)，5.94(1H，d，J＝9.7Hz，H-14)，3.74(1H，dd，J＝12.3，4.7Hz，H-17β)，3.57(1H，dd，J＝16.4，9.8Hz，H-11)，3.18(1H，t，J＝12.3Hz，H-17α)，2.88(1H，br d，J＝11.9Hz，H-2β)，2.79(1H，m，H-10β)，2.55(1H，dt，J＝17.7，5.7Hz，H-6)，2.19(4H，m)，2.06(1H，t，J＝9.8Hz)，1.99(1H，m)，1.85(3H，m)，1.70(1H，m)，1.48～1.61(4H，m)，1.12(1H，m)；¹H-NMR(C₆D₆，500MHz)δppm：6.10(1H，d，J＝9.8Hz，H-14)，5.84(1H，ddd，J＝9.8，4.8，3.7Hz，H-13)，3.74(1H，dd，J＝13.0，5.3Hz，H-17β)，3.29(1H，dd，J＝13.0，11.7Hz，H-17α)，3.09(1H，dt，J＝9.9，6.5Hz，H-11)，2.62(1H，dt，J＝11.4，2.0Hz)，2.50(1H，m)，1.90(3H，m)，1.71(1H，t，J＝10.3Hz)，1.64(1H，m)，1.42～1.57(5H，m)，1.25(3H，m)，0.99(1H，m)，0.82(1H，m)；¹³C-NMR(CDCl₃，125MHz)δppm：(表2)；EI-MS m/z(％)：247(13)，246([M]⁺，78)，245(100)，217(7)，203(12)，178(13)，177(95)，160(7)，150(41)，148(12)，138(18)，137(8)，136(21)，122(12)，110(7)，109(5)，98(7)，96(44)，80(6)，68(13)，55(5)，41(12)。

其中，(-)-9α-羟基槐果碱((-)-9α-hydroxysophocarpine)(10)C₁₅H₂₂N₂O₂(262)，白色细针晶(丙酮)，m.p.120-121℃，[α]²⁴ _D-48.3°(c 0.10，MeOH)。UV(MeOH)λ_max(logε)nm：259(3.40)，207(4.02)；IR(KBr)ν_max cm^-1：3251，2932，2882，2844，2810，2767，1659，1588，1473，1433，1299，1275，1133，1073，1056，822；¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)δppm：6.47(1H，dt，J＝9.8Hz，H-13)，5.90(1H，d，J＝9.8Hz，H-14)，4.14(1H，dd，J＝13.0，4.5Hz，H-17α)，3.83(2H，m，H-9β，11)，3.10(1H，t，J＝13.0Hz，H-17β)，3.05(1H，br d，H-10β)，2.84(1H，br d，H-2β)，2.67(1H，dt，J＝18.0，5.2Hz，H-12α)，2.26(1H，m)，1.69～2.13(8H，m)，1.44～1.57(2H，m)，1.34(1H，m)；¹³C-NMR(CDCl₃，125MHz)δppm：(表2)；EI-MS m/s(％)：262([M]⁺，77)，261(100)，245(12)，233(5)，219(6)，217(10)，203(25)，193(19)，166(30)，154(19)，153(6)，152(11)，136(15)，122(9)，114(6)，112(14)，110(18)，109(8)，98(3)，96(37)，92(2)，68(23)，41(24)。

其中，(+)-12α-羟基槐果碱((+)-12α-hydroxysophocarpine)(11)C₁₅H₂₂N₂O₂(262)，白色片晶(丙酮-石油醚)，m.p.90-92℃，[α]²⁴ _D+137.3°(c0.10，MeOH)。UV(MeOH)λ_max(logε)nm：258(3.37)，206(3.86)；IR(KBr)ν_max cm^-1：3419，3311，2931，2891，2870，2833，2811，2783，1665，1598，1446，1354，1340，1295，1097，1057，823；¹H-NMR(CDC1₃，500MHz)δppm：6.74(1H，dd，J＝9.6，6.0Hz，H-13)，5.99(1H，d，J＝9.6 Hz，H-14)，4.17(1H，m，H-12β)，3.98(1H，dd，J＝13.2，4.6Hz，H-17α)，3.73(1H，br d，J＝10.4Hz，H-11)，3.22(1H，t，J＝13.2Hz，H-17β)，2.84(1H，br d，J＝10.8Hz，H-2β)，2.80(1H，br d，J＝10.9Hz，H-10β)，2.29(1H，br d，J＝11.0Hz，H-7)，2.13(1H，br s，H-6)，1.94～2.00(3H，m，H-2α，8β，10α)，1.78(3H，m，H-3β，5，9β)，1.62(3H，m，H-4α，4β，8α)，1.48(2H，m，H-3α，9α)；¹³C-NMR(CDCl₃，125MHz)δppm：(表2)；EI-MS m/z(％)：262([M]⁺，1)，261(2)，246(20)，245(100)，244(8)，243(3)，215(1)，177(4)，160(1)，150(5)，149(2)，148(4)，138(2)，137(1)，136(5)，134(2)，122(3)，109(1)，98(1)，96(9)，94(2)，84(2)，80(2)，68(3)，55(3)，41(4)；HRESIMS m/z263.1761([M+H]⁺，calcd for C₁₅H₂₃N₂O₂，263.1760)。晶体数据：分子式为C₁₅H₂₄N₂O₃，分子量280.36。供试晶体呈白色透明板块状结晶，衍射实验用晶体大小为0.15×0.10×0.04mm，属斜方晶系，空间群为P2₁2₁2₁。晶胞参数：α＝7.936(3)_，α＝90°，b＝12.128(4)_，β＝90°，c＝14.834(5)_，γ＝90°，晶胞体积V＝1427.7(8)_³，晶胞内分子数Z＝4，计算密度Dx＝1.304mg/m³。MoKα(λ＝0.71073_)，F(000)＝608，T＝298(2)K。

表2是化合物1-11的碳谱(¹³C-NMR)数据(δin ppm)。

表2

Carbon	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	17
Carbon	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	17	1^2^_3^4^_5^#6^7^8^9^#10^11^#	56.757.0757.356.955.957.069.257.256.157.157.4	20.621.021.122.524.620.817.2421.223.820.721.2	37.027.627.836.927.527.326.327.828.727.727.7	68.335.134.768.639.034.833.635.832.234.133.5	68.563.363.668.270.862.767.064.063.362.562.7	37.343.841.635.646.144.140.744.439.642.334.7	26.925.826.626.226.835.724.926.821.935.826.3	22.620.620.820.524.663.117.221.021.663.121.0	57.057.1257.356.656.564.669.457.350.764.657.3	53.453.851.551.760.253.751.654.753.552.254.7	26.125.027.426.928.327.728.9122.529.927.360.9	18.927.2137.4137.919.418.9137.0123.6136.9137.2138.7	32.967.9124.7124.432.832.8125.131.8125.1124.6126.6	171.4171.8165.7167.2169.2169.3166.3166.0164.4165.4165.8	46.841.842.147.446.241.442.741.645.442.041.0

^*：in CDCl₃，100MHz：#：in CDCl₃，125MHz：_：in CDCl₃，75MHz

本发明所述的喹诺里西啶类生物碱经药理试验，结果证明具有显著的抗HBV作用，且有效浓度低，细胞毒性较小(表3)。所测生物碱对HBsAg和HBeAg均显示一定的抑制作用，且对HBsAg的作用高于HBeAg。其中槐花醇、槐果碱、氧化槐果碱、莱蔓碱、9α-羟基苦参碱、13，14-去氢槐定碱和12α-羟基槐果碱在0.2μmol/mL时对HBsAg的抑制率高于阳性对照拉米呋啶(1.0μmol/mL时抑制率为29.6％)，其中槐果碱、莱蔓碱、13，14-去氢槐定碱抑制作用较明显，在0.2μmol/mL时抑制率均大于50％。槐果碱在0.2μmol/mL时对HBeAg亦有一定的抑制作用，抑制率为34.6％，和拉米呋啶相当(1.0μmol/mL时为35.4％)。另外，槐果碱、氧化槐果碱、莱蔓碱和13，14-去氢槐定碱对HBsAg和HBeAg的抑制率均较目前临床用于治疗乙肝疾病的药物苦参碱和氧化苦参碱的相应抑制率高。

本发明所述的化合物喹诺里西啶类生物碱，可进一步作为活性成分，制成治疗乙肝疾病的药物。

附图说明：

图1是山豆根生物碱部位提取分离流程图。

图2是苦参生物碱部位提取分离流程图。

具体实施方式

实施例1 制备山豆根生物碱

山豆根粗粉9kg，用1％硫酸(v/v)室温冷浸(15L×4次)至酸水液不呈生物碱反应，合并酸水提取液，经Na₂CO₃碱化至pH10～11后以氯仿等体积多次萃取完全，减压回收氯仿得总提取物135g，再经酸-碱法如上处理净化总碱得浸膏120g(提取率1.33％)。总碱浸膏120g干法上样进行硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯-乙醇-氨水梯度洗脱，所得流分以不同洗脱剂进行反复硅胶柱层析，分离得到化合物1-4。

实施例2制备苦参生物碱

苦参粗粉14kg，用1％硫酸(v/v)室温冷浸(24L×4次)至酸水液不呈生物碱反应，合并酸水提取液，经Na₂CO₃碱化至pH10～11后以氯仿等体积多次萃取完全，减压回收氯仿得总提取物280g，再经酸-碱法如上处理净化总碱得浸膏250g(提取率1.8％)。总碱浸膏240g用少量氯仿(约200mL)溶解，加入10倍量体积的乙醚(2L)，轻轻摇晃2min，静置后析出淡黄色的颗粒状结晶。抽滤，滤液浓缩后再如上反复操作4次，合并粗晶(A)共70g，滤液浓缩得浸膏(B)165g。取粗晶(A)1.2g，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-氨水(10∶2∶1∶0.1)进行硅胶柱层析，得到化合物7。将浸膏(B)150g干法上样进行硅胶柱层析，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-氨水梯度洗脱，所得流分以不同的洗脱剂进行反复的硅胶柱层析和薄层色谱制备，分离得到化合物3，5，6，8-11。

实施例3 体外抗HBV试验

应用Hep G2的2.2.15细胞株(教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海)，以每孔10×10⁵个细胞接种于24孔板，培养基为DMEM，生长液含10％胎牛血清，380μg/ml G418，0.03％谷胺酰胺，青霉素、链霉素各100μg/ml，在5％CO₂孵箱中37℃培养，48小时后，换成二甲基亚砜助溶的含药物的培养液，每种药物设3～5个浓度，每个浓度设4个平行孔，继续培养9天(每3天换液一次)，收集上清液用ELISA检测HBsAg及HBeAg含量。同样条件下以不含药物的培养液上清液作为对照组。同时用上述细胞株，用MTT法测定药物的细胞毒性。阳性对照为拉米呋啶(3TC)、苦参碱和氧化苦参碱。结果证实本发明化合物具有显著的抗HBV作用，且有效浓度低，细胞毒性较小。

表3是喹诺里西啶类生物碱对HepG2 2.2.15细胞的毒性情况及对HBsAg和HBeAg的抑制效果。

表3

药物	浓度(μmol/mL)	细胞毒性	HBsAg抑制率(％)	HBeAg抑制率(％)
药物	浓度(μmol/mL)	细胞毒性	HBsAg抑制率(％)	HBeAg抑制率(％)	别苦参碱(5)	0.40.20.1	+--	/27.725.1	/10.89.6

(续表3)

药物	浓度(μmol/mL)	细胞毒性	HBsAg抑制率(％)	HBeAg抑制率(％)
药物	浓度(μmol/mL)	细胞毒性	HBsAg抑制率(％)	HBeAg抑制率(％)	槐花醇(1)9α-羟基苦参碱(6)14β-羟基苦参碱(2)	0.40.20.10.40.20.10.8	+--+--+	/31.121.7/31.618.1/	/26.322.1/19.513.3/

槐果碱(3)氧化槐果碱(7)莱蔓碱(8)13，14-去氢槐定碱(9)5α-羟基槐果碱(4)

0.40.20.40.20.10.40.20.10.40.20.11.60.80.40.20.10.80.40.2

--+--+--+--+----+--

28.926.9/57.221.6/48.339.9/52.625.1/79.378.263.417.9/28.510.4

1.30/34.631.4/24.622.4/25.422.6/27.622.46.80/00

(续表3)

药物	浓度(μmol/mL)	细胞毒性	HBsAg抑制率(％)	HBeAg抑制率(％)
药物	浓度(μmol/mL)	细胞毒性	HBsAg抑制率(％)	HBeAg抑制率(％)	9α-羟基槐果碱(10)12α-羟基槐果碱(11)	0.40.20.10.40.20.10.40.2	+--+----	/24.50/40.828.016.20	/5.70/4.6000

苦参碱氧化苫参碱3TC

0.40.20.10.40.20.11.0

+--+---

/30.98.9/39.735.329.6

/2.70/17.115.835.4

-：“未见明显毒性”系指用MTT法检测细胞存活率≥75％；+：“显示毒性”指细胞存活率＜75％。

Claims

1、喹诺里西啶类生物碱在制备抗乙肝病毒药物中的用途。

2、按权利要求1所述的用途，其中所述的喹诺里西啶类生物碱具有式I的化学结构：

其中各取代基及化合物1-11如表1，

表1 化合物 R₁ R₂ R₃ R₄ R₅ X C₁₂-C₁₃ C₁₃-C₁₄ 1234567891011 α-OHα-Hα-Hα-OHα-Hα-Hα-Hα-Hβ-Hα-Hα-H α-Hα-Hα-Hα-Hβ-Hα-Hα-Hα-Hα-Hα-Hα-H HHHHHOHHHHOHH HHHHHHHHHHOH HOHHHHHHHHHH 孤对电子孤对电子孤对电子孤对电子孤对电子孤对电子O孤对电子孤对电子孤对电子孤对电子单键单键单键单键单键单键单键双键单键单键单键单键单键双键双键单键单键双键单键双键双键双键

3、按权利要求1所述的用途，其中所述的喹诺里西啶类生物碱是化合物槐果碱。

4、按权利要求1所述的用途，其中所述的喹诺里西啶类生物碱是化合物氧化槐果碱。

5、按权利要求1所述的用途，其中所述的喹诺里西啶类生物碱是化合物莱蔓碱。

6、按权利要求1所述的用途，其中所述的喹诺里西啶类生物碱是化合物13，14-去氢槐定碱。