CN101579360A - 高活性蛭类动物提取物在制备药物中的应用及其制法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及高活性蛭类动物提取物在制备药物中的应用及其制法，此高活性蛭类提取物的具体制备为将此高活性蛭类通过在清水中饥饿饲养、然后低温冷冻、组织捣浆、干燥粉碎即得(高活性蛭类清水中饥饿饲养5～15天，于－10～－30℃冷冻，组织捣碎机制成匀浆，50℃以下干燥，粉碎成细粉既得)，其制备工艺简单可行，可制成药理上可接受的制剂，可用于制备益气活血、化瘀通络之功能的药物用于防止破血逐瘀，通脉止痛药物的应用。

Description

高活性蛭类动物提取物在制备药物中的应用及其制法

技术领域：

本发明涉及高活性蛭类提取物在制备治疗药物中的应用及其制备方法，属于药品的技术领域。

背景技术：

血瘀性疾病一直以来严重的威胁着人类的健康，目前，抗血小板功能抑制剂和抗凝剂是抗栓治疗的有效办法。肝素和华法林在抗凝治疗中已应用了数十年，但是这两种药物仍有许多局限性，据报道，3％的病人在使用肝素5d后会出现由肝素引起的血小板减少症。血管内血栓形成的因素很多，但根本因素是血液凝固、血小板黏附和聚集。凝血酶在血液凝固过程及血小板激活过程中起着至关重要的作用，所以，凝血酶抑制剂的研究特别受到重视，以蛭类动物及其提取物在药物制剂方面的应用是目前研究的重点。

众所周知，高活性蛭类动物的提取物，目前无论是水蛭或是菲牛蛭，其在抗血栓方面都已经有报道，以水蛭最具代表性，由于其活性成份为水蛭素，其主要是被应用于抗血栓药物中，同时有关其提取方法及其制剂的制备方法均有文献和专利报道，但是由于其凝血酶抑制剂的物理和化学特性，其在提取方法和制剂方面的研究还有待提高，同时，广东海洋大学理学院对其蛭类动物中脂肪酸和氨基酸的研究显示，这类动物中已确定的氨基酸和脂肪酸为人体所必须的，这些氨基酸和脂肪酸在活血化瘀等功效中起到了十分重要的药理作用，目前，有关该提取物在制备药物中的应用中，已经有脉血康胶囊中药制剂，其采用水蛭为单一的原料药加工而成，由于市场上水蛭的供应比较局限性，所以研究和开发一种新型高活性蛭类动物的提取物的提取方法及其应用具有很大的意义。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，为临床提供一种高效、安全、可靠的高活性蛭类提取物在制备药物中的应用及制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

该高活性蛭类动物提取物在制备药物中的应用，以菲牛蛭、牛蛭或水蛭的提取物为原料。

上述的药物的制备中以菲牛蛭提取物、牛蛭提取物或水蛭的提取物中的一种或一种以上组合制备而成。

上述的该药物的制备中取高活性蛭类提取物可加工成片剂、胶囊剂或丸剂。

上述的该药物的制备其制法为：将蛭类动物泥沙洗净，清水中饲养，于低温下冷冻，组织捣碎机制成匀浆，低温干燥，粉碎成细粉，即得。

上述的该药物的制备其具体的制法为：将蛭类动物泥沙洗净，清水中饥饿饲养5～15天，于-10～-30℃冷冻，组织捣碎机制成匀浆，50℃以下干燥，粉碎成细粉，即得。

具体实施方式：

实施例1    肠溶胶囊的制备

提取物              230g

淀粉                16g

硬脂酸镁            4g

                                

制成                1000粒

取新体牛蛭或/和山蛭，清水中饥饿饲养7天，于-15℃冷冻，组织捣碎机制成匀浆，50℃以下干燥，粉碎成细粉，得提取物备用，将上述的提取物与辅料于总混机中混合，填充入肠溶胶囊，包装既得。

实施例2    肠溶片剂的制备

提取物             230g

微晶纤维素         18g

硬脂酸镁           1g

II号丙烯酸树脂     48g

III号丙烯酸树脂    4g

吐温80             1.6g

蓖麻油             2g

滑石粉             2.8g

                                 

制成               1000粒

取新体牛蛭或/和山蛭，清水中饥饿饲养7天，于-15℃冷冻，组织捣碎机制成匀浆，50℃以下干燥，粉碎成细粉，得提取物备用，将上述的提取物、微晶纤维素、硬脂酸镁于总混机中混合后压片，片重为0.25g/片，将剩余包衣材料制成1000ml乙醇溶液。再将上述素片进行包衣，包装，既得。

本发明药物的疗效由以下药效学实验证明：

I.高效蛭类动物提取物对抗动物血凝形成的作用。

材料与方法

1.1药物：山蛭提取物(100ATU/ML)，菲牛蛭提取物(100ATU/ML)，由贵州信邦药物研究中心提供。水蛭素(100ATU/ML)

1.2动物：家兔，体重1.8～2.5kg；动物雌雄兼用，均为清洁级，由贵州信邦实验动物中心提供。

1.3试剂和仪器：戊巴比妥钠、构橼酸钠、电子天平、秒表。体外血栓形成仪：按Chandler氏体外血凝形成装置，蠕动泵改装的泵轴装一有机玻璃圆盘，有内径4mm、长250mm、半径38mm的聚氯乙烯管环，固定于圆盘上，管环平面与地平夹角为74°，管环内可盛血液，整个仪器置于自动控温培养箱中。

1.4实验方法

1.4.1家兔体外血凝形成实验：取家兔80只，随机分为10组，每组8只，各兔静脉注射1％戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉。分离家兔股动脉，取血1ml注入聚乙烯管中，各给药组按(1.5、0.75、0.5 ATU 3个剂量组)在管中分别注入0.2ml山蛭提取物和菲牛蛭提取物，对照组注入相同体积生理盐水，按Chandler氏法，使血液在37℃条件下以16r/min的速度在体外血凝凝成仪上旋转10min，制备血凝。用滤纸吸干血凝水分，称取血凝湿重，湿血栓自然风干6h，为干凝血。

1.4.2统计学处理：实验数据采用成组设计方差分析处理，各项指标均以(x±s)表示。

表一山蛭提取物对家兔体外凝血形成的影响(x±s，n＝8)

注：与对照组相比，**P＜0101，*P＜0105

表二菲牛蛭提取物对家兔体外凝血形成的影响(x±s，n＝8)

注：与对照组相比，**P＜0.01，*P＜0.05

1.5结果

由以上结果表明，60ATU/kg菲牛蛭提取物或者山蛭提取物对于家兔体外凝血形成抑制率在40％～50％之间，属中剂量组，且其药理作用显示，该高活性蛭类提取物可用于制备益气活血、化瘀通络药物。

II高效蛭类动物提取物的组合在家兔体外凝血形成实验

材料与方法

1.1药物：水蛭提取物(100ATU/ML)，菲牛蛭提取物(100ATU/ML)，药物组合物组：水蛭提取物与菲牛蛭提取物，分为高、中、低三个剂量组，自制；均由贵州信邦药物研究中心提供。

1.2动物：家兔，体重1.8～2.5kg；动物雌雄兼用，均为清洁级，由贵州信邦实验动物中心提供。

1.3试剂和仪器：戊巴比妥钠、构橼酸钠、电子天平、秒表。体外血栓形成仪：按Chandler氏体外血凝形成装置，蠕动泵改装的泵轴装一有机玻璃圆盘，有内径4mm、长250mm、半径38mm的聚氯乙烯管环，固定于圆盘上，管环平面与地平夹角为74°，管环内可盛血液，整个仪器置于自动控温培养箱中。

1.4实验方法

1.4.1家兔体外血凝形成实验：取家兔50只，随机分为5组，每组10只，各兔静脉注射1％戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉。分离家兔股动脉，取血1ml注入聚乙烯管中，各给药组按(1.5、0.75、0.5 ATU 3个剂量组)在管中分别注入0.2ml水蛭提取物、菲牛蛭提取物及组合的高、中、低剂量组，对照组注入相同体积生理盐水，按Chandler氏法，使血液在37℃条件下以16r/min的速度在体外血凝凝成仪上旋转10min，制备血凝。用滤纸吸干血凝水分，称取血凝湿重，湿血栓自然风干6h，为干凝血。

1.4.2统计学处理：实验数据采用成组设计方差分析处理，各项指标均以(x±s)表示。

表一家兔体外凝血形成的影响(x±s，n＝8)

注：与对照组相比，**P＜0101，*P＜0105

1.5结果

由以上结果表明，60ATU/kg提取物组合物组对于家兔体外凝血形成抑制率在30％～40％之间，属中剂量组。同时，根据水蛭组提取物与菲牛蛭素的比较结果可知，其高效蛭类动物提取物中除了其有效成份外，其中各种人体必须氨基酸及其脂肪酸也在药物中发挥了重要的作用。

III高效蛭类动物提取物的急性毒性试验研究

1.目的：心脑血管疾病已成为严重危害人类健康的杀手之一，但是已有相关的文献报道，由于该方面的药物应用，对部分病人却产生了毒副作用，所以发明人对该提取物进行了相关的毒副作用研究，从而确保药物的研究和开发。

2.受试药物

药物：菲牛蛭提取物、山蛭提取物，由贵州信邦药物研究中心提供，配制方法：试验前用蒸馏水配制成所需浓度。本品每33ml水可混悬30g提取物(总体积52ml)，混悬液浓度为57.7％。

给药途径：采用与拟推荐的临床用药途径灌胃(ig)给药。

3.受试动物

3.1来源及种属：KM种小鼠，体重：20.2±0.8g，雌雄各半；SD大鼠，体重：166.4±6.9g，雌雄各半，符合国家II级实验动物标准，合格证号：SCXK(黔)2002-0001。贵阳医学院实验动物中心提供。

3.2饲养条件：试验动物雌雄分笼饲养于洁净动物饲养柜中，全价颗粒饲料喂养，由专人饲养管理。观察饲养1周，观察动物活动、进食、大小便均无异常后开始试验。动物室光照充足，通风和空调设备良好，室温18～25℃，相对湿度50～70％，实验室和洁净动物饲养柜按常规定期消毒。

4.DJ系列洁净动物饲养柜，苏杭实验动物科技发展公司、苏杭净化设备厂。

5.试验方法和结果

5.1小鼠急性毒性试验

5.1.1小鼠灌胃给药急性毒性预试验取禁食12小时的小鼠24只，体重18～22g，雌雄各半，随机分为4组，分别一次ig给予57.7％、28.85％浓度的山蛭提取物和菲牛蛭提取物，ig容积均为40ml/kgWt。观察并记录7日内各组动物的一般生理状况、行为活动、进食、大小便、有无中毒症状和有无动物死亡，试验结束后将小鼠处死进行解剖学检查。结果未见中毒表现，亦无小鼠死亡。因57.7％浓度的山蛭类提取物和菲牛蛭提取物已达到该药的最大浓度，40ml/kgWt的ig量已达到小鼠ig的最大容积，故山蛭提取物和菲牛蛭提取物ig给药的急性毒性无法测出LD50，故作最大给药量测定。

5.1.2小鼠灌胃给药的最大给药量测定取小鼠40只，体重20.2±0.8g，雌雄各半。随机分为四组：给药组和空白对照组。试验前禁食(不禁水)12小时，分别一次ig给予57.7％浓度的山蛭提取物和菲牛蛭提取物，给药容积均为40ml/kgWt。给药1小时后恢复进食，空白对照组同法给予等量的蒸馏水。各次给药后密切观察4小时。次日后每日上、下午各观察一次，连续观察14天，记录动物的外观、饮食、行为、体重、大小便、分泌物和有否死亡等情况，试验结束后将小鼠处死进行解剖学检查。试验结果见表七、表八。

表七山蛭提取物小鼠经口灌胃给药最大给药量试验结果

表八菲牛蛭蛭提取物小鼠经口灌胃给药最大给药量试验结果

5.1.3结果给药后小鼠活动减少。1小时后活动恢复正常。无一动物死亡，各给药组动物均无生理异常表现，毛皮光滑，进食、体重增长及大小便正常，眼、鼻无异常分泌物，粘膜无充血、水肿，呼吸正常，处死动物并对心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠等主要脏器作解剖学检查，结果未发现所检器官有：肿胀、囊肿、萎缩、出血、水肿、颜色异常、粘连、硬化等异常改变，与空白对照组比较无明显差异。

5.2大鼠急性毒性试验

5.2.1大鼠灌胃给药的最大给药量测定鉴于小鼠试验的初步结果，大鼠急性毒性试验直接进行最大给药量测定。取大鼠40只，体重166.4±6.9g，雌雄各半。随机分为四组：给药组和空白对照组。试验前禁食(不禁水)12小时，分别一次ig给予57.7％浓度的山蛭类提取物和菲牛蛭提取物，给药容积均为20ml/kgWt，给药后继续禁食，1小时后恢复进食，空白对照组给等量的蒸馏水。各次给药后密切观察4小时。次日后每日上、下午各观察一次，连续观察14天，记录动物的外观、饮食、行为、体重、大小便、分泌物和有否死亡等情况。具体试验结果见表九、表十。

表九山蛭提取物大鼠经口灌胃给药最大给药量试验结果

表十菲牛蛭提取物大鼠经口灌胃给药最大给药量试验结果

5.2.3结果给药后大鼠活动减少，30min后大鼠活动恢复正常。14日内无一动物死亡，各给药组动物均无生理异常表现，毛皮光滑，进食、体重增长及大小便正常，眼、鼻无异常分泌物，粘膜无充血、水肿，呼吸正常，解剖学观察查心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠等主要脏器未发现所检器官出现肿胀、囊肿、萎缩、出血、水肿、颜色异常、粘连、硬化等异常改变，与空白对照组比较无明显差异。

5.试验结论

本试验未测出动物的LD₅₀，大、小鼠以最大给药浓度和最大给药容积灌胃给药后，观察14天，无一动物死亡，也未见任何毒性反应，处死动物解剖肉眼检查心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠等主要脏器未发现病理学改变。按成人60kg重计算，本品临床推荐日用量为0.05g/kg，小鼠的最大给药量为23.08g/kg，相当于临床日用量的461.6大鼠的最大给药量为11.54g/kg，相当于临床日用量的230.8倍。提示本品口服毒性较低，使用安全、可靠。

Claims (5)

1、高活性蛭类动物提取物在制备药物中的应用，其特征在于：该药物的制备菲牛蛭、牛蛭或水蛭的提取物为原料。

2、根据权利要求1所述的药物制备，其特征在于：该药物的制备以菲牛蛭提取物、牛蛭提取物或水蛭提取物中的一种或一种以上组合制备而成。

3.根据权利要求1或2所述的药物制备，其特征在于：取高活性蛭类动物提取物加工成片剂、胶囊剂或丸剂。

4.高活性蛭类动物提取物的制备方法，其特征在于：蛭类动物将泥沙洗净，清水中饲养，于低温下冷冻，组织捣碎机制成匀浆，低温干燥，粉碎成细粉，即得。

5.根据权利要求4高活性蛭类动物提取物的制备方法，其特征在于：蛭类动物将泥沙洗净，清水中饥饿饲养5～15天，于-10～-30℃冷冻，组织捣碎机制成匀浆，50℃干燥以下，粉碎成细粉，即得。