CN1813711A - 一种异黄酮类化合物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了从黄芪中提取有效成分毛蕊异黄酮－7－氧－β－D－吡喃葡萄糖苷(Calycosin 7－O－β－D－glucoside)，经药理试验证明该化合物具有抑制柯萨奇病毒(Coxsackievirus)及治疗病毒性心肌炎，可在制备抗柯萨奇病毒及治疗病毒性心肌炎药物中应用。

Description

一种异黄酮类化合物的用途
技术领域
本发明涉及从中药中提取有效成分，经药理试验证明对病毒性心肌炎治疗有效，更具体指从黄芪或其它中药中提取分离获得一种异黄酮类有效成分-----毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷(Calycosin 7-O-β-D-glucoside)，它可在制备抗柯萨奇病毒及治疗柯萨奇病毒引起的疾病的药物中应用。
背景技术
柯萨奇病毒(Coxsackievirus)可引起多种疾病，如病毒性心肌炎，流行性胸痛，无菌性脑炎、脑膜炎，克山病及病毒性癫痫等，严重危害人类健康。
目前，西医临床治疗病毒性心肌炎等柯萨奇病毒性疾病的主要方法是使用普通抗病毒药、免疫抑制剂、干扰素及心肌细胞营养剂等，但疗效并不理想。
近年来大量研究表明，中药在病毒性心肌炎等柯萨奇病毒性疾病的临床治疗中显示出很大优势，但目前大部分中药为医生自拟的处方汤药或复方粗提药物，如生脉饮、芪冬颐心口服液等，缺乏有效成分清楚，作用机理明确，疗效肯定，剂型先进，服用携带方便的中药制剂。
中药黄芪补气固表，利尿托毒。从黄芪中提取的黄芪皂苷等成分有多种药理活性。《第二军医大学学报，1999，20(9)：666-668》报道了黄芪皂苷对柯萨奇B3病毒性心肌炎小鼠具有良好的治疗效果；《中国中药杂志，2001，26(12)：850-853》报道，黄芪甲苷能对抗组胺引起的脑微血管通透性增加；《中国药理学通报，2003，19(8)：892-895》报道，黄芪总苷对体外激活肝星状细胞的增殖和产生胶原有明显抑制作用，这可能是其抗肝纤维化的机制之一；《天然产物研究与开发，1994，6(2)：1-5》报道，黄芪甲苷和毛蕊异黄酮对孵化红细胞的饿变形能力有改善作用，这可能是黄芪改善血液流变学指标的重要机理；专利CN01126608.2公开了毛蕊异黄酮及其糖甙具有良好的抗心肌缺血作用；专利CN00119451.8公开了黄芪甲苷在治疗病毒性心肌炎药物中的应用；专利CN01126609.0公开了黄芪甲苷具有抗心肌纤维化作用。未见毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷抗柯萨奇病毒(Coxsackie Virus)及治疗病毒性心肌炎的报道。
发明内容
本发明目的是克服常规多味汤药存在的不足之处，采用化学方法从黄芪或其它中药中分离出异黄酮类有效成分——毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，经药理试验，使该化合物在制备抗柯萨奇病毒和治疗病毒性心肌炎的药物中应用。
本发明药物可通过以下方法制备：黄芪或其它中药材粉碎后，以70％乙醇回流提取三次(2小时，1小时，1小时)，过滤，合并滤液，减压回收溶剂，浓缩至无醇味，得黄芪醇提浸膏I。浸膏I加水混溶过滤，滤液用大孔树脂吸附，用水洗脱杂质，再用70％乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩得浸膏II。浸膏II再用硅胶柱层析分离，以氯仿-甲醇梯度洗脱，合并相同流分，蒸干，甲醇热溶，静置，有白色絮状物析出，抽滤，得白色粉末状结晶，即得本发明化合物毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷(Calycosin 7-O-β-D-glucoside)。
结构式如下：
Figure A20051011064100041
它的分子式为C22H22O10，分子量为446，化学名为3′-羟基-4′-甲氧基异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷。
本发明采用上述方法提取获得的毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷首先进行药效试验。
在原代培养的心肌细胞上进行的体外抗病毒试验结果表明，本发明药物的TC50为177.84ug/ml，对CVB3病毒的IC50为17.78ug/ml，治疗指数(TI)为10.00，表明本发明药物体外对CVB3病毒有显著抑制作用。
在Balb/c小鼠上用腹腔接种柯萨奇B3病毒的方法建立病毒性心肌炎模型，给药高低剂量组分别灌胃给予本发明药物溶液40mg/kg和20mg/kg，模型对照组和正常对照组灌胃给等量生理盐水，连续给药12天，观察到第15天，观察小鼠毛色、进食、死亡等各种情况，结果两个剂量组均能显著降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的死亡率，显著降低病毒性心肌炎小鼠的心指数，有效降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠血清中LDH和GOT的含量升高。
注：试验方法参考《现代药理实验方法》(下册，P1425，张均田主编，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998年版)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但不对其有任何限制。
实施例1.本发明药物的制备
取黄芪药材，粉碎，以70％乙醇回流提取三次(2小时，1小时，1小时)，过滤，合并滤液，减压回收溶剂，浓缩至无醇味，得黄芪醇提浸膏I。浸膏I加水混溶过滤，滤液用大孔树脂(AB-8型)吸附，用水洗脱杂质，再用70％乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩得浸膏II。浸膏II用200-300目硅胶柱层析，以氯仿-甲醇梯度洗脱，TLC检测，10％硫酸-乙醇显色，合并相同流分，蒸干，甲醇热溶，静置，有白色絮状物析出，抽滤，得白色粉末状结晶，即得本发明化合物。实施例2：本发明药物对柯萨奇B3病毒(CVB3)感染心肌细胞的影响试验(体外)
细胞毒性试验：
取SD大鼠新生1-3天的乳鼠15只，取出心脏，做心肌细胞原代培养，所得细胞悬液在24孔培养板中培养24小时待其贴壁，24小时后弃去培养液。分组如下：
正常对照组：每孔加入培养液1.0ml；
给药组：加入梯度稀释的本发明药物溶液1.0mL/孔，每个稀释度四个复孔。
在倒置相差显微镜下观察细胞生存情况，按照Reed-Muench法计算本发明药物对原代培养心肌细胞的TC50。
抗柯萨奇B3病毒试验：
取SD大鼠新生1-3天的乳鼠15只，取出心脏，做心肌细胞原代培养，所得细胞悬液在24孔培养板中培养24小时待其贴壁，24小时后弃去培养液。分组如下：
正常对照组：每孔加入培养液1.0ml；
病毒对照组：每孔加入0.2ml CVB3病毒液(TCID50＝10-4.56，10-5稀释)，孵育1小时，弃去上清，用PBS溶液清晰三次，加入培养液1.0ml培养；
给药组：每孔加入0.2ml CVB3病毒液(TCID50＝10-4.56，10-5稀释)，孵育1小时，弃去上清，用PBS溶液清洗三次，加入梯度稀释的本发明药物溶液1.0mL/孔，每个稀释度四个复孔。
培养48小时后在倒置相差显微镜下观察。心肌细胞在培养中会慢慢死亡，伪足断裂，细胞皱缩、变圆，折光度提高。被病毒感染后细胞死亡明显增多，且可看到大面积坏死灶。给药后如药物有效，就可以降低被病毒感染细胞的死亡率。按照Reed-Muench法计算本发明药物对原代培养心肌细胞的IC50。
结果：本发明药物的TC50为177.84ug/ml，对CVB3病毒IC50为17.78ug/ml，治疗指数(TI)为10.00，表明本发明药物体外对CVB3病毒有显著抑制作用。
实施例3：本发明药物对病毒性心肌炎小鼠死亡率的影响试验(体内)
将本发明药物分成两个剂量组，Balb/c小鼠随机分为4组：
正常对照组：腹腔接种0.1ml生理盐水，每日给等量生理盐水；
病毒对照组：每只腹腔接种0.1mlCVB3病毒液(TCID50＝10-4.56，10-5稀释)，然后每日给等量生理盐水；
本发明药物组I-高剂量：同上法接种CVB3病毒液，同日灌胃本发明药物溶液40mg/kg·d，连续给药12天；
本发明药物组II-低剂量：同第3组方法，灌胃本发明药物溶液，剂量为20mg/kg·d，连续给药12天；
观察15天，观察小鼠毛色、进食等各种情况，统计各组小鼠的死亡率。
结果：本发明药物两个剂量组均能显著降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的死亡率，见表1。
表1 本发明药物对病毒性心肌炎小鼠发病率和死亡率的影响
  组别   动物数(只)   死亡率(例数)
  正常对照组   6   0(0)
  病毒对照组   15   40％(6)
  本发明药物组I   15   26.7％(4)*
  本发明药物组II   15   26.7％(4)*
注：采用卡方检验，给药组与病毒组比较，*有统计意义。
实施例4：本发明药物对病毒性心肌炎小鼠心指数的影响试验(体内)
Balb/c小鼠分组及给药剂量同实施例2。连续给药12天，观察到第15天，将所有小鼠全部解剖。在解剖前秤小鼠的体重，解剖后再秤取其心脏重量。
心指数＝心重/体重
当动物被病毒感染后，摄食量减少，体重降低，而心脏却因此膨大、发生纤维化而变重，所以可以用心指数来衡量心脏的病变程度，心指数越大，心脏病变越严重。
结果：本发明药物的两个剂量组均能显著降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的心指数，见表3。
表2 本发明药物对病毒性心肌炎小鼠心指数的影响
  组别   心指数(×10-3)
  正常对照组   4.14±0.59
  病毒对照组   5.60±0.73
  本发明药物组I   5.05±0.63*
  本发明药物II   5.14±0.58*
注：给药组与病毒组比较：*p＜0.05，**p＜0.01
实施例5：本发明药物对病毒性心肌炎小鼠血清中LDH和GOT含量的影响试验(体内)
Balb/c小鼠分组及给药剂量同实施例2。连续给药12天，观察到第15天，摘眼球取血，离心取血清，检测血清中乳酸脱氢酶(LDH)和谷草转氨酶(GOT)的含量。
谷草转氨酶和乳酸脱氢酶是心肌损伤的生化指标，在病毒性心肌炎急性阶段，二者释放升高，并且可以维持相当长时间。所以，药物若能有效降低心肌酶谱，就说明该药物有效降低了心脏病变程度。
结果：本发明药物的两个剂量组均能显著改善由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠血清中的LDH和GOT升高，结果见表3。
表3 本发明药物对病毒性心肌炎小鼠心脏表观病变程度的影响
  组别   LDH(单位/100ml)   GOT(卡门氏)
  正常对照组   314.08±57.64   21.46±4.49
  病毒对照组   496.05±55.63   25.93±5.29
  本发明药物组I   459.18±51.31*   21.65±5.00*
  本发明药物组II   461.22±52.51*   21.88±3.90*
注：给药组与病毒组比较：*p＜0.05，**p＜0.01

Claims (3)

1.一种结构式如下的
Figure A2005101106410002C1
从黄芪或其它植物药中提取分离的有效成分毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷的用途，在制备治疗柯萨奇病毒引起的疾病的药物中应用。
2.根据权利要求1所述的有效成分毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷的用途，其特征在于在制备治疗由柯萨奇病毒引起的包括病毒性心肌炎，流行性胸痛，无菌性脑炎、脑膜炎，克山病及病毒性癫痫等疾病的药物中应用。
3.根据权利要求1所述的有效成分毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷的用途，其特征在于在制备治疗病毒性心肌炎药物中应用。
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