CN1278679C - 阿魏酸松柏酯在制备抗癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及川芎中抗癌活性成份的研发，具体地说是阿魏酸松柏酯在抗癌药物中的应用。本发明的优点如下：本发明首次从传统中药——川芎中分离纯化出阿魏酸松柏酯，为以中药有效成分为基础的新药设计提供新的先导化合物；建立了该化合物的液相色谱分离纯化方法，操作简便易行、重复性好，条件温和，非常适用于化学稳定性差的中药有效成分的制备；为以中药为基础的新抗癌药物开发及产业化打下基础。
Description
技术领域
本发明涉及川芎中抗癌活性成份的研发，具体地说是阿魏酸松柏酯在制备抗癌药物中的应用。
背景技术
由于中药是祖国医药学的宝贵遗产，迄今已有数千年的临床实践，并形成了系统的传统中医理论体系，在我国有着极其广泛的应用基础。以中药为本开发新药具有目标明确、毒副作用小、原料来源多等有利因素。
川芎Rhizoma Chuanxiong为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根茎，具有行气活血，祛风止痛之功效，为活血化瘀常用中药。据报道其含有内酯类、生物碱、有机酸类或酚类、以及中性油类等多种有效成分。目前报道的关于川芎有效成分的主要药理作用有：川芎嗪有增加冠脉流量，降低冠脉阻力，促进动脉微循环，对血小板凝聚有解聚作用；川芎浸膏能抑制小肠收缩和妊娠都子宫的收缩，生物碱、阿魏酸、川芎内酯有解痉作用；水煎剂能够抑制咖啡因的兴奋作用；川芎挥发油有镇静作用；川芎提取物对细菌及真菌有抑制作用；含有川芎的复方可用于辅助肿瘤治疗[文献1.阎德海.CN 09337A，1995抗肿瘤中药调节复元汤；文献2.沈汉澄.CN 1092972C，2002一种抗肿瘤及抗癌转移的药物；文献3.赵金华，赵耘，姚倩等.CN 1362064A，2002一种抗肿瘤组合物及其制备方法和用途；文献4.徐修礼，张建芳，刘宝瑞等.肿瘤.22(2)，107-108，2002川芎素对大肠癌细胞moser的影响及其与化疗药物的协同作用]。
到目前为止，有关川芎有效成分能够抑制肿瘤细胞的报道只有川芎嗪[文献5.张春玲，肖伟，王英年.中华实用医学.4(9)，26-29，2002黄芪、川芎嗪对肠癌患者阳PMBC分泌IL-4、IL-6的调节作用；文献6.林洪生，李树奇，裴迎霞等.中国新药杂志.8(6)，384-386，1999川芎嗪、苦参碱对癌细胞与内皮细胞粘附及粘附因子表达的影响；文献7.林洪生，李树奇，朴炳奎等.中国肿瘤.8(12)，574-576，1999三参冲剂对肺癌转移中内皮细胞及粘附因子的影响；文献8.崔巍，徐世杰，藤静茹等.中国中医基础医学杂志.3(1)，27-28，31，1997活血化瘀中药抑制肿瘤细胞——血小板聚集的实验研究]，但是川芎嗪在川芎中的含量极低，同时川芎嗪易升华，因此从川芎中提取川芎嗪用于抗肿瘤研究未见报道。
发明内容
本发明的目的在于为以中药有效成分为基础的新药设计提供新的先导化合物—即研发松柏醇阿魏酸酯在制备抗癌药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
通过色谱分离技术并结合体外药理学实验方法，从传统中药——川芎中筛选出具有生理活性的有效成分—阿魏酸松柏酯。
本发明采用制备级色谱从川芎中分离纯化出一种酯类化合物，并通过液相色谱与质谱联用、气相色谱与质谱联用、红外光谱、紫外光谱、核磁共振对该化合物进行了结构鉴定。在抗肿瘤的MTT实验中发现该化合物具有抑制肿瘤细胞生长的生理活性。
具体为：从传统中药——川芎中制备3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯，及其结构鉴定；
称量一定量的川芎粉末置入烧瓶内，加入无水乙醇加热回流，经过滤得到提取液，挥发掉提取液中溶剂得膏状物；在一定淋洗条件下(以乙腈/水为流动相)，以装有C18 SPE(固相萃取)柱分离上述提取物，收集洗脱的馏分；经液质联用分析后，将含有3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯馏分挥发掉溶剂得膏状物。以制备型HPLCC18柱纯化经初步提纯的膏状物，收集3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯的峰。经减压蒸馏挥发掉溶剂，得到纯度在98％以上的纯品。最终由RP-HPLC、紫外光谱、质谱、红外光谱进行结构鉴定，分子式为C20H20O6结构式如下(也称阿魏酸松柏酯)：
本发明具有如下优点：
1.为以中药有效成分为基础的新药设计提供新的先导化合物。本发明首次从传统中药——川芎中分离纯化出一种酯类的化合物——3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯，也称为阿魏酸松柏酯。
2.建立了该化合物的液相色谱分离纯化方法，操作简便易行。采用本发明中的制备方法，可以比较快捷地分离、纯化出3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯，纯度在98％以上。同时由于采用HPLC技术，本方法还具有重复性好，条件温和，非常适用于化学稳定性差的中药有效成分的制备。
3.本发明应用的化合物具有一定的抗肿瘤细胞(宫颈癌Hela细胞)的活性，且无毒副作用。由于目前的抗肿瘤药物普遍存在着明显的毒副作用，而该化合物来源于常用的中药，因此更具有进行结构改造和研究的价值，为以中药为基础的新抗癌药物开发及产业化打下基础。
具体实施方式
实施例1
称量经粉碎(35目)川芎粉末120g置入烧瓶内，加入700mL无水乙醇，浸泡30min，加热回流1h，过滤(0.5μm)制备提取液。减压蒸馏挥发掉提取液中溶剂得膏状物。以装有30g的40μm C18填料的SPE柱分离上述提取物，分别用30/70，50/50(v/v)的乙腈/水溶液和纯乙腈淋洗，收集洗脱的馏分。经液质联用分析，3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯在50％乙腈溶液洗脱的馏分中。减压蒸馏挥发掉溶剂得膏状物。以制备型HPLCC18柱纯化上述初步提纯的膏状物，流动相为37/63(v/v)的乙腈/水溶液，收集3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯的峰。经减压蒸馏挥发掉溶剂，得到纯度在98％以上的纯品。对宫颈癌Hela细胞的抑制率为50％时的浓度约为3.7μg/μL。
在本发明中，也可以用其他溶剂对川芎进行提取，诸如：甲醇、95％乙醇、水等，但是经过实验乙醇在浸出3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯的效率高于其他溶剂。
应用例
体外MTT(四唑盐)法测量3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯对宫颈癌Hela细胞的抑制率；
取90mg阿魏酸松柏酯溶于250μL无水乙醇中，加入250μLPBS稀释，分别加入4、6、8、10、12μL至培养宫颈癌Hela细胞的96孔板中(平行测定8孔)。培养后，利用ELISA检测仪在570nm测定光密度；抑制率分别为47.7％、79.4％、79.4％、82.1％、83.2％。实验结果表明3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯有一定的抗肿瘤活性。
MTT的检测方法
1以每孔103---104密度接种细胞于96孔板上。
2细胞培养结束后，每孔加入MTT(5mg/ml)，37℃孵育3-4小时，终止培养，小心吸弃上清液。每孔加入0.1-.0.2mlDMSO，振荡10分钟，使结晶物溶解。
3比色用酶联免疫检测仪在570nm处测定其吸收度。
Claims (6)
1.阿魏酸松柏酯在制备抗癌药物中的应用，其特征在于：所述抗癌药物为抗宫颈癌药物。
2.按照权利要求1所述阿魏酸松柏酯在制备抗癌药物中的应用，其特征在于：所述的阿魏酸松柏酯是从川芎中分离获取的。
3.按照权利要求2所述阿魏酸松柏酯在制备抗癌药物中的应用，其特征在于：所述阿魏酸松柏酯的分离获取过程如下，
川芎粉末置于溶液中加热回流，过滤得到提取液，挥发掉提取液中溶剂得膏状物；在乙腈/水为流动相的淋洗条件下，以装有C18 SPE柱分离上述提取物，收集洗脱的馏分；通过液相色谱与质谱联用分析后，将含有3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯馏分挥发掉溶剂得膏状物；以制备型HPLC C18柱纯化经初步提纯的膏状物，收集3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯的峰，经减压蒸馏挥发掉溶剂，得到产品。
4.按照权利要求3所述阿魏酸松柏酯在制备抗癌药物中的应用，其特征在于：所述溶液为甲醇、95％乙醇、乙醇或水。
5.按照权利要求3所述阿魏酸松柏酯在制备抗癌药物中的应用，其特征在于：所述溶液为乙醇。
6.按照权利要求3所述阿魏酸松柏酯在制备抗癌药物中的应用，其特征在于：所述乙腈/水的体积比例为30～100∶0～70。
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