CN102526157B - 红花提取物在预防或治疗神经退行性疾病中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了红花提取物在预防或治疗神经退行性疾病中的用途。本发明通过大量的实验发现，红花提取物具有显著的抗氧化应激作用，能够有效改善1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶诱导的慢性帕金森病C57小鼠的行为学表现，保护多巴胺能神经元形态的完整性。实验结果表明，红花提取物具有确切的预防或治疗神经退行性疾病的药理活性。

Description

红花提取物在预防或治疗神经退行性疾病中的用途
技术领域
本发明涉及红花提取物在治疗神经退行性疾病方面的一种新药理用途，尤其涉及红花提取物在预防或治疗帕金森病中的用途，属于红花提取物的医药用途领域。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)又名震颤麻痹，是一种常见的中老年人神经退行性疾病。PD的主要病理改变为黑质致密部(Substantia Nigral compacta，SNc)多巴胺(Dopamine，DA)能神经元的变性，当神经元变性到达一定阈值，开始出现症状，主要表现为静止性震颤、运动迟缓和肌肉强直，此外还有步态、姿势异常，认知障碍等症状。目前帕金森病发病机理尚不十分清楚，年龄老化、环境和遗传因素等均参与其中。
临床上对PD的治疗可以分为药物治疗和手术治疗，以药物治疗为主。手术治疗的应用范围较窄，以苍白球毁损术为代表的毁损手术，由于其远期疗效不佳并有可能带来不可预测的并发症，如吞咽、语言和平衡障碍，目前已基本淘汰。神经干细胞移植目前还处于实验阶段，脑深部电极刺激(deep brain stimulation，DBS)是治疗PD的最新进展，但手术后仍然要坚持药物治疗；而药物治疗基本上以缓解症状为主，尤以左旋多巴为最常用的治疗药物，但L-DOPA长期使用有许多严重副作用，如“开-关”现象、运动不能、精神障碍等，且仅为对症治疗，随着神经元变性的发展其效能逐渐减小。尽管新的腺苷A2A受体拮抗剂在PD治疗中的应用受到日益关注，但仍缺乏根治的药物。由于PD的病因复杂，社会危害大，随着高龄化社会的到来，研发高效低毒的新的治疗PD的新药显得必须而紧迫。中国是资源丰富的中药大国，近年来报道许多中药及其有效成分均有神经保护作用，研究这些中药及其有效成分，开发出能改善PD症状的新药将会有广阔的应用前景。
红花为菊科植物红花Carthamus tinctoriusL.的干燥管状花，性温，昧辛，具有活血通经、散瘀止痛、降低胆固醇、降血压等功效，临床上主要以水煎液入药。用于月经不调、痛经、经闭、跌打损伤，对冠心病、血管栓塞性疾病、脉管炎、传染性肝炎等疾病亦有一定的疗效。值得注意的是，尽管对于红花的研究众多，但一般将其用于改善心脑血管循环障碍疾病，未见有将其用于神经退行性疾病的用途。
发明内容
本发明涉及红花提取物的新用途。具体来说，就是红花提取物在神经退行性疾病方面的新用途，尤其是在预防或治疗帕金森病方面的应用。
本发明通过大量的实验发现，红花提取物具有显著的抗氧化应激作用，能够有效改善1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)诱导的慢性帕金森病C57小鼠的行为学表现，防止氧化应激诱导的原代神经细胞的凋亡，保护多巴胺能神经元形态的完整性。上述实验结果表明，红花提取物具有确切的预防或治疗帕金森病的药理活性。
红花在临床用药上一直作为改善心脑血管循环障碍用药，可以活血祛瘀，改善心脑血管循环，但作为活性部位，迄今为止，未见有关于其神经退行性疾病的药理活性研究。作为一种临床常见用药，开发其新用途具有非常重要的研究价值和实践意义。红花提取物的成分主要有红花醌苷、新红花苷、红花苷、红花黄色素和黄色素等。尽管有研究报道，红花提取物中的有些成分具有一定的抗氧化功效，但是抗氧化功效与抗帕金森病二者之间没有必然的联系，本发明在进行了大量实验的基础上才最终发现，红花提取物具有确切的预防或治疗帕金森病的功效。
本发明所述红花提取物可以是红花的水提物，也可是红花的醇提物。提取物可以为浸膏，也可以为喷雾干燥或冷冻干燥的产物。
本发明人通过实验发现，当本发明所述的红花提取物的有效成分主要由6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷或6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷中的任意一种或多种按照任意的重量配比比例所组成时，该红花提取物相比于其它的红花提取物，在治疗帕金森病的疗效上有显著的提高。
优选的，上述3种有效成分的重量百分含量分别为：6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷0.04-0.16％、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷0.01-0.04％，6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷0.006-0.024％；更优选的，3种有效成分的百分含量为：6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷0.06-0.12％、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷0.015-0.03％，6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷0.009-0.018％；特别优选的，3种有效成分的百分含量为：6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷0.08％、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷0.02％，6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷0.012％。
本发明所述的红花提取物的有效成分由6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷或6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷中的任意一种或多种按照任意的重量配比比例所组成时，其制备方法包括：(1)将红花用水浸泡提取，将水提取物过滤；(2)滤液上大孔树脂，用水-乙醇梯度洗脱；(3)收集50％乙醇洗脱液，浓缩，冻干，纯化，即得。其中，步骤(1)中优选将红花药材加水浸泡，浸泡后的红花再用30-80℃温水浸泡提取，将提取液减压浓缩，再减压抽滤。更优选的，将浸泡后的红花再用60℃温水浸泡提取2次，每次提取2小时。
本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种预防或治疗帕金森病的药物组合物，该药物组合物由有效量的红花提取物与药学上可接受的载体配合而成，也即是说，将药学上可接受用量的红花提取物与药学上可接受的载体或稀释剂配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。通常该组合物适合于口服给药，也适合于其他的给药方法。该组合物可以是片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂或口服液等液体制剂形式，或软膏剂、巴布剂等外用剂型。为了增加药物的溶出和吸收，红花提取物还可以制备成固体分散体。此外，该组合物也可以制备成缓控制剂、纳米制剂以及智能型给药系统。根据不同的给药途径和给药方法，本发明药物组合物可以含有0.1％-99％重量，优选10-60％重量的红花提取物。
本发明所述红花提取物口服固体制剂，包括红花提取物活性成份和作为分散剂的载体，其特征是所述的载体材料选自交联聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、微粉硅胶、聚乙二醇、糊精及其衍生物、乳糖、预胶化淀粉、微晶纤维素等之一种或其中几种的混合物。载体与药物的比例范围一般为0.5-20∶1(w/w)，较佳为1-5∶1(w/w)，最佳为2∶1(w/w)。
所添加的稀释剂可以是一种或几种增加片剂重量和体积的成分。常用的稀释剂包括乳糖、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、山梨醇、甘露醇以及无机钙盐等。其中最常用为乳糖、淀粉、微晶纤维素。
所采用的外加崩解剂可以为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-6％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2-6％)、海藻酸(与总重量比为2-5％)、微晶纤维素(与总重量比为5-15％)中之一种或几种混合物。其中以交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-7％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2-6％)为佳。最佳为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-6％)。
所采用的润滑剂包括硬脂酸，硬脂酸钠，硬脂酸镁，硬脂酸钙，聚乙二醇，滑石粉，氢化植物油中之一种或几种混合物。其中以硬脂酸镁最为适宜。润滑剂的用量范围(与总重量比)为0.10-1％，一般用量为0.25-0.75％，最佳用量为0.5-0.7％。
所采用的粘合剂可以是一种或几种有利于制粒的成分。可以是淀粉浆(10-30％，与粘合剂总重量比)，羟丙基甲基纤维素(2-5％，与粘合剂总重量比)，聚乙烯吡咯烷酮(2-20％，与粘合剂总重量比)，以聚乙烯吡咯烷酮的乙醇水溶液为佳，最佳为聚乙烯吡咯烷酮的50％乙醇水溶液。
所用助流剂可以为微粉硅胶、滑石粉、三硅酸镁中之一种或几种混合物。
本发明所述红花提取物固体分散体的制备工艺可以为熔融法、溶剂法、溶剂-熔融法或研磨法。所使用的水溶性载体一般为PEG类、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆、糖类。水不溶性载体一般为乙基纤维素、壳聚糖、丙烯酸树脂、脂质类等。肠溶性材料一般为邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素和丙烯酸树脂类。
所采用的表面活性剂可以为一种或几种能够提高润湿性和增加药物溶出的成分。常用为十二烷基硫酸钠(常用范围为0.2-6％，与总重量比)。
本发明进一步提供红花提取物液体制剂的制备方法，该方法包括：采用纯水、生理盐水或缓冲水溶液作为溶剂，以化学计量的红花提取物为原料，配制本发明所述红花提取物水溶液，所得红花提取物水溶液还可以任选含有其它药用辅料如抗氧化剂等，该溶液经本领域熟知的无菌和/或无热源处理后灌装于注射液容器如安瓿瓶。举例来说，其无菌和/或无热源处理可以是微孔超滤、热压灭菌等。
本发明所提供的满足临床应用需要的红花提取物溶液中可以用于进一步制备冻干制品，例如冻干粉针。本发明的冻干制品的浓度一般为5mg/ml-100mg/ml。冻干前，红花提取物水溶液可以任选添加药学上可接受的填充剂、防冻剂、渗透压调节剂、pH调节剂等。
一般来讲，本发明所述红花提取物用于治疗神经退行性疾病的推荐剂量为1-200mg/kg，优选为5-100mg/kg，最优选为10-60mg/kg。上述剂量可以为单剂量或多剂量给药。
附图说明
图1红花提取物的制备工艺流程图。
图2红花提取物的质谱鉴定图；色谱条件：色谱柱：AngilentSB C-18(5μ，4.6×250mm)；流动相：A：乙腈；B：0.1％三氟乙酸0-20min，2-5％A；20-30min，5-10％A；30-60min，10-20％A；60-65min，20％A.流速：1ml/min。
图3红花提取中的主要化合物紫外图谱。
图4小鼠在滚筒仪上的潜伏期试验结果(x±s，n＝13)；**P＜0.01vs MPTP组；#P＜0.05红花50mg/kg vs红花100mg/kg。
图5红花提取物对MPTP模型小鼠纹状体DA，DOPAC，HVA含量的影响
Figure BDA0000038055280000071
与对照组比较，a：P＜0.01；b：P＜0.05。与MPTP组比较，c：P＜0.01；d：P＜0.05。
图6黑质多巴胺能神经元免疫组化染色试验结果；A.正常组B.模型组(MPTP 30mg/kg)C.司来吉兰(Selegiline)(5mg/kg)+MPTP D.红花提取物(50mg/kg)+MPTP E.红花提取物(100mg/kg)+MPTP F.红花提取物(100mg/kg)。
图7化合物Hhw10和hhw17的抗氧化活性实验结果。
图86-羟基山奈酚-3，6，7-三氧葡萄糖苷的QCM实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1红花提取物的制备
一材料与方法
1材料
1.1.1试剂与药品
常规提取分离用乙醇、甲醇等均为分析纯试剂，制备用甲醇为色谱纯试剂，北京化工厂生产，乙腈为Fisher试剂(Fisher Scientific，Fairlawn，NJ)。去离子水由纯净水经Millipore Simplicity纯水系统制备。
大孔树脂(AB-8)购自天津南开大学；层析柱用凝胶SephadexLH-20(25-100μm)为Amersham Biosciences公司产品，北京分公司分装；ODS反相柱填料(50μm)为Merk公司生产。
1.1.2药材
红花为菊科植物红花Carthamus rinctorius L.的干燥花瓣，购自中国药材公司，产地为新疆，由北京大学药学院果德安教授鉴定。
2实验方法
2.1提取与分离
取红花药材560g，加14倍重量水浸泡过夜，60℃温浸两次，每次2小时，合并两次提取液，减压浓缩至一定体积约4升左右，将水提物溶液减压抽滤，澄清溶液上AB-8大孔树脂(购自天津南开大学)，以水-乙醇梯度洗脱。水洗脱部分为糖及大分子蛋白质等物质，弃去。HPLC检测收集10％(6g)、30％(22g)、50％(24g)、70％(2.4g)、95％(0.8g)乙醇洗脱部分，分别减压浓缩至一定体积后，至于真空冷冻干燥机中冻干，得干燥粉末，置干燥器中，避光阴凉处贮藏备用。取50％乙醇部分上Sephadex LH-20柱，水-甲醇梯度洗脱，HPLC检测收集合并各流份，半制备液相进一步纯化，得到hhw-11(6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷)(41mg)、hhw-18(6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷)(9.8mg)、hhw-20(6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)(6mg)。以上成分为红花的富含成分。具体分离过程见图1。上述3种成分的质谱鉴定图和紫外图谱分别见图2和图3。
Figure BDA0000038055280000101
C27H30O16
Exact Mass：610.15
Mol.Wt.：610.52
m/e：610.15(100.0％)，611.16(30.2％)，612.16(7.7％)，613.16(1.4％)
C，53.12；H，4.95；O，41.93
6-Hydroxykaempferol 3-O-β-D-rutinoside
(6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷)
Figure BDA0000038055280000102
C27H28O17
Exact Mass：624.13
Mol.Wt.：624.5
m/e：624.13(100.0％)，625.14(30.2％)，626.14(7.9％)，627.14(1.4％)
C，51.93，H，4.52；O，43.55
6-Hydroxykaempferol 6-O-β-D-glucoside-7-O-β-D-glucuronide
(6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷)
C33H40O21
Exact Mass：772.21
Mol.Wt.：772.66
m/e：772.21(100.0％)，773.21(37.0％)，774.21(10.8％)，775.21(1.6％)
C，51.30；H，5.22；O，43.48
6-Hydroxykaempferol 3-O-β-rutinoside-6-O-β-D-glucoside
6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷
实施例2红花提取物颗粒剂的制备
取实施例1所制备的红花提取物(50％乙醇洗脱部分，含有6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷、6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)3克，与5克微晶纤维素、3克乳糖、1克交联羧甲基纤维素钠混合，以3％聚维酮乙醇液(50％浓度)为粘合剂制软材，过40目筛制粒，60℃干燥，过30目筛整粒，即得红花提取物颗粒剂。
实施例3红花提取物片剂的制备
取实施例1所制备的红花提取物(50％乙醇洗脱部分，含有6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷、6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)10克，与5克乳糖、3克预胶化淀粉、1克羧甲基淀粉钠混合，过80目筛2遍，混合均匀，以3％PVP乙醇溶液(浓度50％)为粘合剂制软材，过40目筛制粒，60℃干燥，过30目筛整粒，加入0.1克微粉硅胶混合均匀，压片，可制备红花提取物片100片。
实施例4红花提取物胶囊剂的制备
取实施例1所制备的红花提取物(50％乙醇洗脱部分，含有6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷、6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)10克，与4克微晶纤维素、4g淀粉、1克交联聚维酮混合均匀，以1％聚维酮乙醇液(浓度50％)为粘合剂制软材，过40目筛制粒，60℃干燥，过30目筛整粒，灌装胶囊100粒。
实施例5红花提取物固体分散体的制备
将1重量份实施例1所制备的红花提取物(50％乙醇洗脱部分，含有6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷、6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)与1重量份PVP-K30，溶于适量水中，将该溶液喷雾干燥。喷雾干燥条件为：进风温度为45℃，进料速度为25ml/min，雾化器转速为45Hz，旋风分离器压差为50mm水柱。所得干燥粉末即为红花提取物固体分散体。
实施例6红花提取物固体分散体的制备
将1重量份实施例1所制备的红花提取物(50％乙醇洗脱部分，含有6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷、6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)与2重量份PVP-XL混合均匀，置于行星式研磨仪中，以300r/m的转速研磨1.5小时，即得红花提取物固体分散体。
实施例7微粉化的红花提取物的制备
将实施例1所制备的红花提取物(50％乙醇洗脱部分，含有6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷、6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)置于气流粉碎机中粉碎，过200目筛，即得微粉化的红花提取物。
实施例8红花提取物注射剂的制备
1.处方
原料                                        用量
实施例1所制备的红花提取物(50％乙醇洗脱      100.0g
部分，含有6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-
羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷、
6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)
羟丙基-β-环糊精                            500.0g
pH 7.5Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液  至             5.0L
制成                                        1000支
2.制法Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液适量，加入红花提取物500g，羟丙基β-环糊精500g，搅拌至溶，加Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液定容至5.0L，0.45μm微孔滤膜粗滤，续以0.22μm的微孔滤膜过滤后，即得红花提取物注射剂。
实施例9红花提取物糖浆剂的制备
1.处方
原料                                        用量
实施例1所制备的红花提取物(50％乙醇洗脱      100.0g
部分，含有6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-
羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷、
6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)
蔗糖                                        500.0g
防腐剂                                      适量
矫味剂                                      适量
蒸馏水  至                                  10.0L
制成                                        1000瓶
2.制法将蔗糖加入到不锈钢容器中，加适量蒸馏水后蒸汽加热，待蔗糖溶解后过40目筛除去异物。另取蒸馏水适量，加入红花提取物，经搅拌至溶，0.45uM滤膜过滤，滤液与所制备的糖浆充分混合，其他附加剂溶解后在搅拌条件下缓缓加入上述混合液，加蒸馏水至全量，搅拌均匀。测定主药含量，合格后进行灌装，即得红花提取物糖浆剂。
实验例1行为学实验
一材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物
C57BL/6小鼠，雄性，体重16-18g，购自北京大学医学部实验动物中心，室温恒温饲养，饮水饮食不限，12小时交替照明。实验前适应环境1周。许可证号：SCXK(京)2006-0025。
1.1.2试剂和仪器
MPTP购自Sigma公司；红花提取物由实施例1所制备(50％乙醇洗脱部分，主要含有6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷、6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)。SD-2型小鼠滚筒仪，北京大学医学部实验仪器厂生产。
1.2实验方法
1.2.1实验分组及处理方法
小鼠随机分为分5组，每组13只，分别为空白对照组、模型对照组、金刚烷胺(30mg/kg)、以及红花提取组(50mg/kg，100mg/kg)。连续灌胃给药14d，于第11d开始灌胃给药前1h腹腔注射MPTP 30mg/kg(对照组给予等体积的生理盐水)，连续4d，最后1次给药后1d，进行行为学指标测试，4d后断头放血处死，分别取小鼠脑纹状体和黑质，于-80℃保存，用于分别测定多巴胺含量以及免疫组化实验(分组不同，阳性对照药物是司来吉兰(Selegiline)(5mg/kg))。
1.2.2实验指标测定方法
一般行为学观察  观察小鼠在腹腔给予MPTP造模后的一般行为表现，有无异常反应，比较分析各组之间的差异。
滚筒实验  使用SD-2型小鼠滚筒仪测试小鼠的滚筒行为表现。测试前连续训练3d，每天2次，转速为12r/min，训练时间120s。将小鼠置于滚筒仪的滚筒上，设置转速35r/min，测试小鼠从滚筒开始旋转到离开滚筒的时间作为小鼠运动潜伏期，测试时间为120s。每只小鼠测3次取平均值。
二实验结果与讨论
2.1一般行为学
腹腔给予MPTP(30mg/kg)后5min开始，与对照组相比MPTP模型组小鼠的一般行为表现异常，大多数出现下列变化：举尾、竖毛、唾液分泌增多、呼吸加快、肌张力减退、对外环境刺激敏感及牙颤等，其持续时间一般为2～3h。而红花(50、100mg/kg)和金刚烷胺(40mg/kg)组，其症状表现较轻，持续时间较短。
2.2滚筒实验
实验结果表明MPTP模型组与对照组相比，运动潜伏期明显缩短(P＜0.01)，用50mg/kg、100mg/kg红花提取物预处理后，和MPTP模型组相比能明显的增加滚筒运动潜伏期(均为P＜0.01，图4)。
三、实验结论
3.1红花提取物可以显著地延长MPTP造模小鼠滚筒运动潜伏期，表明红花提取物具有一定的神经保护作用。
3.2红花低剂量组与红花高剂量组MPTP造模小鼠滚筒运动潜伏期存在显著性差异(P＜0.05)，说明红花提取物的神经保护作用可能具有剂量依赖性。
实验例2HPLC-ECD法测定纹状体中多巴胺及其代谢产物的含量
一材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物
C57BL/6小鼠，雄性，体重16-18g，购自北京大学医学部实验动物中心，室温恒温饲养，饮水饮食不限，12小时交替照明。实验前适应环境1周。许可证号：SCXK(京)2006-0025。
1.1.2试剂和仪器
MPTP购自Sigma公司；红花提取物由实施例1所制备(50％乙醇洗脱部分，主要含有6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷、6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)。
2实验方法
2.1实验分组与给药
室温恒温饲养，饮水饮食不限，12小时交替照明。实验前适应环境1周。小鼠随机分为分5组，每组13只，分别为空白对照组、模型对照组、金刚烷胺组(40mg·kg-1)、以及红花提取物组(50mg·kg-1，100mg·kg-1)。给药：连续灌胃给药14d，空白对照组与模型对照组给予等体积的去离子蒸馏水。造模(赵欣，蒲小平，耿兴超.松果菊苷对帕金森病模型小鼠黑质纹状体蛋白表达影响的双向电泳分析[J].中国药理学通报，2008，24(1)：28～32.)：于第11d开始灌胃给药前1h腹腔注射MPTP 30mg·kg-1(对照组给予等体积的生理盐水)，连续4d，最后1次给药后1d，进行行为学指标测试。行为学指标测试完后1d，小鼠断头放血处死，取小鼠脑纹状体，于-80℃保存，用于测定多巴胺含量。
采用高效液相-电化学法(HPLC-ECD)检测纹状体内多巴胺及其代谢产物二羟苯乙酸(dihydroxy-phenyl acetic acid，DOPAC)和高香草酸(homovanillic acid，HVA)的含量(赵磊，蒲小平.类叶升麻苷对MPTP所致帕金森病小鼠模型的神经保护作用[J].中国药理学通报，2007，23(1)：42～46.)。样品预处理：取纹状体，按比例为250μL∶100mg组织加入样品预处理A液(0.4mol·L-1HClO4)。冰浴超声匀浆处理，4℃静置1h，避光保存，15000g离心20min，定量吸取上清后加入一半上清体积的样品预处理B液(20mmol·L-1柠檬酸钾，300mmol·L-1磷酸氢二钾，2mmol·L-1EDTA-2Na)，充分混匀后4℃静置1h，15000g离心20min，取上清，-80℃保存直至测定。样品测定条件：施加电势：0～500mV，以100mV递增。流动相：柠檬酸缓冲液100mmol·L-1，EDTA-2Na 100mmol·L-1，1-烷基硫酸钠20mmol·L-1，20％甲醇。C18柱流速：1ml·min-1，温度24℃±1℃。进样量：50μL。多巴胺含量用μg·g-1湿组织重表示。测定数据后，绘制标准曲线及进行统计学分析。
3实验结果与讨论
图5所示是由标准曲线计算得到的各组样本DA，DOPAC以及HVA的含量柱状图。与正常组(Control)比较，模型组(MPTP)纹状体内DA(P＜0.01)，DOPAC(P＜0.01)，HVA(P＜0.05)含量降低并且有显著性差异。与模型组比较，红花提取物(CTE)50mg·kg-1组DA(P＜0.05)，DOPAC(P＜0.05)含量有显著性增高。与模型组比较，红花提取物100mg·kg-1组DA(P＜0.01)，DOPAC(P＜0.01)，HVA(P＜0.01)的含量有显著性增高。与CTE(50mg·kg-1)组比较，CTE(100mg·kg-1)组DA含量显著增加(P＜0.05)(图中未标示)。
实验例3脑区DA神经元酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学染色
一材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物
C57BL/6小鼠，雄性，体重16-18g，购自北京大学医学部实验动物中心，室温恒温饲养，饮水饮食不限，12小时交替照明。实验前适应环境1周。许可证号：SCXK(京)2006-0025。
1.1.2试剂和仪器
MPTP购自Sigma公司；司来吉兰(Selegiline)购自南京思科药业有限公司，红花提取物由实施例1所制备(50％乙醇洗脱部分，主要含有6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷、6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)。
2实验方法
2.1.麻醉
每组小鼠各取两只，以戊巴比妥钠(50mg/kg，ip)腹腔注射麻醉，后肢回缩反射消失及角膜反射消失为麻醉指标。
2.2灌注固定
将小鼠仰卧位固定于鼠板上，快速剪开腹腔和胸腔前壁，清晰暴露出心脏和升主动脉，用连有输液管的注射针头由心尖处插入左心室，并通过心腔插入升主动脉，用止血钳固定，依次以生理盐水和4％多聚甲醛灌注固定，直到动物全身呈僵硬状态。
2.3取材和后固定
灌注结束后取出完整的脑组织，先置于4％多聚甲醛中后固定6h，然后经10％、20％、30％的梯度蔗糖浸泡过夜。
2.4冰冻切片
待组织块下沉后对黑质部位进行切片，修整脑组织块，于前卤后4.2-5.6mm范围内做连续间隔冰冻冠状切片，制成20μm厚的冰冻切片。
2.5TH染色
1)0.01M的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)冲洗5-10分钟，加入3％H2O210分钟。
2)用去离子水冲洗后，再用0.01M磷酸盐缓冲液浸泡切片5分钟。
3)加入封闭剂(10％兔血清，用0.01M PBS稀释)室温孵育30分钟，倾去，勿洗。
4)加入酪氨酸羟化酶的多克隆抗体(Chemicon International，Temecula，CA，USA)(1∶1000稀释，含有0.3％的TritonX-100)，4℃过夜。
5)室温复苏5分钟，0.01M的PBS漂洗，5分钟×3次。
6)加入一滴两步法试剂盒的二抗，37℃孵育30分钟。
7)0.01M PBS冲洗，5分钟×3次。
8)DAB染色，按照试剂盒所示，取A/B两种试剂各加入一滴至1ml去离子水中，即可获得1ml DAB工作液，进行染色。取一切片置于显微镜下观察，有阳性反应即可终止显色，置于去离子水内。
9)梯度乙醇脱水(80％乙醇5min×1次；85％乙醇5min×1次；90％乙醇5min×1次；95％乙醇5min×2次；无水乙醇5min×2次)，二甲苯透明(二甲苯5min×2)，中性树胶封固(加中性树胶1滴于载玻片上，轻轻的从一边开始盖上盖玻片，注意防止有气泡产生，晾干即可)。于显微镜下观察并照相。
2.4统计学处理
所有数据均以均值±标准差来表示。除滚筒实验采用Mann-Whitney U检验外，其余实验的各组间比较采用t-检验和双因素ANOVA检验，P＜0.05为统计学上有显著性差异。
二实验结果与讨论
小鼠黑质部位的酪氨酸羟化酶的免疫组化染色结果如图6所示。TH是多巴胺合成代谢中的限速酶。通过TH抗体特异性染色，可以明显的观察到多巴胺能神经元。在多巴胺能神经元的胞浆内可明显观察到褐色的阳性反应(图6A)。从图6中可以看出，给予MPTP后可发现黑质部位的多巴胺能神经元数量以及免疫反应的阳性信号强度与正常对照组相比均明显降低(图6B)；而用红花提取物预处理后，和模型组相比则能显著增加黑质部位的多巴胺能神经元的数量，提高免疫化学反应的阳性信号强度(图6D，E)。单纯给予红花提取物，神经元的数目和形态都类似于正常组(图6F)。结果表明，红花提取物对神经细胞具有神经保护作用，可以对抗MPTP神经毒素诱导的细胞死亡，且其本身没有毒性(参见图6F)。
三实验结论
红花提取物具有神经保护作用，能够保持多巴胺能神经元形态的完整性，对抗MPTP神经毒素对多巴胺能神经元的损伤。
实验例4红花组分体外抗ADP诱导的血小板聚集活性测定
1.1动物与分组：清洁级SD大鼠，体重250±30g；由北京大学医学部实验动物中心提供。测定分成6组，即空白对照组、阿司匹林组、hhw5组、hhw10组、hhw17组，hhw18组，每组测定3次(n＝3)。
1.2仪器与药品：TYXN-96血小板聚集仪(上海通用机电技术研究所)：旋转蒸发器RE-52(上海亚荣生化仪器厂)；DLSB低温冷却循环泵(郑州长城科工贸易有限公司)；SHB-III循环水式多用真空泵(上海亚荣生化仪器厂)；数显恒温水浴锅HH-2(国华电器有限公司)；
戊巴比妥钠购自上海化学试剂厂；肝素钠购自天津生化制药厂。
2.实验方法
2.1PRP与PPP制备：大鼠称重，0.3％戊巴比妥钠按1ml/100g腹腔内注射，麻醉后仰卧位，四肢固定于手术台上，腹部沿正中线皮肤切开，钝性分离皮下组织、浅深肌肉，分别暴露并游离出腹主动脉取血5～8ml，放入有3.8％枸橼酸钠抗凝剂的硅化离心管中(血量与抗凝剂比例为9∶1)；使血液与抗凝剂充分混匀，加盖备用。将上述血标本以800r/min离心10min，小心取出上清液，得富血小板血浆即PRP；继续以3000r/min离心15min，取上清液，得贫血小板血浆即PPP，留作空白对照用。
2.2血小板聚集率测定：取250μl PRP于比浊管内，37℃环境中恒温孵育5min。以PPP调节PRP至血小板数为(40～50)×1011/L。然后将搅拌磁子放入孵育好的PRP内，搅拌，迅速注入聚集诱导剂ADP20μl(5μmo l/L)，记录5min聚集曲线，取最大聚集率(Amax)，并计算聚集抑制率，聚集率＝[(加药前Amax-加药后Amax)/加药前Amax×100％]。同时测定空白阴性对照，加入20μl阿司匹林作为阳性对照。
判断标准：单体化合物在100uM终浓度，抑制率＜30％为无效，30-55％为弱效，55-70％为显效，＞70％为强效。
3实验结果
Hhw18(6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷)为强效抗凝物质，其特点为6-羟基芹菜素为母核。Hhw10(6-羟基山奈酚-3-氧葡萄糖苷)为弱效抗凝化合物，hhw5(6-羟基山奈酚-3，6，7-三氧葡萄糖苷)为显效化合物，而hhw17(6-羟基山奈酚-6，7-二氧葡萄糖苷)则为无效抗凝化合物。这些化合物都为6-羟基山奈酚为母核，但由于取代基的不同，所以活性表现出较大的差异。
Hhw5和hhw18进入下一轮的抗氧化应激筛选。而hhw10和hhw17则在此轮活性筛选中被淘汰。
表1抗ADP诱导的血小板凝集实验
  化合物代号   名称   抑制率(％)
  Hhw5   6-羟基山奈酚-3，6，7-三氧葡萄糖苷   59.19±3.9*
  Hhw10   6-羟基山奈酚-3-氧葡萄糖苷   48.17±1.7
  Hhw17   6-羟基山奈酚-6，7-二氧葡萄糖苷   27.80±2.9
  Hhw18   6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷   71.52±6.1**
  Aspirin   阿司匹林   42.17±4.2
实验例5红花化学成分对过氧化氢诱导的PC12细胞毒性模型的抗氧化活性测定
一仪器与药品
1.1试剂药品
人多巴胺能神经母细胞瘤细胞株(PC12)购自中科院上海细胞所。胎牛血清购自杭州四季青公司。马血清购自Hyclone公司。培养基购自迈晨公司。过氧化氢，MTT购自Sigma公司；红花提取物中系列化合物由实施例1制备方法分离得到：hhw-11(6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷)、hhw-18(6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷)、hhw-20(6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)。hhw5(6-羟基山奈酚-3，6，7-三氧葡萄糖苷)。Hhw10(6-羟基山奈酚-3-氧葡萄糖苷)和hhw17(6-羟基山奈酚-6，7-二氧葡萄糖苷)。
1.2仪器全自动酶标仪(biorad公司)
二实验方法
2.1PC12细胞培养
PC12细胞所使用1640培养基加入体积分数10％的小牛血清、体积分数5％的马血清以及抗生素1×105U·L-1、，5％CO2，37℃培养细胞。待细胞增长至80％融合时，用0.5g·L-1胰蛋白酶消化传代，1∶3分瓶传代，每4d传代一次。每隔2d换液一次。
2.2实验分组与药物处理
PC12细胞分为以下各组(1)空白对照组：除了培养基外，不加任何药物；(2)模型组：培养液中加入200μM的H2O2，处理30min；(3)给药组(5％DMSO配制)：用化合物预处理后加入H2O2，处理6h；各组细胞培养所需观察时间后，进行细胞存活率测定。
2.3细胞存活率测定
以5×104的密度浓度接种于96孔板中，每组3个复孔，进行药物处理后，继续孵育6h，除对照组外各组加入200μM的H2O2，处理30min。之后每孔加入终浓度为0.5g/L的MTT，培养4h后吸去培养液，加入10％SDS终止反应，每孔加入DMSO 200μl，充分吹打震荡，待蓝色颗粒完全溶解后用半自动酶标仪测定570nm处的吸光度值(A570nm)，用于定量反映细胞的存活率。
三实验结果
实验结果如表2所示，从表2中数据可以看出，Hhw5化合物无抗氧化活性，在此轮中被淘汰。另外的三种化合物(Hhw11、Hhw18和Hhw20)有明显的抗氧化作用，与模型组相比具有显著性差异，能够对抗过氧化氢诱导引起的PC12细胞损伤。PC12细胞常用于抗帕金森病化合物药效的体外筛选，这提示从红花中所分离的这3种化合物具有抗帕金森病的药理作用。
表2过氧化氢诱导的PC12细胞毒性模型的抗氧化活性实验结果
Figure BDA0000038055280000261
*P＜0.05；**P＜0.01vs模型组
Hhw10和hhw17的抗氧化活性实验结果见图7，Hhw10和hhw17的不同浓度的细胞存活率与过氧化氢诱导损伤的模型组相比没有显著性差异，因此Hhw10和hhw17不具有抗氧化活性。
实验例6QCM试验
一、试验材料
1、供试化合物：hhw5(6-羟基山奈酚-3，6，7-三氧葡萄糖苷)。
2、其它化合物：氯仿；H2O2/H2SO4(mol/mol＝1/3)，DMSO。
二、试验方法
1、用H2O2/H2SO4(mol/mol＝1/3)作为洗涤剂洗涤石英芯片，洗涤后用蒸馏水冲洗，吹打干净。
2、固定化合物：将4ul的1uM供试化合物样本溶于适量氯仿中，直到氯仿完全挥发。
3、取8mlPBS置于样品池中，固定石英芯片，使之浸入样品池中。
4、启动计算机，然后调整相关参数。
5、待基线平稳后，取1mg/ml的蛋白溶液8ul，加入样品池，标记，记录1h的曲线。
6、根据得到的曲线，判断化合物是否与DJ-1蛋白有相互作用。
三、试验结果
通过QCM实验进一步证明了hhw5号化合物与帕金森病DJ-1靶点也没有结合，所以最终证明该化合物不具有抗帕金森作用的活性(图8)。
以上对本发明各种实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明精神，均应属于本发明所附权利要求所限定的范围。

Claims (3)

1.红花提取物在制备治疗神经退行性疾病药物中的用途，其特征在于： 
所述的红花提取物的有效成分主要由6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷和6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷组成； 
所述的红花提取物中3种主要有效成分的重量百分含量分别为：6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷0.04-0.16%、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷0.01-0.04%、6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷0.006-0.024%； 
所述的红花提取物的制备方法包括：（1）将红花药材加水浸泡，浸泡后的红花再用30-80℃温水浸泡提取，得到提取液，将提取液减压浓缩，再减压抽滤；（2）滤液上大孔树脂,用水-乙醇梯度洗脱；（3）收集50%乙醇洗脱液，浓缩，冻干，纯化，即得。 
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的3种有效成分的重量百分含量为：6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷0.06-0.12%、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷0.015-0.03%、6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷0.009-0.018%。 
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的3种有效成分的重量百分含量为：6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷0.08%、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷0.02%、6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷0.012%。 
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