CN102078389A - 白头翁提取物在制备抗血吸虫药物中的应用与白头翁提取物的制备方法及其制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种白头翁提取物在制备抗血吸虫药物中的应用，本发明还提供白头翁提取物的制备方法及其制剂的制备方法，白头翁提取物的制备方法是将白头翁药材粉碎成粗粉，用10-95％乙醇浸泡0.5-2h，6-12倍量加热回流提取2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液；滤液上大孔吸附树脂柱，精制得白头翁提取物。白头翁提取物具有显著的抗血吸虫活性，可以用于人或其它哺乳动物血吸虫病的预防治疗。
Description
技术领域
本发明属于医药、兽药技术领域，涉及一种白头翁在制备抗血吸虫药物中的应用，本发明还提供白头翁提取物的制备方法及其制剂的制备方法，该有效组分具有显著的抗血吸虫活性，可以用于人或其它哺乳动物血吸虫病的预防治疗。
背景技术
白头翁药材取自毛茛科白头翁属植物白头翁(Pulsatilla chinensis(Bunge)Regel)的干燥根，味苦，性寒。归胃、大肠经，具清热解毒，凉血止痢之功。用于热毒血痢，阴痒带下，阿米巴痢。据文献报道，白头翁中含原白头翁素(Protoanemonin)、白头翁素(Anemonin)、白头翁灵(Okinalin，C32H46O2)、白头翁英(Okinalein，C4H6O2)等，近年来国内外学者从白头翁属植物中分离鉴定出几十种五环三萜皂苷成分，这些皂苷主要为齐墩果烷型和羽扇豆烷型两种。白头翁属植物具有广泛的药理及生物活性，主要表现在抗肿瘤、抗炎抗菌、抗病毒、细胞凋亡、抗生物酶、杀虫、杀精等作用。兰继毓等研究发现白头翁煎剂对杀灭溶组织内阿米巴的效果较好。经检索，没有发现白头翁药材及其有效组分具有抗血吸虫活性的文献报道。
经过反复研究发现白头翁水提液及醇提液均具有较强的抗血吸虫活性，经过了系统研究，准备开发以白头翁有效组分为主要成分，用于预防或治疗人或其它哺乳动物血吸虫病的药物。
发明内容
本发明提供一种白头翁在制备抗血吸虫药物中的应用，本发明还提供白头翁提取物的制备方法及其制剂的制备方法，白头翁提取物具有显著的抗血吸虫活性，可以用于人或其它哺乳动物血吸虫病的预防治疗。
白头翁提取物中的白头翁活性组分中皂苷类成分含量为70％以上。
本发明中皂苷类成分含量的测定方法：
1、常春藤皂苷元对照品溶液的制备
精密称取常春藤皂苷元对照品5mg于50mL容量瓶中，以甲醇溶解，定容，配成0.1mg/mL的标准品溶液，冷藏保存备用。
2、常春藤皂苷元最大吸收波长的确定
精密吸取对照品溶液1ml，2份(一份做空白，一份做显色)，加入标号的干燥的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇，显色组加入5ml的高氯酸，摇匀，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却15min，随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计，在200～700nm波长范围内进行扫描。结果供试品溶液与对照品溶液在310nm波长处有最大吸收，故确定测定波长为310nm。
3、标准曲线的绘制
精密移取对照品溶液0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8mL各2份(一份做空白，一份做显色)，转移至10mL的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇，显色组加入5ml的高氯酸，摇匀，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却15min，随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计，在200-500nm波长扫描，在310nm波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，常春藤皂苷元对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，以吸收度A对浓度C作最小二乘法回归，得标准曲线方程为：C＝0.022A+0.045，R2＝0.999(n＝4)，线性范围为7.0～34.3μg/mL，质量浓度与吸收度值的线性关系良好。
4、样品中皂苷类成分含量测定方法
取白头翁药材适量，粉碎，称取药材34.90g，用10倍量70％乙醇(即350ml)，提取2次，每次1.5小时，所得溶液用中速滤纸过滤，浓缩至100ml以下，转移至100ml的容量瓶，定容至刻度，即得0.349g/ml的白头翁提取物；移取白头翁提取液1ml，转移至250ml的容量瓶中，定容至刻度，即得1.396mg/ml的白头翁供试品溶液。精密吸取供试品溶液1ml，2份(一份做空白，一份做显色)，加入标号的干燥的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇，显色组加入5ml的高氯酸，摇匀，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却15min，随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计，在200-500nm波长扫描，在310nm处测定其吸收度。由标准曲线求得白头翁有效组分样品中总皂苷浓度并计算含量。
白头翁提取物的制备方法，将白头翁药材粉碎成粗粉，用10-95％乙醇浸泡0.5-2h，6-12倍量加热回流提取2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液；上述滤液于50-70℃减压浓缩至0.5-1.0g生药材/mL，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，有机溶剂萃取，回收有机溶剂，残留物用适量水溶解，滤过，滤液上大孔吸附树脂柱，上样后依次用6-12倍量蒸馏水、20-40％乙醇洗脱，50-80％乙醇洗脱，洗脱流速为1.0-2.0ml/min，收集50-80％乙醇洗脱液；上述乙醇洗脱液于50-70℃减压浓缩至无乙醇味，浓缩液0-4℃冷藏过夜，滤过，滤液中加入生药量5-15％的聚酰胺，搅拌0.5-4h，静置4-12h，滤过，滤液中再加入活性炭，搅拌0.5-4h，静置4-12h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，收集喷干粉，即得白头翁活性组分。其中大孔树脂可以选择各种型号的皂苷类吸附树脂，包括D4020型、NKA-9型、AB-8型、ZTC型、D101型及ADS-F8型，优选D101型和D101C型大孔树脂。
本发明白头翁提取物可以用于制备人或其它哺乳动物血吸虫病的预防治疗，该有效组分可以作为活性成分与药物载体配制成药剂学上的各种制剂，白头翁有效组分在制剂中的分散状态可以是液体，也可以是固体，该制剂的给药途径可以是口服、注射和局部给药。
白头翁抗肿瘤活性组分中化学成分的HPLC标定
1、混合对照品溶液的制备：将15种皂苷类成分对照品，精密称定各约10～20mg，分别置于5mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，作为储备液，精密量取各储备液2mL，分别置于25mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，作为每种对照品溶液；精密量取各储备液2mL，置于同一个25mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，作为15种对照品溶液。
2、供试品溶液的制备：取白头翁抗肿瘤活性组分粉末约50mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，滤过，取续滤液10mL作为供试品溶液。
3、色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇-水梯度洗脱(甲醇：0min为50％，90min为80％，120min为80％)；UV检测波长203nm，流速：1.0mL/min；柱温：35℃；进样量20ml；ELSD检测器：SHIMADZU ELSD-LT Ⅱ型检测器；检测温度：40℃；ELSD载气：高纯氮气：载气压力：0.35MPa。15种对照品溶液液相色谱图(图1)和供试品溶液的液相色谱图(图2)其中：1为3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖春藤皂苷元28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，2为白头翁苷皂E，3为3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖-3β-羟基-20(29)-烯-羽扇豆烷-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→4)-β-D-喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷，4为齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷，5为白头翁皂苷B，6为齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷，7为白头翁皂苷B4，8为3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，9为常春藤皂苷元28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，10为3β，23-二羟基羽扇豆烷-Δ20(29)烯-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，11为白头翁皂苷B，12为常春藤皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷，13为常春藤皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷，14为齐墩果酸-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖-(1→3)-[α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)]-β-D-吡喃阿拉伯糖苷，15为常春藤皂苷元-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖-(1→3)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃阿拉伯糖苷。
附图说明
图1.15种皂苷对照品液相色谱图；
图2.供试品溶液液相色谱图。
具体实施例
实施例1、白头翁提取物的制备方法，其中：将白头翁药材粉碎成粗粉，用50％乙醇浸泡0.5h，12倍量加热回流提取3次，每次1.5h，过滤，合并滤液。上述滤液于70℃减压浓缩至1.0g生药材/mL，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤液再用正丁醇萃取，减压回收正丁醇，残留物用水溶解并稀释至浓度为1.0g生药材/mL，滤过，滤液上D101大孔吸附树脂柱，上样量为40mg总皂苷/g湿树脂，上样液总皂苷浓度10mg/ml、上样流速1.0ml/min、上样液pH值为7.0，上样后依次用12倍量蒸馏水、30％乙醇洗脱，60％乙醇洗脱洗脱流速为1.5ml/min，收集60％乙醇洗脱液。上述洗脱液于70℃减压浓缩至无乙醇味(相对密度为1.07g/ml(50～60℃))，浓缩液0-4℃冷藏过夜，滤过，滤液中加入生药量5％的聚酰胺，搅拌2h，静置12h，滤过，滤液中再加入生药量2％的活性炭，搅拌2h，静置12h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，进风温度为140℃，出风温度为90℃，收集喷干粉，即得。经BTS皂苷检测法检测，总皂苷含量为74％。
实施例2、白头翁提取物的制备方法，其中：将白头翁药材粉碎成粗粉，用50％乙醇浸泡0.5h，12倍量加热回流提取3次，每次1.5h，过滤，合并滤液。上述滤液于70℃减压浓缩至1.0g生药材/mL，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤液再用正丁醇萃取，减压回收正丁醇，残留物用水溶解并稀释至浓度为1.0g生药材/mL，滤过，滤液上AB-8大孔吸附树脂柱，上样量为40mg总皂苷/g湿树脂，上样液总皂苷浓度10mg/ml、上样流速1.0ml/min、上样液pH值为7.0，上样后依次用12倍量蒸馏水、20％乙醇洗脱，60％乙醇洗脱洗脱流速为1.5ml/min，收集60％乙醇洗脱液。上述洗脱液于70℃减压浓缩至无乙醇味(相对密度为1.07g/ml(50～60℃))，浓缩液0-4℃冷藏过夜，滤过，滤液中加入生药量5％的聚酰胺，搅拌2h，静置12h，滤过，滤液中再加入生药量2％的活性炭，搅拌2h，静置12h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，进风温度为140℃，出风温度为90℃，收集喷干粉，即得。经BTS皂苷检测法检测，总皂苷含量为78％。其余同实施例1。
实施例3：白头翁提取物的制备方法，其中：将白头翁药材粉碎成粗粉，用50％乙醇浸泡0.5h，12倍量加热回流提取3次，每次1.5h，过滤，合并滤液。上述滤液于70℃减压浓缩至1.0g生药材/mL，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤液上HPD-450大孔吸附树脂柱，上样量为40mg总皂苷/g湿树脂，上样液总皂苷浓度10mg/ml、上样流速1.0ml/min、上样液pH值为7.0，上样后依次用12倍量蒸馏水、20％乙醇洗脱，60％乙醇洗脱洗脱流速为1.5ml/min，收集60％乙醇洗脱液。上述洗脱液于70℃减压浓缩至无乙醇味(相对密度为1.07g/ml(50～60℃))，浓缩液0-4℃冷藏过夜，滤过，滤液中加入生药量5％的聚酰胺，搅拌2h，静置12h，滤过，滤液中再加入生药量2％的活性炭，搅拌2h，静置12h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，进风温度为140℃，出风温度为90℃，收集喷干粉，即得。经BTS皂苷检测法检测，总皂苷含量为80％。其余同实施例1。
实施例4、白头翁提取物的制备方法，其中：将白头翁药材粉碎成粗粉，用10％乙醇浸泡0.5h，6倍量加热回流提取2次，每次1h，过滤，合并滤液；上述滤液于50℃减压浓缩至0.5g生药材/mL，0℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤液再用正丁醇有机溶剂萃取，回收有机溶剂，残留物用适量水溶解，滤过，滤液上大孔吸附树脂柱，上样后依次用6倍量蒸馏水、20％乙醇洗脱，50％乙醇洗脱，洗脱流速为1.0ml/min，收集50％乙醇洗脱液；上述乙醇洗脱液于50℃减压浓缩至无乙醇味，浓缩液0℃冷藏过夜，滤过，滤液中加入生药量5％的聚酰胺，搅拌0.5h，静置4h，滤过，滤液中再加入活性炭，搅拌0.5h，静置4h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，收集喷干粉，即得白头翁活性组分。经BTS皂苷检测法检测，总皂苷含量为82％。其余同实施例1。
实施例5、白头翁提取物的制备方法，其中：将白头翁药材粉碎成粗粉，用95％乙醇浸泡2h，12倍量加热回流提取3次，每次3h，过滤，合并滤液；上述滤液于70℃减压浓缩至1.0g生药材/mL，4℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤液再用正丁醇有机溶剂萃取，回收有机溶剂，残留物用适量水溶解，滤过，滤液上大孔吸附树脂柱，上样后依次用12倍量蒸馏水、40％乙醇洗脱，70％乙醇洗脱，洗脱流速为2.0ml/min，收集70％乙醇洗脱液；上述乙醇洗脱液于70℃减压浓缩至无乙醇味，浓缩液4℃冷藏过夜，滤过，滤液中加入生药量15％的聚酰胺，搅拌4h，静置12h，滤过，滤液中再加入活性炭，搅拌4h，静置12h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，收集喷干粉，即得白头翁活性组分。经BTS皂苷检测法检测，总皂苷含量为77％。其余同实施例1。
实施例6、白头翁提取物的制备方法，其中：将白头翁药材粉碎成粗粉，用50％乙醇浸泡1h，8倍量加热回流提取2.5次，每次2h，过滤，合并滤液；上述滤液于60℃减压浓缩至0.7g生药材/mL，3℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤液再用正丁醇有机溶剂萃取，回收有机溶剂，残留物用适量水溶解，滤过，滤液上大孔吸附树脂柱，上样后依次用8倍量蒸馏水、30％乙醇洗脱，60％乙醇洗脱，洗脱流速为1.5ml/min，收集60％乙醇洗脱液；上述乙醇洗脱液于60℃减压浓缩至无乙醇味，浓缩液3℃冷藏过夜，滤过，滤液中加入生药量10％的聚酰胺，搅拌3h，静置6h，滤过，滤液中再加入活性炭，搅拌3h，静置6h，滤过，滤液用喷雾干燥法进行干燥，收集喷干粉，即得白头翁活性组分。经BTS皂苷检测法检测，总皂苷含量为75％。其余同实施例1。
实施例7、白头翁提取物的制备方法，其中：所述的大孔吸附树脂可以是D4020型、NKA-9型、AB-8型、ZTC型、HPD型、D101型、D101C型及ADS-F8型吸附树脂中的一种或两种以上。其余同实施例1、2、3、4、5、6中的任意一项。
实施例8、白头翁提取物的制备方法，其中：所述的大孔吸附树脂可以是优选D101型和D101C型大孔吸附树脂。其余同实施例4、5、6中的任意一项。
实施例9、白头翁提取物在制备抗血吸虫药物中的应用，其中：白头翁提取物中皂苷类成分含量为70％以上。其余同实施例1、2、3、4、5、6、7、8中的任意一项。
实施例10、白头翁提取物制成的制剂，其中：该白头翁提取物与药物辅料配制成药剂学上的各种制剂。其余同实施例1、2、3、4、5、6、7、8中的任意一项。
实施例11、白头翁提取物制成的制剂，其中：该白头翁活性组分在制剂中的分散状态可以是液体，也可以是固体。其余同实施例10。
实施例12、白头翁提取物，其中：该制剂的给药途径可以是口服、注射和局部给药。其余同实施例10。
实施例13、用本发明实施例1或实施例2或实施例3或实施例4或实施例5实施例6或实施例7或实施例8的方法制备的白头翁提取物为原料，进行下列制剂制备：
1、片剂制备
处方(50片)：
成分 重量(g)
本发明提取物 5.0
乳糖 4.8
糊精 9
微晶纤维素 6
硬脂酸镁 0.2
按照常规片剂的操作方法，以上混合均匀，湿法制粒，最后加入硬脂酸镁混合均匀压制成每片500mg。
2、胶囊制备
处方(90粒)：
成分 重量(g)
本发明提取物 8
乳糖 5
糊精 9
微晶纤维素 5
按照常规片剂的操作方法，以上混合均匀，湿法制粒，灌装成胶囊，每粒300mg。
3、巴布剂制备
处方：
成分 重量(g)
本发明提取物 2
聚丙烯酸酯 18
月桂氮卓酮 0.6
月桂酸 1.8
丙二醇 5.4
乙酸乙酯 15
按照通常巴布剂的做作进行，将上述搅拌均匀，涂布于聚酯防粘层上，60度干燥2分钟后，覆盖聚氨基甲酯膜背衬层，切片即可。
4、粉针剂制备
处方：
成分 重量(g)
本发明提取物 0.05
盐酸 适量
甘露醇 50
按照常规冻干粉针的操作进行，将本发明有效组分加适量注射用水溶解，加入甘露醇，定容至1000ml，调节PH值至4.0-5.5之间，除菌过滤，冷冻干燥即得。
5、水针剂的制备
白头翁提取物，溶于适量注射用水中，加入计量的注射用水溶性辅料，加0.1-0.5％的活性炭除去热原，调节PH至6.0-7.5，经微孔滤膜超滤后，补充注射用水至规定量，灌装于安瓿瓶中或输液瓶中，熔封/轧盖，经检验合格后，包装即得。
6、滴丸剂制备
处方：
成分 重量(g)
本发明提取物 0.1g
聚乙二醇6000 10g
聚乙二醇4000 20g
聚山梨酯80 0.3g
乙醇 1ml
制成 1000丸
制法：将本发明提取物解于乙醇中充分溶解，成为白头翁抗血吸虫活性部位分散乙醇液，加入已熔融的聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、聚山梨酯80组成的基质中，充分搅拌至均匀，以二甲基硅油为冷却剂，15℃下滴制成丸，擦丸，干燥，即得。
7、溶液剂制备
处方：
成分 重量(g)
本发明提取物 10.0
蒸馏水 1000ml
防腐剂 适量
按照常规溶液剂的操作进行，将本发明提取物加适量蒸馏水溶解，加入防腐剂，定容至1000ml，4℃冷藏过夜，滤过，即得。
实施例14、用本发明实施例1中的方法制备的活性组分为原料，进行抗血吸虫活性组分药效学研究。
1.体外对血吸虫成虫雌雄合抱体的杀灭作用
取白头翁提取物(BTS)适量，加入蒸馏水配置成不同浓度的待试品溶液，备用。取成虫雌雄合抱体适量，无菌灌注冲虫后，按成虫雌雄合抱体培养条件，加入2ml培养液体外培养，并每皿加入62.5ug/ml BTS药液0.02ml。一天后观察雌雄解离，虫体死亡。未加药组正常，雌雄合抱，活力正常。
2.体内对血吸虫的杀灭作用
取昆明种小鼠，每只小鼠感染80条尾蚴，20天后以不同浓度(2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml，0.125mg/ml)BTS药液连续灌胃五天，每次1ml。42天后剖杀。与青蒿琥脂组剂量(300mg/kg，一次灌服)比较其中2mg/ml浓度BTS组效果明显优于青蒿琥脂组。肝脏病变肉眼观察质软，粟粒结节较少。
取昆明种小鼠，每只小鼠感染80条尾蚴，22天后以不同浓度(2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml，0.125mg/ml)BTS药液连续灌胃五天，每次1ml。药物对照组用吡喹酮。42天后剖杀，结果表明BTS具有明显的抗血吸虫活性。
3.体外对血吸虫尾蚴的杀灭作用
取白头翁提取物BTS)适量，加入蒸馏水配置成不同浓度的待试品溶液，分别加入24孔板，对照加入脱氯水，加入活尾蚴过夜观察。结果表明BTS对血吸虫尾蚴.的最低杀灭浓度达到0.031ug/ml。4.体外对血吸虫毛蚴的杀灭作用
取白头翁提取物(BTS)适量，加入蒸馏水配置成不同浓度的待试品溶液，分别加入24孔板，对照加入脱氯水，加入活毛蚴过夜观察。结果表明BTS对血吸虫毛蚴.的最低杀灭浓度达到0.031ug/ml。5.体外对血吸虫虫卵的杀灭作用
取感染42天后的老鼠肝脏，匀浆后1.2％盐水经不同目数筛网过滤，取卵加入EP管离心，加入不同浓度的BTS药液，放置一天，对照组加入脱氯水。离心后，用脱氯水迅速洗涤。将洗涤后的虫卵加入脱氯水混匀25°孵育一小时观察是否有毛蚴孵出。一天后再继续观察是否有毛蚴孵出。结果表明BTS对血吸虫虫卵.的最低杀灭浓度达到0.031ug/ml。
6.体外对钉螺的杀灭作用
取白头翁提取物(BTS)适量，加入蒸馏水配置成不同浓度的待试品溶液，加入大试管，每管放入钉螺二十只，管口在液面下一厘米处放入筛网防钉螺爬出，分别在24，48，72hr后取出，脱氯水清洗后观察活钉螺数。结果表明BTS对血吸虫虫卵.的最低杀灭浓度达到0.031ug/ml。
7.体外对鱼类的毒性
取白头翁提取物(BTS)适量，加入湖水配置成不同浓度的待试品溶液，将鲫鱼、鳝鱼、黑鱼(每种3-5条)等常见鱼类加入其中养殖，24小时后，观察鱼类的活动情况，结果表明0.1mg/mL浓度条件下对上述几种鱼类的活动没有明显影响。
8.半数致死量
采用抗血吸虫的白头翁提取物的粉末，用蒸馏水配制成所需浓度的溶液，采用清洁级小鼠，由苏州大学实验动物中心提供。急性毒性实验结果表明白头翁有效组分口服时的半数致死量为3.56g/kg(n＝20)，腹腔注射时的半数致死量为0.165g/kg(n＝20)。
实施例15、采用实施例2或实施例3或实施例4或实施例5实施例6或实施例7或实施例8的方法制备的白头翁提取物进行抗血吸虫药效学研究，效果与实施例14类似。
实施例16、采用实施例2或实施例3或实施例4或实施例5实施例6或实施例7或实施例8的方法制备的白头翁提取物与药物辅料配制成药剂学上的各种制剂。
实施例17、采用实施例16所述的白头翁提取物制成的制剂，其中：白头翁提取物作为抗血吸虫活性组分在制剂中的分散状态可以是液体，也可以是固体。
实施例18、根据实施例4或5或6或9所述的白头翁提取物制成的制剂，其中：白头翁提取物作为抗血吸虫活性组分制成的制剂的给药途径可以是喷洒、口服、注射和局部给药。
实施例19、根据实施例4或5或6或7或8所述的任意一种白头翁提取物作为抗血吸虫活性组分，其中：白头翁提取物作为抗血吸虫活性组分可以用于制备人或其它哺乳动物血吸虫病的预防或治疗药物。
Claims (9)
1.白头翁提取物的制备方法，其特征在于：将白头翁药材粉碎成粗粉，经过提纯后获得的白头翁抗血吸虫活性组分中皂苷类成分含量为70％以上；预知子抗血吸虫活性组分中皂苷类成分含量的测定方法如下：
A、常春藤皂苷元对照品溶液的制备
精密称取常春藤皂苷元对照品5mg于50mL容量瓶中，以甲醇溶解，定容，配成0.1mg/mL的标准品溶液，冷藏保存备用。
B、常春藤皂苷元最大吸收波长的确定
精密吸取对照品溶液1ml，2份(一份做空白，一份做显色)，加入标号的干燥的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇，显色组加入5ml的高氯酸，摇匀，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却15min，随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计，在200～700nm波长范围内进行扫描。结果供试品溶液与对照品溶液在310nm波长处有最大吸收，故确定测定波长为310nm。
C、标准曲线的绘制
精密移取对照品溶液0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8mL各2份(一份做空白，一份做显色)，转移至10mL的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇，显色组加入5ml的高氯酸，摇匀，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却15min，随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计，在200-500nm波长扫描，在310nm波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，常春藤皂苷元对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，以吸收度A对浓度C作最小二乘法回归，得标准曲线方程为：C＝0.022A+0.045，R2＝0.999(n＝4)，线性范围为7.0～34.3μg/mL，质量浓度与吸收度值的线性关系良好。
D、样品中皂苷类成分含量测定方法
取白头翁药材适量，粉碎，称取药材34.90g，用10倍量70％乙醇(即350ml)，提取2次，每次1.5小时，所得溶液用中速滤纸过滤，浓缩至100ml以下，转移至100ml的容量瓶，定容至刻度，即得0.349g/ml的白头翁提取物；移取白头翁提取液1ml，转移至250ml的容量瓶中，定容至刻度，即得1.396mg/ml的白头翁供试品溶液。精密吸取供试品溶液1ml，2份(一份做空白，一份做显色)，加入标号的干燥的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇，显色组加入5ml的高氯酸，摇匀，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却15min，随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计，在200-500nm波长扫描，在310nm处测定其吸收度。由标准曲线求得白头翁有效组分样品中总皂苷浓度并计算含量。
2.白头翁提取物的制备方法，其特征在于：将白头翁药材粉碎成粗粉，用10-95％乙醇浸泡0.5-2h，6-12倍量加热回流提取2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液。上述滤液于50-70℃减压浓缩至0.5-1.0g生药材/mL，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤液上大孔吸附树脂柱，收集50-80％乙醇洗脱液，脱色，回收溶剂，用喷雾干燥法、真空微波干燥法或其它方法进行干燥，收集干浸膏或喷干粉，即得白头翁提取物，白头翁抗血吸虫活性组分中皂苷类成分含量为70％以上，白头翁抗血吸虫活性组分中皂苷类成分含量的测定方法如下：
A、常春藤皂苷元对照品溶液的制备
精密称取常春藤皂苷元对照品5mg于50mL容量瓶中，以甲醇溶解，定容，配成0.1mg/mL的标准品溶液，冷藏保存备用。
B、常春藤皂苷元最大吸收波长的确定
精密吸取对照品溶液1ml，2份(一份做空白，一份做显色)，加入标号的干燥的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇，显色组加入5ml的高氯酸，摇匀，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却15min，随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计，在200～700nm波长范围内进行扫描。结果供试品溶液与对照品溶液在310nm波长处有最大吸收，故确定测定波长为310nm。
C、标准曲线的绘制
精密移取对照品溶液0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8mL各2份(一份做空白，一份做显色)，转移至10mL的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇，显色组加入5ml的高氯酸，摇匀，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却15min，随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计，在200-500nm波长扫描，在310nm波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，常春藤皂苷元对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，以吸收度A对浓度C作最小二乘法回归，得标准曲线方程为：C＝0.022A+0.045，R2＝0.999(n＝4)，线性范围为7.0～34.3μg/mL，质量浓度与吸收度值的线性关系良好。
D、样品中皂苷类成分含量测定方法
取白头翁药材适量，粉碎，称取药材34.90g，用10倍量70％乙醇(即350ml)，提取2次，每次1.5小时，所得溶液用中速滤纸过滤，浓缩至100ml以下，转移至100ml的容量瓶，定容至刻度，即得0.349g/ml的白头翁提取物；移取白头翁提取液1ml，转移至250ml的容量瓶中，定容至刻度，即得1.396mg/ml的白头翁供试品溶液。精密吸取供试品溶液1ml，2份(一份做空白，一份做显色)，加入标号的干燥的具塞试管中，于60摄氏度真空干燥箱中挥干，空白组加入5ml的甲醇，显色组加入5ml的高氯酸，摇匀，显色组于70摄氏度水浴中反应15min，并时时振摇，反应完全后立即置冰水浴中冷却15min，随行试剂为空白，于岛津UV-2550紫外分光光度计，在200-500nm波长扫描，在310nm处测定其吸收度。由标准曲线求得白头翁有效组分样品中总皂苷浓度并计算含量。
3.白头翁提取物的制备方法，其特征在于：将白头翁药材粉碎成粗粉，用10-95％乙醇浸泡0.5-2h，6-12倍量加热回流提取2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液。上述滤液于50-70℃减压浓缩至0.5-1.0g生药材/mL，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤液上大孔吸附树脂柱，收集50-80％乙醇洗脱液，脱色，回收溶剂，用喷雾干燥法、真空微波干燥法或其它方法进行干燥，收集干浸膏或喷干粉，即得白头翁提取物。
4.白头翁提取物的制备方法，其特征在于：将白头翁药材粉碎成粗粉，用6-12倍量的水加热回流提取2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液；上述滤液于50-70℃减压浓缩至0.5-1.0g生药材/mL，0-4℃冷藏过夜，析胶，滤过，滤液上大孔吸附树脂柱，收集50-80％乙醇洗脱液，脱色，回收溶剂，用喷雾干燥法、真空微波干燥法或其它方法进行干燥，收集干浸膏或喷干粉，即得白头翁提取物。
5.白头翁提取物在制备抗血吸虫有效组分中的应用，其特征在于：白头翁提取物中的白头翁活性组分中皂苷类成分含量为70％以上。
6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的白头翁提取物，其特征在于：白头翁提取物可以作为抗血吸虫活性成分与药物辅料配制成药剂学上的各种制剂。
7.根据权利要求4所述的白头翁提取物制成的制剂，其特征在于：白头翁提取物作为抗血吸虫活性组分在制剂中的分散状态可以是液体，也可以是固体。
8.根据权利要求1或2或3或4所述的白头翁提取物制成的制剂，其特征在于：白头翁提取物作为抗血吸虫活性组分制成的制剂的给药途径可以是喷洒、口服、注射和局部给药。
9.根据权利要求1或2或3或4或5所述的任意一种白头翁提取物作为抗血吸虫活性组分，其特征在于：头翁提取物作为抗血吸虫活性组分可以用于制备人或其它哺乳动物血吸虫病的预防或治疗药物。
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