CN105535004A - 白头翁皂苷b4作为ev71病毒抑制剂在制备抗手足口病药物中的应用 - Google Patents
白头翁皂苷b4作为ev71病毒抑制剂在制备抗手足口病药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了白头翁皂苷B4作为EV71病毒抑制剂在制备抗手足口病药物中的应用,白头翁皂苷B4在制备抗手足口病药物中的应用是通过抑制EV71感染引起的细胞凋亡与坏死的活性产生的,本发明的白头翁皂苷B4作为EV71病毒抑制剂在治疗手足口病中的应用属于首次公开,属于纯天然制剂,安全可靠无毒副作用,对治疗手足口病药物研发具有潜在价值。
Description
技术领域
本发明涉及白头翁皂苷B4作为EV71病毒抑制剂在制备抗手足口病药物中的应用,属于医药领域。
背景技术
手足口病(hand-foot-mouthdisease,HFMD)是肠道病毒所引起的严重危害5岁以下婴幼儿急性传染病,自2008年纳入国家疫情报告系统以来,每年报告手足口病发病数均有100余万例,截至2015年末,全国累计报道手足口病发病近1400万例,婴幼儿死亡达3300多例,发病率排在法定传染病的第一位,病死率排在前5位,对社会稳定和经济发展造成重大影响,引起广泛关注。手足口病的主要表现为发热、口腔黏膜溃疡性疱疹及四肢末端水疱样皮疹,个别患者因病毒侵袭心脏与大脑而引发心肌炎、肺水肿等致命性并发症,其中柯萨奇病毒A16(CoxsackieA16,CA16)和肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)是本病的主要致病原,而EV71型肠病毒危害更大。近年来,在亚洲爆发流行的病原体主要是EV71,其流行呈上升的趋势,目前尚无特效药物。因此,开发有效的抗EV71病毒的药物用于治疗手足口病迫在眉睫。
相对于价格高昂、抗病毒活性不甚理想的传统西药,中药具有价格低廉、药源广泛、活性显著等优点。传统中药材能抑制病毒复制、阻止病毒致细胞病变、调节免疫功能、改善肺循环、镇痛抗炎等。目前,随着筛选和分离技术的提高,从中药中寻找具有抗病毒活性的成分已经成为开发抗病毒药物的重要途径之一。
大量的体外抗病毒筛选和临床研究结果发现,某些复方及单味中药均显示出良好的抗EV71病毒活性。研究表明清开灵、双黄连等很多中药复方及单味药能缓解EV71手足口病病情和缩短病程。如注射用双黄连粉针,主要由连翘、银花、黄芩等提取制成,具有辛凉解毒清热之功效,易世红等对双黄连粉针剂的体外抗病毒药效学研究表明,其具有明显抑制新肠道病毒71型的作用,在治疗手足口病的临床应用中具有良好的疗效。张闻等将79例确诊为小儿手足口病的患儿随机分为2组,对照组给予利巴韦林颗粒,观察组给予清开灵颗粒,观察2组的疗效及副反应,结果显示2组疗效无显著性差异,但对照组的不良反应发生率明显高于治疗组,这表明清开灵颗粒用于治疗小儿手足口病效果好于利巴韦林。牛儿苗科植物老鹤草的主要成分之一,中医古籍《日华子本经》、《本草纲目》、《滇南本草》均有记载其清热解毒等功效。现代药理显示其抗病毒、抗菌、护肝药效,实验表明老鹤草在体内和体外抗EV71均有较好的效果。细胞实验:使用10μg/mL的药物可在RD细胞上明显抑制EV71病毒复制,动物实验:老鹤草可以明显降低EV71感染小鼠死亡率,减轻其临床症状,并降低其组织病毒复制。
白头翁是毛茛科(Ranunculaceae)白头翁属植物白头翁(Pulsatillachinensis(Bunge)Regel)的干燥根,具有清热解毒、凉血止痢的功效。白头翁的主要药理作用包括抗菌作用、抗阿米巴原虫作用、抗病原体作用、抗癌作用、杀精子作用和镇静镇痛作用。白头翁的主要有效成分包括白头翁素和白头翁皂苷等,其中白头翁皂苷可通过水提或醇提得到。现代药理研究发现,白头翁皂苷具有增强免疫功能、抗炎、抗肿瘤、抗病原微生物等作用,因此受到广泛的研究和关注,但目前尚未有病毒活性的白头翁皂苷单体化合物的报道。
发明内容
本发明的目的是提供白头翁皂苷B4作为EV71病毒抑制剂在抗制备抗手足口病药物中的应用。
白头翁皂苷B4,分子式:C59H96O26,英文名:AnemosideB4,化学名:3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基-3β,23-二羟基羽扇豆烷-Δ20(29)烯-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。
白头翁皂苷B4在抗制备抗手足口病药物中的应用是通过抑制EV71病毒感染引起的细胞凋亡与坏死的活性达到的,本发明的白头翁皂苷B4作为EV71病毒抑制剂在治疗手足口病中的应用属于首次公开,属于纯天然制剂,安全可靠无毒副作用,对以EV71病毒抑制剂为靶标的手足口病药物开发具有潜在的价值。
本发明通过具体实施例中的实验证明了白头翁皂苷B4作为EV71病毒抑制剂具有治疗手足口病的作用。
附图说明
图1:白头翁皂苷B4的结构式。
图2:EV71病毒感染RD细胞不同时间点凋亡与坏死分析
图3:白头翁皂苷B4对EV71病毒的抑制作用的凋亡比例统计分析
图4:不同浓度的白头翁皂苷B4对EV71病毒抑制作用的荧光显微镜致病变效应分析
图5:不同浓度的白头翁皂苷B4对EV71病毒抑制作用的凋亡比例统计分析。
具体实施例
以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明,但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制,而是由权利要求加以限定。
实施例1:白头翁皂苷B4体外抗EV71的活性测定。
(1)病毒感染
感染模式:RD细胞(人横纹肌瘤细胞),EV71能在RD细胞中感染并复制,引起RD细胞凋亡与坏死,EV71主要感染人的肌肉与神经组织,体外用EV71感染RD细胞可以模拟手足口病模型。
感染方法:EV71感染RD细胞引起RD细胞凋亡与坏死将RD细胞种在6孔板,待细胞贴壁后,浓度达到80%,EV71感染细胞,正常培养的RD细胞作为空白对照。在感染后不同时间取样,用倒置荧光显微镜观察病毒致细胞病变效应(CytopathicEffect,CPE)观察,用流式细胞仪测定细胞的凋亡与坏死。流式细胞仪测定结果如说明书附图2所示。
结果分析:在本实验感染复数下,24小时内细胞基本没有出现明显的凋亡与坏死,24小时后凋亡与坏死急剧增加,到第36小时,大部分细胞已裂解,或收缩变圆,或脱壁,显示RD细胞出现了明显的凋亡与坏死(凋亡结果中未计算已裂解的细胞)。
(2)白头翁皂苷B4对EV71的抑制作用(病毒感染与药物处理同步)
实验方法:将RD细胞种在6孔板,待细胞贴壁后,浓度达到80%,正常培养的RD细胞与仅加B4的孔作为空白对照;只感染EV71的孔作为阳性对照;在感染EV71的同时加入B4作为实验组。B4处理浓度为50ng/mL,36小时后取样,流式细胞测定凋亡,实验结果如说明书附图3所示:
结果分析:B4具有明显的抑制EV71感染引起的细胞凋亡与坏死的活性。
(3)白头翁皂苷B4对EV71的抑制作用(先感染后用药物处理)
实验方法:使用同样的感染模型,将RD细胞种在6孔板,待细胞贴壁浓度达到80%,先用EV71感染18小时,然后再分别用不同浓度(1ng/mL、25ng/mL、50ng/mL)的白头翁皂苷B4药物处理EV71感染的细胞,用倒置荧光显微镜观察病毒的致细胞病变效应(CytopathicEffect,CPE)现象。倒置荧光显微镜观察效果结果(如说明书附图4所示),18小时后用流式细胞仪分析细胞的凋亡与坏死情况(如说明书附图5所示)。
结果分析:倒置荧光显微镜观察效果在低浓度(1ng/mL)时,略有保护作用但不明显,在中高浓度(25ng/mL和50ng/mL)有明显的保护作用,且高浓度保护作用较中浓度略强。流式细胞仪分析显示相同的感染模式与给药处理方式,不同浓度的白头翁皂苷B4对细胞活性无明显影响,低浓度保护作用不明显,中高浓度具有明显的保护作用。
实施例2:白头翁皂苷B4体内抗EV71的活性测定
(1)实验动物:2日龄ICR小鼠,平均体重在1.6-1.8克。
(2)感染方法:取2日龄乳鼠,禁食5小时后,EV71病毒腹腔注射。
(3)实验分组:共分成9组:阴性组(未感染病毒组),模型组(感染病毒后,每天腹腔注射等体积的生理盐水),阳性对照组(感染病毒后,每天利巴韦林腹腔注射治疗,100mg/kg/天),实验组I(感染病毒24小时后,每天腹腔注射白头翁皂苷B41次,剂量分别为50,100,200mg/kg/天),实验组II(感染病毒72小时后,每天腹腔注射白头翁皂苷B41次,剂量分别为50,100,200mg/kg/天)。每组实验动物为12只,给药体积为10μL/g。
(4)实验结果:
状态观察结果:感染病毒2天后,模型组所有动物一侧后肢明显僵直,略呈绕圈爬行,饮食正常,实验组I各剂量组症状不明显。感染病毒3天后,模型组和实验组II中所有动物双后肢僵直,爬行略困难,生长变慢,体重相对阴性组明显下降,个体大小表现明显差异,胃内依然有食物残留;实验组I中仅低剂量组(50mg/kg/天)有5只出现一侧后肢僵直,其它剂量组动物的症状不明显。
各组成活数目统计:数据见表1和表2,感染病毒7天后,模型组和阳性对照组所有动物均已死亡;实验组I中的低剂量组存活动物1只,但有一侧后肢僵直;实验组I中的中剂量组存活动物6只,但个体平均体重仅阴性组一半,有4只动物出现一侧后肢僵直,2只动物两后肢均僵直,前肢均正常,胃内残留食物量少;实验组I中的高剂量组存活动物9只,且有6只动物体重与阴性组间无明显差异,2只动物出现一侧后肢略有僵直症状且体重较轻,1只动物出现一侧后肢明显僵直症状;实验组II中仅高剂量组存活动物4只,且双后肢有明显僵直,体重仅阴性组一半左右。
表1:病毒感染24小时后给药白头翁皂苷B4,各组小鼠存活数统计
表2:病毒感染72小时后给药白头翁皂苷B4,各组小鼠存活率统计
Claims (2)
1.白头翁皂苷B4在制备抗手足口病药物中的应用。
2.如权利要求1所述的的应用,其特征在于:白头翁皂苷B4是通过抑制EV71病毒感染引起的细胞凋亡与坏死的活性达到的。
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