CN1537849A - 羟基茋类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有C28H22O8的羟基芪类化合物及其类似物的制备和抗病毒活性，特别是涉及式(I)的ScirpusinA(R1＝OH，R2＝H)和ScirpusinB(R1＝R2＝OH)的制备和抗HIV、抗HBV活性以及(－)－ε－viniferin(R1＝R2＝H)和CararosinE(R1＝R2＝OH)的制备和抗HBV活性。本发明还涉及这些化合物的制剂及在治疗病毒性疾病方面的用涂。

Description

羟基茋类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属中药制药领域，涉及羟基茋类化合物及其制备方法和抗病毒活性的应用，特别是化合物Scirpusin A、Scirpus in B、(-)-ε-viniferin和Cararosinol E的制备和抗HIV、HBV活性，以及在制备抗病毒药物中的应用。
背景技术
老的病毒性疾病如传染性肝炎、流行性感冒的迅速蔓延，新的病毒性疾病如艾滋病、SARS、EboLa的不断暴发，正严重威胁人类的健康和生存。而许多病毒性疾病由于其特殊的传染途径和病毒的变异，已引起国内外医药研究人员的密切关注，纷纷投入寻找更加有效的预防疫苗和治疗药物研究。有报导，在蔗草属(Scirpus sp.)、山扁豆属(Cassia sp.)和白千层属(Melaleuca sp.)、马鞍树属(Maackiasp.)等植物中，存在羟基茋类化合物成分，具有抑制5-脂氧化酶和蛋白激酶C(PKC)等作用，可作为抗过敏、抗炎、抗肿瘤药物。分布于中国西北、华北地区的豆科锦鸡儿属植物，民间用于治疗虚损劳热，阴虚喘咳等症。已知含化学成分包括甾醇类、苯丙素类、黄酮类、三萜类等。
发明内容
本发明的目的是提供新的抗病毒活性物质，具体涉及抗艾滋病病毒(HIV)和乙肝病毒(HBV)的活性物质及其进一步制备抗病毒药物，特别涉及羟基茋类化合物的制备和抗HIV、HBV活性，以及在制备抗病毒药物中的应用。
本发明根据多年的中医临床用药经验和“祛邪扶正”原则，应用现代药理筛选方法，对植物药中抑制艾滋病病毒(HIV)和乙肝病毒(HBV)的活性物质进行研究，从豆科锦鸡儿属(Caragana sp.)中提取羟基茋类化合物并证实其抗病毒活性。
本发明涉及的羟基茋类化合物包括Scirpusin A、Scirpusin B、(-)-ε-viniferin和Cararosinol E。
本发明从豆科锦鸡儿属植物红花锦鸡儿(Caragana rosea)和锦鸡儿(Caragana sinica)乙酸乙酯可溶部分提取活性羟基茋类化合物。
本发明的活性羟基茋类化合物具有如下式I的化学结构：
其中：R1＝H     R2＝H    7b＝E    (-)-ε-viniferin
      R1＝OH    R2＝H    7b＝E    Scirpusin A
      R1＝OH    R2＝OH   7b＝E    Scirpusin B
      R1＝OH    R2＝H    7b＝Z    Cararosinol E
取红花锦鸡儿的干燥全株，粉碎后用乙醇回流提取，提取浸膏悬浮于水中，分别用石油醚或环己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取。其中乙酸乙酯可溶部分约占药材干重的千分之一至千分之十。该部位再经硅胶正相和反相柱层析，聚酰胺或凝胶层析，可分别获得化合物Scirpusin A、B和Cararosinol E。
化合物Cararosinol E为浅棕色无定形粉末，[α]D 23+3.5°(MeOH，C 0.23)。具有以下1H-NMR光谱(400MHz，(CD3)2CO)：δ6.73(2a-H)，6.75(5a-H)，6.53(6a-H)，5.21(7a-H)3.99(8a-H)，6.03(10a，14a-H)，6.17(12a-H)，6.98(2b，6b-H)，6.63(2b，5b-H)，6.20(7b-H，J＝12.2)，5.97(8b-H，J＝12.2)，6.25(12b-H)，6.27(14b-H)。
化合物Scirpusin A，[α]D 23+12.8°(MeOH，C 0.25)。具有以下1H-NMR光谱(400MHz，(CD3)2CO)：δ6.82(2a-H)，6.79(5a-H)，6.67(6a-H)，5.34(7a-H)，4.42(8a-H)，6.20(10a-H)，6.20(12a-H)，6.20(14a-H)，7.15(2b，6b-H)，6.72(3b，5b-H)，6.89(7b-H，J＝16.4)，6.89(8b，J＝16.4)，6.31(12b-H)，6.70(14b-H)。
化合物Scirpusin B，[α]D 23+3.17°(MeOH，C 0.63)。具有以下1H-NMR光谱(400MHz，(CD3)2CO)：δ6.82(2a-H)，6.79(5a-H)，6.66(6a-H)，5.34(7a-H，J＝16.4)，4.41(8a-H，J＝16.4)，6.22(10a-H)，6.22(12a-H)，6.22(14a-H)，6.87(2b-H)，6.70(5b-H)，6.68(6b-H)，6.82(7b-H)，6.67(8b-H)，6.30(12b-H)，6.69(14b-H)。
锦鸡儿(Caragana sinica)系豆科锦鸡儿属植物。在中国大多数省区有分布，其根入药又名金雀根，具有清肺益脾、活血通脉的功效，民间主要用于治疗虚损劳热、高血压、妇女白带、关节痛风、跌打损伤等。所含化学成分主要为茋类和异黄酮类。锦鸡儿地上部分95％乙醇回流提取，所得浸膏用石油醚、乙酸乙酯分别萃取。乙酸乙酯可溶部位含有丰富的茋类化合物，经过硅胶反复柱层析，氯仿—甲醇和石油醚—乙酸乙酯洗脱，再经Sephadex LH-20层析，氯仿—甲醇洗脱，得到(-)-ε-viniferin。
(-)-ε-viniferin，[α]D 23+26.8°(MeOH，C 0.40)。具有以下1H-NMR光谱(400MHz，(CD3)2CO)：δ7.20(2a，6a-H)，6.83(3a，5a-H)，5.42(7a-H)，4.46(8a-H)，6.24(10a-H)，6.24(12a-H)，6.24(14a-H)，7.16(2b，6b-H)，6.73(3b，5b-H)，6.91(7b-H，J＝16.4)，6.7C(8b-H，J＝16.4)，6.33(12b-H)，6.72(14b-H)。
上述化合物经药理试验，结果表明羟基茋类化合物具有抗艾滋病病毒和乙肝病毒的作用，且细胞毒性小。
本发明可取上述化合物Cararosinol E、Scirpusin A、ScirpusinB和(-)-ε-viniferin为原料，任一或任意二种或以上组合物组成配方，添加适量微晶纤维素、淀粉或其他赋形剂，按常规方法分别制成胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、丸剂等内服剂型，或注射剂、软膏等非口服剂。通常成人用量为所列化合物20~500mg，一日分数次给药。
附图说明
图1是抗HIV试验结果。
图2是抗HIV试验结果。
图3是抗HIV活性试验结果。
图4是细胞毒试验结果。
图5是细胞毒试验结果。
具体实施方式
实施例1
取红花锦鸡儿地上部分5kg，粉碎后，以95％EtOH回流提取，回流2~3次，每次1~2小时。提取液合并，减压浓缩得浸膏450g。以环己烷、氯仿、乙酸乙酯对该浸膏的水混悬液依次萃取，得到乙酸乙酯部分45g。乙酸乙酯部分硅胶柱层析，以氯仿—甲醇为洗脱剂，逐步增加甲醇的比例，收集氯仿—甲醇为4∶1时的洗脱流份。用硅胶进一步分离，以环己烷—乙酸乙酯(1∶4)为洗脱剂。得到两个主要流份A和B。流份A以反相硅胶(RP-18)，以乙醇—水(3∶2)洗脱，主要流份通过聚酰胺柱进一步分离，洗脱剂为乙醇—水(3∶2)，先后得到两个淡棕色无定形粉末Cararosinol E 60mg和Scirpusin A76mg。流份B通过聚酰胺柱层析，乙醇—水(3∶2)洗脱，合并主要流份，得到另一淡黄色无定形粉末30mg，为化合物Scirpusin B。
实施例2
取红花锦鸡儿干燥全株5kg，粉碎后，以环己烷脱脂，然后以甲醇热提，得到400g浸膏，该浸膏以乙酸乙酯萃取，萃取物分别以氯仿—甲醇(4∶1)和环己烷—乙酸乙酯(1∶4)溶剂系统进行层析，得到两个主要流份C和D。对流份C和D的后续操作分别与实施例1中对流份A和B的操作方法相同。分别从流份C和流份D中分离得到化合物Cararosinol E 50mg、Scirpusin A 71mg和Scirpus in B 28mg。
实施例3
取红花锦鸡儿地上部分5kg，粉碎后，以95％EtOH回流提取，提取物在石油醚和90％的甲醇中进行分配，充分静置，分成上下两层溶液，下层转移，以乙酸乙酯萃取，得到280g浸膏。先后以氯仿—甲醇(4∶1)和环己烷—乙酸乙酯(1∶4)溶剂系统进行层析，得到两个主要流份E和F。对流份E和F的后续操作分别与实施例1中对流份A和B的操作方法相同。分别从流份E和流份F中分离得到化合物Cararosinol E 60mg、Scirpusin A 70mg和Scirpusin B 30mg。
实施例4
取红花锦鸡儿干燥全株4kg，粉碎后用20倍重量的95％EtOH渗滤，渗滤所得到提取物通过大孔树脂HP-20，以水和逐渐递增的甲醇水洗脱，得到A、B、C、D四个部位，其中部位B，经过Sephadex LH-20氯仿—甲醇洗脱，再经制备硅胶薄层层析，分别获得Cararosinol E71mg、Scirpusin A 110mg和Scirpusin B 57mg。
实施例5
按实施例4方法，从4kg药材中获得相应的Sephadex LH-20洗脱部位，用反相硅胶ODS半制备柱，乙腈∶甲醇∶水洗脱，分别得到Cararosinol E 74mg、Scirpusin A 104mg和Scirpusin B 47mg。
实施例6
锦鸡儿(Caragana sinica)地上部分20kg干燥后粉碎，95％乙醇回流提取，浸膏悬浮于水中，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分上硅胶柱层析，用石油醚—乙酸乙酯和氯仿—甲醇洗脱，粗品再上Sephadex LH-20柱，氯仿—甲醇洗脱得到(-)-ε-viniferin32mg。
实施例7
锦鸡儿干燥根10kg，粉碎后用95％乙醇常温渗漉，收集100kg渗漉液，60℃以下减压浓缩至流浸膏。浸膏拌100~200目硅胶后，干燥常法上硅胶柱，以氯仿—丙酮洗脱，薄层检查，合并含(-)-ε-viniferin流份，再上硅胶柱和Sephadex LH-20柱，氯仿—甲醇洗脱得纯品47mg
实施例8
分别取Cararosinol E、Scirpusin A、Scirpusin B和(-)-ε-viniferin为原料，单一或任意二种或以上组合物组成处方，添加适量微晶纤维素、淀粉或其他赋形剂，按常规方法分别制成胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、丸剂等内服剂型，或注射剂、软膏等非口服剂。通常成人用量为所列化合物20~500mg，一日分数次给药。
下面用药理试验结果说明羟基茋类的抗病毒作用：
试验例1
应用MT-2细胞，生长培养液由培养基RPMI加L-谷氨酰胺、胎牛血清、庆大霉素组成。在96孔板上加入培养液。经过DMSO助溶并稀释的筛选样品，样品做8个稀释度，相互之间为2倍稀释，加上50μl稀释的HIV-IIIB病毒液，再加入MT-2细胞(细胞计数调节至2×105/ml左右)，在39℃二氧化碳培养箱中培养，至第6天做XTT法细胞染色，确定天然产物样品保护细胞的程度。结果表明本发明化合物能抑制病毒，并有保护宿主细胞的作用。
试验例2
筛选样品的细胞毒性试验，基本方法同试验1，将生长培养液50μl/孔，代替病毒稀释液50μl/孔。样品的起始浓度比筛选起始浓度大2-500倍。结果表明本发明化合物对病毒的抑制作用大于对细胞的毒性作用。
试验例3体外抗乙肝病毒(HBV)试验
应用Hep G2的2.2.15细胞株，以每孔10×105个细胞接种于24孔板，培养基为DMEM，生长液含4％胎牛血清，380μg/ml G418，0.03％谷胺酰胺，青霉素、链霉素各100μg/ml，在5％CO2孵箱中37℃培养，24小时后，换成二甲基亚砜助溶的含药物的培养液，每种药物设4个浓度，每个浓度设4个平行孔，培养5天后，取上清液进行ELISA检测HbsAg及HBeAg含量。同样条件下以不含药物的培养液上清作为对照组。同时用上述细胞株，用MTT法测定药物的细胞毒性。结果证实本发明化合物能抑制病毒，并有保护宿主细胞的作用。
表1是羟基茋类化合物抗HBV的效果。
表1
药物 浓度(μg/ml)HBsAg   HBeAg  细胞存活
Cararosinol E   6.25      36      24      9812.5      45      37      9225        57      38      8250        66      43      75
Scirpusin B   6.25      36      21      9412.5      42      24      8425        45      38      7250        73      70      61
(-)-ε-viniferin   6.25      14      15      5912.5      19      20      4525        33      24      3950        35      33      31
Scirpusin A   6.25      25      20      9512.5      31      28      8825        36      36      7550        45      44      60

Claims (9)

1、式I的羟基茋类化合物，
Figure A2003101080710002C1
其中：R1＝H     R2＝H     7b＝E     (-)-ε-viniferin
      R1＝OH    R2＝H     7b＝E     Scirpusin A
      R1＝OH    R2＝OH    7b＝E     Scirpusin B
      R1＝OH    R2＝H     7b＝Z     Cararosinol E
通过下述步骤制备：
①锦鸡儿或红花锦鸡儿的根、地上部分或全株用乙醇或甲醇提取；
②提取物的乙酸乙酯可溶部分经硅胶层析得羟基茋类化合物粗品；
③上述粗品经反相硅胶或聚酰胺或Sephadex LH-20层析，获得
(-)-ε-viniferin，scirpusin A、scirpusin B和Cararosinol E。
2、权利要求1所述的羟基茋类化合物，其中单一化合物作为原料制成胶囊、片剂、颗粒剂、丸剂和针剂。
3、权利要求1所述的羟基茋类化合物，其中任意二种或以上组合物作为原料制成胶囊、片剂、颗粒剂、丸剂和针剂。
4、权利要求1所述的羟基茋类化合物，其中单一化合物在制备抑制艾滋病病毒药物中的应用。
5、权利要求1所述的羟基茋类化合物，其中任意二种或以上组合物在制备抑制艾滋病病毒药物中的应用。
6、权利要求1所述的羟基茋类化合物，其中单一化合物在制备抑制乙肝病毒药物中的应用。
7、权利要求1所述羟基茋类化合物，其中任意二种或以上组合物在制备抑制乙肝病毒药物中的应用。
8、权利要求1所述的羟基茋类化合物，其中单一化合物在制备防治病毒性肝炎药物中的应用。
9、权利要求1所述羟基茋类化合物，其中任意二种或以上组合物在制备防治病毒性肝炎药物中的应用。
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