CN102631361A - 齐墩果烷型皂苷在制备治疗和/或预防血吸虫病药物中的应用 - Google Patents

齐墩果烷型皂苷在制备治疗和/或预防血吸虫病药物中的应用 Download PDF

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CN102631361A CN2012100368086A CN201210036808A CN102631361A CN 102631361 A CN102631361 A CN 102631361A CN 2012100368086 A CN2012100368086 A CN 2012100368086A CN 201210036808 A CN201210036808 A CN 201210036808A CN 102631361 A CN102631361 A CN 102631361A
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Abstract

本发明涉及医药领域,具体涉及齐墩果烷型皂苷在制备治疗和/或预防血吸虫病药物中的应用。3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯具有较强的抗血吸虫作用。

Description

齐墩果烷型皂苷在制备治疗和/或预防血吸虫病药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药领域,特别涉及3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯在制备治疗和/或预防血吸虫病药物中的应用。 
背景技术
血吸虫病是一种人和动物都能受传染的寄生虫病。血吸虫的生活史比较复杂。成虫寄生在人、牛、猪或其它哺乳动物的肠系膜静脉和门静脉的血液中,因此人和这类动物被称为成虫宿主或终宿主。 
虫卵从宿主的粪便中排出,如粪便进入河水,虫卵便在水中孵化成毛蚴。毛蚴并不感染人,而要先钻进钉螺体内寄生,钉螺被称为中间宿主。一条毛蚴在钉螺体内可发育、繁殖成上万条尾蚴。尾蚴离开钉螺后在浅表的水面下活动,遇到人或哺乳动物的皮肤便钻人体内,进入血液,使人或动物感染血吸虫病。有尾蚴的水称为疫水。在我国的血吸虫病流行区,人、牛和不圈养的猪是主要的传染源。不论男女老少都容易感染血吸虫病。不经药物治疗,血吸虫病不可能自然痊愈,得过病后也不产生免疫力,治愈后的人如接触疫水,还可以再次得病。 
血吸虫发育的不同阶段,尾蚴、童虫、成虫和虫卵均可对宿主引起不同的损害和复杂的免疫病理反应。由于各期致病因子的不同,宿主受累的组织、器官和机体反应性也有所不同,引起的病变和临床表现亦具有相应的特点和阶段性。 
尾蚴及童虫所致损害尾蚴穿过皮肤可引起皮炎,局部出现丘疹和瘙痒,是一种速发型和迟发型变态反应。病理变化为毛细血管扩张充血,伴有出血、水肿,周围有中性粒细胞和单核细胞浸润。实验证明,感染小鼠的血清和淋巴细胞被动转移到正常小鼠,再用尾蚴接种(初次接触 尾蚴),也可产生尾蚴性皮炎。说明这种免疫应答在早期是抗体介导的。 
童虫在宿主体内移行时,所经过的器官(特别是肺)出现血管炎,毛细血管栓塞、破裂,产生局部细胞浸润和点状出血。当大量童虫在人体移行时,患者可出现发热、咳嗽、痰中带血、嗜酸性粒细胞增多,这可能是局部炎症及虫体代谢产物引起的变态反应。 
成虫所致损害成虫一般无明显致病作用,少数可引起轻微的机械性损害,如静脉内膜炎等。可是,它的代谢产物、虫体分泌物、排泄物、虫体外皮层更新脱落的表质膜等,在机体内可形成免疫复合物,对宿主产生损害。 
虫卵所致的损害血吸虫病的病变主要由虫卵引起。虫卵主要是沉着在宿主的肝及结肠肠壁等组织,所引起的肉芽肿和纤维化是血吸虫病的主要病变。 
随着病程发展,卵内毛蚴死亡,其毒素作用逐渐消失,坏死物质被吸收,虫卵破裂或钙化,其周围绕以类上皮细胞、淋巴细胞、异物巨细胞,最后类上皮细胞变为成纤维细胞,并产生胶原纤维,肉芽肿逐渐发生纤维化,形成疤痕组织。 
白头翁药材取自毛茛科白头翁属植物白头翁(Pulsatillachinensis(Bunge)Regel)的干燥根,味苦,性寒。归胃、大肠经,具清热解毒,凉血止痢的功效。用于热毒血痢,阴痒带下,阿米巴痢。白头翁属植物具有广泛的药理及生物活性,主要表现在抗肿瘤、抗炎抗菌、抗病毒、细胞凋亡、抗生物酶、杀虫、杀精等作用。研究发现白头翁煎剂对杀灭溶组织内阿米巴的效果较好。目前,还未发现白头翁药材及其有效组分具有抗血吸虫活性的文献报道。 
研究发现,白头翁中含原白头翁素(Protoanemonin)、白头翁素(Anemonin)、白头翁灵(Okinalin,C32H46O2)、白头翁英(Okinalein,C4H6O2)等,近年来国内外学者从白头翁属植物中分离鉴定出几十种五环三萜皂苷成分,这些皂苷主要为齐墩果烷型和羽扇豆烷型两种。 
3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯为齐墩果烷型皂苷中的一种,结构如 式I所示。 
Figure BDA0000136552910000031
式I 
本发明提供齐墩果酸双糖皂苷衍生物3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯在制备治疗和/或预防血吸虫病药物中的应用,具有现实意义。 
发明内容
有鉴于此,本发明提供3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯在制备治疗和/或预防血吸虫病药物中的应用。3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯具有较强的抗血吸虫作用。 
本发明提供了3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯在制备治疗和/或预防血吸虫病药物中的应用。 
作为优选,本发明提供的应用中,3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯制备治疗和/或预防血吸虫病的药物包括3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯及药学上可接受的辅料。 
作为优选,本发明提供的药物可以为片剂、胶囊剂、滴丸剂、溶液剂或注射剂。 
优选地,本发明提供的药物为注射剂。 
优选地,本发明提供的注射剂为冻干粉针剂或水针剂。 
本发明还提供了含有3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯的白头翁提取物在制备治疗和/或预防血吸虫病药物中的应用。 
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案: 
本发明提供3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯在制备治疗和/或预防血吸虫病药物中的应用。3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯体外药物浓度200.0μg/ml时,20例尾蚴均在1分钟内100%死亡;20例毛蚴均在1分钟内100%死亡;20例虫卵在1小时和24小时卵出生率均为0;20例成虫用药后24h即有50%的虫体死亡,洗涤后48h时虫体已全部死亡;3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯剂量为200mg/Kg,连续对小鼠尾静脉注射5天,小鼠体内血吸虫减虫率达到100%。试验表明,3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯具有较强的抗血吸虫作用。 
附图说明
图1示3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯的核磁共振氢谱图; 
图2示3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯的核磁共振碳谱图。 
具体实施方式
本发明公开了3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖 齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯在制备治疗和/或预防血吸虫病药物中的应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。 
本发明提供的3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯在制备治疗和/或预防血吸虫病药物中的应用中,所用试剂均可由市场购得。 
下面结合实施例,进一步阐述本发明: 
实施例1药效试验 
鉴定: 
为白色无定形粉末,硫酸乙醇显紫红色斑点,醋酐-浓硫酸反应阳性,Molish反应阳性,提示该化合物可能为皂苷类化合物。化合物I用2N TFA完全酸水解得到齐墩果酸皂苷元和单糖,糖经衍生化后进行GC分析,检测到L-阿拉伯糖、L-鼠李糖和D-葡萄糖的存在。 
13C NMR谱共显示59个碳信号,包括30个苷元碳信号。其中苷元碳信号与齐墩果酸苷元基本一致。3位碳向低场位移至δ88.43,28位羰基碳信号在δ176.65,说明该化合物为双糖链苷,苷元的3位和28位分别连接了糖链。 13C NMR谱中出现了五个糖信号,结合NMR数据和水解衍生化后的GC分析结果,证明其分别为1个L-阿拉伯糖、1个L-鼠李糖和3个D-葡萄糖。另外,13C NMR谱中显示,在δ105.43、101.71、107.01、95.82和105.55位置出现五个糖对应的端基碳信号。经过对其13C NMR谱和1H NMR谱数据进行综合分析,确定其结构为3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯。 
13C NMR谱数据归属见表1。 
表1 13C NMR谱数据 
  No   δ   No   δ   No   δ   No   δ
  1   39.07   16   23.52   C3-O-     C28-O-  
  2   26.79   17   47.18   Ara-1′   105.43   Glc-1″″   95.82
  3   88.43   18   41.81   2′   76.09   2″″   74.05
  4   39.74   19   46.38   3′   74.67   3″″   78.89
  5   56.13   20   30.89   4′   69.51   4″″   71.10
  6   18.65   21   34.13   5′   65.94   5″″   78.12
  7   33.25   22   32.68   Rha-1″   101.71   6″″   69.57
  8   40.04   23   28.35   2″   71.66   Glc-1″″′   105.55
  9   48.21   24   17.33   3″   83.44   2″″′   75.30
  10   37.18   25   15.81   4″   73.16   3″″′   78.54
  11   23.93   26   17.61   5″   69.91   4″″′   71.86
  12   123.00   27   26.21   6″   18.62   5″″′   78.65
  13   144.28   28   176.65   Glc-1″′   107.01   6″″′   62.78
  14   42.27   29   33.25   2″′   75.72    
  15   28.43   30   23.81   3″′   78.59    
          4″′   71.61    
          5″′   78.75    
          6″′   62.62    
将3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯用脱氯水配制成不同浓度的待试品溶液,分别加入96孔板中,按每孔加入尾蚴20条培养,空白对照组为脱氯水,观察尾蚴的生存情况。结果表明,3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯体外药物浓度200.0μg/ml时,20例尾蚴均在1分钟内100%死亡。 
将3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸 -28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯用脱氯水配制成不同浓度的待试品溶液,分别加入96孔板中,按每孔加入毛蚴20条培养,空白对照组为脱氯水,观察毛蚴的生存情况。结果表明,3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯体外药物浓度200.0μg/ml时,20例毛蚴均在1分钟内100%死亡。 
将3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯用脱氯水配制成不同浓度的待试品溶液,分别加入96孔板中,按每孔加入虫卵20条培养,空白对照组为脱氯水,观察虫卵的孵化情况。结果表明,3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯体外药物浓度200.0μg/ml时,20例虫卵在1小时和24小时卵出生率均为0。 
将3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯用生理盐水配制成不同浓度的待试品溶液,分别加入12孔板中,空白对照组为生理盐水,按血吸虫成虫培养条件加入活的血吸虫成虫10条培养过夜,观察血吸虫成虫的生存情况。结果表明3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯对血吸虫成虫的最低杀灭浓度达到200.0μg/mL,光镜下观察表明3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯使血吸虫成虫虫体形成空泡死亡。未加药组活力正常,结果见表2。 
表23-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯对成虫的杀灭作用(in vitro) 
Figure BDA0000136552910000071
3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯体外药物浓度200.0μg/ml时,20例成虫用药后24h即有50%的虫体死亡,洗涤后48h时虫体已全部死亡。 
将小鼠感染60条尾蚴后22天,分别尾静脉注射皂苷单体连续5天,感染52天后剖杀动物,取虫。皂苷单体(200mg/kg,i.v,连续给药5d)剂量组对血吸虫成虫的减虫率优于青蒿琥脂(400mg/kg,i.g.,连续给药3d)对照组,与吡喹酮(400mg/kg,i.g.,连续给药3d)对照组相当。结果见表3,小鼠体内对血吸虫作用:3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯剂量为200mg/Kg,连续尾静脉注射5天,减虫率达到100%,重复三次试验,结果相近。 
表3 3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯对血吸虫成虫的杀灭作用(in vivo) 
Figure BDA0000136552910000082
*P<0.05,**P<0.01与空白对照组相比。 
实施例2片剂的制备 
3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯    5.0g 
乳糖                                 4.8g 
糊精                                 9.0g 
微晶纤维素                           6.0g 
硬脂酸镁                             0.2g 
按照常规片剂的操作方法,以上混合均匀,湿法制粒,最后加入硬脂酸镁混合均匀压制成片剂,共50片,每片500mg。 
实施例3胶囊剂的制备 
3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯    8.0g 
乳糖                                 5.0g 
糊精                                 9.0g 
微晶纤维素                           5.0g 
按照常规片剂的操作方法,以上混合均匀,湿法制粒,灌装成胶囊,工90粒,每粒300mg。 
实施例4注射用粉针剂的制备 
3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯    1.0g 
盐酸                                 0.5ml 
甘露醇                               10.0g 
按照常规冻干粉针的操作进行,将3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯加800ml注射用水溶解,加入甘露醇10.0g,定容至1000ml,调节pH值至5.0-6.5之间,除菌过滤,冷冻干燥即得。 
实施例5注射用水针剂的制备 
取3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯1.0g溶于100ml注射用水中,加0.1-0.5%的活性炭除去热原,调节pH值至6.0-7.5,经微孔滤膜超滤后,补充注射用水至1000ml,灌装于安瓿瓶中或输液瓶中,熔封/轧盖,经检验合格后,包装即得。 
实施例6滴丸剂的制备 
3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯    0.1g 
聚乙二醇6000                         10.0g 
聚乙二醇4000                         20.0g 
聚山梨酯80                           0.30g 
乙醇                                 1ml 
制法:将3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯溶解于乙醇中溶解,加入已熔融的聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、聚山梨酯80组成的基质中,充分搅拌至均匀,以二甲基硅油为冷却剂,15℃下滴制成丸,擦丸,干燥,即得滴丸1000丸。 
实施例7溶液剂的制备 
3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯    10.0g 
蒸馏水                               1000ml 
尼泊金乙酯                           1ml 
按照常规溶液剂的操作进行,将3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯加800ml蒸馏水溶解,加入防腐剂,定容至1000ml,4℃冷藏过夜,滤过,即得。 
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 

Claims (6)

1.3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯在制备治疗和/或预防血吸虫病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述药物包括3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯及药学上可接受的辅料。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述药物为片剂、胶囊剂、滴丸剂、溶液剂或注射剂。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述药物为注射剂。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述注射剂为冻干粉针剂或水针剂。
6.含有3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-α-L-鼠李糖-(1→2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄糖-(1→6)-β-D-葡萄糖酯的白头翁提取物在制备治疗和/或预防血吸虫病药物中的应用。
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