CN105028403A - 一种生物质炭的抗血吸虫尾蚴缓释药物制剂制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物质炭的抗血吸虫尾蚴缓释药物制剂制备方法。制备方法包括以下工序：选择浮萍、杨树、桐树、竹粉和槐树生物质作为炭化材料，通过350℃至1000℃炭化得到合适比表面积为5-500m²/g和孔径大小为0.5-10nm的生物质炭材料；对生物质炭材料进行官能团、表面形貌及比表面积的表征；合成抗血吸虫尾蚴药物聚醚苯酰胺；选择竹粉、杨树和桐树炭化材料作为抗血吸虫药物聚醚苯酰胺缓释的载体，采用紫外吸收光谱测定聚醚苯酰胺的释放动力学曲线；进行灭尾蚴实验，利用竹粉、杨树和桐树和生物质炭材料作为抗血吸虫尾蚴药物缓释的载体，可以减缓药物聚醚苯酰胺的释放速度，缓释时间达4天以上，灭尾蚴效果达到95%以上。

Description

一种生物质炭的抗血吸虫尾蚴缓释药物制剂制备方法

技术领域

本发明属于寄生虫防治药物新剂型及制备技术领域，更具体地，本发明采用固体废弃物炭化材料负载抗血吸虫尾蚴药物制备具有长效缓释性能的制剂，相比于以往的抗血吸虫尾蚴药物，这类缓释药物制剂具有固体废物循环利用和药物缓释时间长的优点。

背景技术

血吸虫病是一种流行于热带和亚热带地区、严重危害人民身体健康、影响经济社会发展的重大传染病。全球近2亿人感染，涵盖了76个国家和地区，而生活在受感染威胁的流行地区人数则达7.79亿，被世界卫生组织列为极易复现的再现传染病。在我国，日本血吸虫是通过唯一中间宿主—钉螺进行传播，钉螺体内的尾蚴钻穿人体或牲畜皮肤而使其感染血吸虫病，从而进行传播。98％以上的尾蚴以静态方式浮在水面上，并且尾蚴是血吸虫生命周期中最脆弱的阶段，因此研制出高效灭尾蚴药物是防治日本血吸虫病的有效途径。目前常用的灭尾蚴药物有氯硝柳胺、吡喹酮和植物灭尾蚴药物等，但都存在着明显的不足，如水溶性差和难提取等。因此，本申请人研究团队在现有灭尾蚴药物氯硝柳胺药物分子通过共价亲水基团聚乙二醇后，增强了药物的水溶性和水面漂浮能力，但在实际应用如湖区实验中易随风飘走，药效作用时间短。因此研制出药效保持时间较长的灭尾蚴缓释药物具有长远意义。

药物缓释是将载体与药物分子经过物理或化学的方法结合在一起，在药物释放体系内通过渗透、扩散等不同的形式，将药物持续稳定地释放出来。制备长效型的灭尾蚴药物关键是选用合适的药物载体将灭尾蚴药物有效负载，然后进行药物缓释。生物质是指富含纤维素、半纤维素、木质素等成分的生物体，经自然演变或人类采伐后失去原有生理代谢功能的生物体材料，属于一种固体废弃物。炭化后的生物质材料吸附性能主要是基于材料具有较多的微介孔结构，与目前所用的介孔分子筛药物载体类似。

综上所述，针对目前灭血吸虫尾蚴药物存在药效作用时间短的问题，同时结合废弃生物质原料的循环再利用，将生物质原料进行有效的炭化，得到具有吸附性能的生物质炭的药物载体，并将其用于抗血吸虫尾蚴药物的负载、缓释和灭尾蚴。

发明内容

（1）要解决的技术问题

本发明为了克服目前抗血吸虫尾蚴药物存在的施药量大、溶解性小和药效作用时间短的缺点，利用固体废弃物炭化材料的吸附性能，提供一种长效型抗血吸虫尾蚴缓释制剂的制备方法。

（2）技术方案

一种生物质炭的抗血吸虫尾蚴缓释药物制剂制备方法，包括以下工序：

1）结合当地实际，选择几种生物质作为炭化材料，通过改变炭化温度，得到合适比表面积、孔径大小的生物质炭材料；

2）对生物质炭材料进行组分官能团、表面形貌以及比表面积的表征；

3）合成不同聚乙二醇亲水链的聚醚苯酰胺抗血吸虫尾蚴药物；

4）选择合适的炭化材料作为药物缓释的载体进行药物负载，采用紫外光谱测定聚醚苯酰胺的释放动力学曲线；

5）负载药物的生物质炭材料缓释制剂灭尾蚴实验；

在所述工序1）中制备生物质炭材料包括如下步骤：竹粉、杨树、桐树、槐树和浮萍生物质属于固体废弃物的一种，本申请利用这些生物质原料炭化后具有微介孔的吸附能力，通过改变炭化温度和炭化温度保留时间，在管式炉中进行高温热解炭化得到具有不同孔径和比表面积的生物质炭材料。

a)取50mg杨树生物质原料于15mL坩埚中，置于管式炉中，在氮气保护下进行高温热解炭化，炭化温度范围为350-1000℃，炭化保留时间为1-2小时。

b)取500mg桐树生物质原料于15mL坩埚中，置于管式炉中，在氮气的保护下进行高温热解炭化，炭化温度范围为350-1000℃，炭化保留时间为1-2小时。

c)取500mg槐树生物质原料于15mL坩埚中，置于管式炉中，在氩气的保护下进行高温热解炭化，炭化温度范围为350-1000℃，炭化保留时间为1-2小时。

d)取500mg竹粉生物质原料于15mL坩埚中，置于管式炉中，在氩气的保护下进行高温热解炭化，炭化温度范围为350-1000℃，炭化保留时间为1-2小时。

e)取500mg浮萍生物质原料于15mL坩埚中，置于管式炉中，在氩气的保护下进行高温热解炭化，炭化温度范围为350-1000℃，炭化保留时间为1-2小时。

在所述工序2）中对生物质炭材料的组分官能团、表面形貌和比表面积的表征包括如下步骤：

a）生物质炭材料组分官能团的表征：采用红外光谱KBr压片法，波长扫描范围从4000cm^-1到400cm^-1，扫描次数为32次，对350-1000℃的炭化产物进行红外表征；

b）生物质炭材料表面形貌的表征：将不同温度炭化的生物质炭材料在FEIQUANTA450扫描电子显微镜的高真空模式下扫描，扫描电压为15kV，获得材料的SEM图片。

c）生物质炭材料的微介孔测定：炭化材料样品在105℃脱气3小时以上处理后在QuantaAutosorb系统上进行测试，测定温度为-196℃，通过Brunauer-Emmett-Teller法计算得到不同生物质炭材料的比表面积。

在所述工序3）中，抗血吸虫尾蚴的药物聚醚苯酰胺合成步骤如图10所示：

以三缩四乙二醇为例，取三缩四乙二醇（0.05mol），5mL二氯甲烷，7mL吡啶加入100mL三颈烧瓶中，冰浴控制反应温度为0-5℃；将对甲苯磺酰氯（0.05mol）用CH₂Cl₂溶解，用恒压滴液漏斗缓慢滴入烧瓶中，温度不超过10℃反应5小时；反应结束后加冰水搅拌0.5小时，反应液依次用1M的HCl，5%的NaHCO₃的水溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，柱层析分离得到三缩四乙二醇对甲苯磺酸酯。

称取氯硝柳胺（4.8mmol）于100mL三颈烧瓶中，加入40mL1,4-二氧六环溶解，置于油浴锅中加热到83℃，称取0.553gK₂CO₃和0.1289gBu₄NBr加入到三颈瓶中；将5.0mmol三缩四乙二醇对甲苯磺酸酯溶解于20mL二氧六环，用恒压滴液漏斗缓慢滴加，继续反应24小时。反应结束后在反应液中加入适量的蒸馏水，用二氯甲烷萃取三次，合并有机层用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂进行柱色谱分离，得到产物三缩四乙二醇聚醚苯酰胺。

所述的工序4），操作步骤如下：a）标准曲线的测定：配制一系列浓度的聚醚苯酰胺药物标准溶液，浓度分别为：4、8、12、16和20μg/mL，用紫外-可见光谱仪测定聚醚苯酰胺的最大紫外吸收波长，再测定标准溶液在最大吸收波长下的吸光度，吸光度对浓度作图得到标准工作曲线；b）生物质炭材料抗血吸虫药物负载与缓释步骤：称2.5-50mg抗血吸虫药物聚醚苯酰胺于圆底烧瓶中，加入3mL二氯甲烷将其溶解，再称取25-300mg生物质炭材料加入到圆底烧瓶中，在37℃下搅拌除去溶剂二氯甲烷；将载药后的炭材料倒入离心管中，加适量去离子水洗涤，离心分离，收集上层清液，沉淀炭材料再加水洗涤离心一次，沉淀为负载药物的炭材料；将负载药物的炭材料加入布袋中，加入一定体积去离子水，磁力搅拌下进行药物缓释，取不同时间点的透析液进行紫外吸收光谱测定；参照标准工作曲线，得到不同缓释时间点的药物浓度；根据标准曲线算出未负载的药物含量，计算出负载药物的总量，同时计算药物的释放百分率。另外一种缓释方法为：将负载药物的炭材料加入透析袋中（截留分子量3500-14000），其他缓释操作相同。

所述工序5），操作步骤如下：

a)尾蚴从感染毛蚴的阳性钉螺得到，去阳性螺放入清水中，在白炽灯下光照2小时左右逸出新鲜尾蚴。

b)同工序4）中的b）步骤，将聚醚苯酰胺负载到杨树、桐树、和竹粉炭化材料中，用金属环移取适量的尾蚴加入上述不同负载材料缓释药物的水中，在18小时内观察尾蚴的活性，并及时记录0.5、1、1.5和2小时的尾蚴死亡数。

优选地，所述工序1）中制备生物质炭材料的较优炭化温度为500-700℃，较优炭化时间为1小时；

优选地，所述工序2）中，通过红外表征，五种生物质原料炭化后的官能团组分相似，比表面积数据比较得出较优的负载材料为竹粉；

优选地，所述工序4）中，最佳药物负载量是生物质炭材料的质量5-10%；

优选地，所述工序4）中，较优的透析材料是截留分子量为14000的透析袋。

通过利用固体废弃物作为炭化材料，制备出具有长效缓释型的抗血吸虫尾蚴药物制剂，既增加了灭尾蚴药物作用时间，提高药物使用效率，也循环利用了固体废弃物，解决环境问题。

（3）有益效果

（a）本发明利用生物质炭化材料作为抗血吸虫尾蚴药物缓释的载体，解决了原有灭血吸虫尾蚴药物溶解性差和药效短的问题，本申请提供了一种长效型抗血吸虫尾蚴缓释药物的方法；

（b）本发明利用固体生物质废弃物作为炭化原料，合理利用了固体废弃物，有利于解决环境问题。

附图说明

图1是竹粉不同炭化温度下的SEM图。

图2是杨树不同炭化温度下的SEM图。

图3是桐树不同炭化温度下的SEM图。

图4为600℃炭化条件下不同生物质炭材料的氮气吸-附脱附等温图。

图5为不同炭化温度的杨树炭材料红外光谱图。

图6为聚醚苯酰胺药物的紫外吸收光谱及标准溶液浓度对吸光度所做的标准工作曲线图。

图7是选用竹粉炭材料负载聚醚苯酰胺药物的缓释图。

图8是选用杨树炭材料负载聚醚苯酰胺药物的缓释图。

图9是选用桐树炭材料负载聚醚苯酰胺药物的缓释图。

图10抗血吸虫尾蚴聚醚苯酰胺药物的合成路线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

选取竹粉作为炭化原料

a）取50mg竹粉生物质原料于15mL坩埚中，置于管式炉中，在氮气的保护下进行高温热解炭化，炭化温度范围为350-1000℃，炭化保留时间为1小时。计算不同温度下所获得的生物质炭的得率，发现温度越高，炭化得率越低，筛选出较优的炭化温度为500-700℃。

b）利用扫描电子显微镜对步骤a）中得到的生物质炭材料进行表面形貌表征，如图1所示，随着温度的升高，竹粉表面生成越来越多的小孔。

c）利用氮气吸附-脱附测试仪对600℃温度下炭化1小时所得到的竹粉炭材料进行微介孔表征，数据通过Brunauer-Emmett-Teller法计算得到该材料的比表面积，如图4所示，竹粉炭材料的比表面积为394.7m²/g，孔径分布为0.5-10nm。

d）配制一系列浓度的聚醚苯酰胺标准溶液，利用紫外-可见光谱仪测定聚醚苯酰胺的最大吸收波长，再测定标准溶液在最大吸收波长下的吸光度，吸光度对浓度作图得到标准工作曲线，如图6所示。

e）称2.5mg抗血吸虫药物聚醚苯酰胺于圆底烧瓶中，加入1mL二氯甲烷将其溶解，再称取25mg竹粉生物质炭材料加入到圆底烧瓶中，在37℃下搅拌除去二氯甲烷；（b）将载药后的炭材料倒入离心管中，加去离子水洗涤，离心分离，收集上层清液，沉淀炭材料再加水洗涤离心一次，沉淀为负载药物的炭材料；（c）将负载药物的炭材料加入透析袋中（截留分子量为14000），加入20mL去离子水，磁力搅拌下进行药物缓释，取不同时间点的透析液进行紫外吸收光谱测定，参照标准工作曲线得到不同缓释时间点的药物浓度；根据标准曲线算出未负载的药物含量，计算出负载药物的总量，同时计算药物的释放百分率，如图7所示。

实施例2

选取杨树作为炭化原料

a)取500mg杨树生物质原料于15mL坩埚中，置于管式炉中，在氮气保护下进行高温热解炭化，炭化温度范围为350-1000℃，炭化保留时间为1小时。计算不同温度下所获得的生物质炭的得率，发现温度越高，炭化得率越低，筛选出较优的炭化温度为500-700℃。

b)利用扫描电子显微镜对步骤a）中得到的生物质炭材料进行表面形貌表征，如图2所示。

c)利用氮气吸附-脱附测试仪对600℃温度下炭化1小时所获得的杨树炭材料进行微介孔表征，数据通过Brunauer-Emmett-Teller法计算得到该材料的比表面积95.9m²/g，如图4所示；利用红外光谱表征炭材料的官能团，如图5所示。

d)配制一系列浓度的聚醚苯酰胺标准溶液，利用紫外可见光谱仪测定聚醚苯酰胺的最大吸收波长，再测定标准溶液在最大吸收波长下的吸光度，吸光度对浓度作图得到标准工作曲线，如图6所示。

e)称25mg抗血吸虫药物聚醚苯酰胺于圆底烧瓶中，加入3mL二氯甲烷将其溶解，再称取250mg杨树炭材料加入到圆底烧瓶中，在37℃下搅拌除去二氯甲烷；（b）将载药后的炭材料倒入离心管中，加去离子水洗涤，离心分离，收集上层清液，沉淀炭材料再加水洗涤离心一次，沉淀为负载药物的炭材料；（c）将负载药物的炭材料加入透析袋中（截留分子量为14000），加入200mL去离子水，磁力搅拌下进行药物缓释，取不同时间点的透析液进行紫外吸收光谱测定，参照标准工作曲线得到不同缓释时间点的药物浓度；根据标准曲线算出未负载的药物含量，计算出负载药物的总量，同时计算药物的释放百分率，如图8所示。

实施例3

选取桐树作为炭化原料

a)取500mg桐树生物质原料于15mL坩埚中，置于管式炉中，在氮气保护下进行高温热解炭化，炭化温度范围为350-1000℃，炭化保留时间为1小时。计算不同温度下所获得的生物质炭的得率，发现温度越高，炭化得率越低，筛选出较优的炭化温度为500-700℃。

b)利用扫描电子显微镜对步骤a）中得到的生物质炭材料进行表面形貌表征，如图3所示。

c)利用氮气吸-附脱附测试仪对600℃温度下炭化1小时所获得的桐树生物质炭材料进行微介孔表征，通过Brunauer-Emmett-Teller法计算得到该材料的比表面积223.0m²/g，如图4所示。

d)配制一系列浓度的聚醚苯酰胺标准溶液，利用紫外可见光谱仪测定聚醚苯酰胺的最大吸收波长，再测定标准溶液在最大吸收波长下的吸光度，吸光度对浓度作图得到标准工作曲线，如图6所示。

e)称25mg抗血吸虫药物聚醚苯酰胺于圆底烧瓶中，加入3mL二氯甲烷将其溶解，再称取250mg桐树炭材料加入到圆底烧瓶中，在37℃下搅拌除去二氯甲烷；（b）将载药后的炭材料加入离心管中，加去离子水洗涤，离心分离，收集上层清液，沉淀炭材料再加水洗涤离心一次，沉淀为负载药物的炭材料；（c）将负载药物的炭材料加入透析袋中（截留分子量为14000），加入200mL去离子水，磁力搅拌下进行药物缓释，取不同时间点的透析液进行紫外吸收光谱测定，参照标准工作曲线，得到不同缓释时间点的药物浓度；根据标准曲线算出未负载的药物含量，计算出负载药物的总量，同时计算药物的释放百分率，如图9所示。

实施例4

基于杨树生物质炭材料药物缓释制剂灭血吸虫尾蚴实验：

a）尾蚴从感染毛蚴的阳性钉螺得到，去阳性螺放入清水中，在白炽灯下光照2小时左右逸出新鲜吸血虫尾蚴。

b）将三缩四乙二醇聚醚苯酰胺负载到杨树炭化材料中，用金属环移取适量的尾蚴加入不同负载材料缓释药物的水中，加入适量去离子水进行药物的缓释。在18小时内观察尾蚴的活性，并及时记录0.5、1、1.5和2小时的尾蚴死亡数。实验数据表明：在18小时内尾蚴死亡率大于95%。

以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种生物质炭的抗血吸虫尾蚴缓释药物制剂制备方法，其特征在于，包括以下工序：

1）结合当地实际，选择几种生物质作为炭化材料，通过改变炭化温度，得到合适比表面积、孔径大小的生物质炭材料；

2）对生物质炭材料进行组分官能团、表面形貌以及比表面积的表征；

3）合成不同聚乙二醇亲水链的聚醚苯酰胺抗血吸虫尾蚴药物；

4）选择合适的炭化材料作为药物缓释的载体进行药物负载，采用紫外光谱测定聚醚苯酰胺的释放动力学曲线；

5）进行负载药物的生物质炭材料缓释制剂灭尾蚴实验。

2.根据权利要求1所述的一种生物质炭的抗血吸虫尾蚴缓释药物制剂制备方法，其特征在于，在所述工序1）中，选择的生物质为竹粉、杨树、桐树、槐树或者浮萍中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种生物质炭的抗血吸虫尾蚴缓释药物制剂制备方法，其特征在于，在所述工序1）中，制备生物质炭材料包括如下步骤，称取50mg-500mg生物质原料于坩埚中，再置于管式炉中，在氮气的保护下进行高温热解炭化，炭化温度范围为350℃至1000℃，炭化保留时间为1至5小时。

4.根据权利要求1所述的一种生物质炭的抗血吸虫尾蚴缓释药物制剂制备方法，其特征在于，在所述工序2）中，表征操作步骤如下：a）生物质炭材料组分官能团的表征：采用红外光谱KBr压片法；b）生物质炭材料表面形貌的表征：扫描电子显微镜高真空模式下获得材料的表面形貌图；c）生物质炭材料的微介孔测定：采用氮气吸附-脱附等温测试方法得到。

5.根据权利要求4所述的一种生物质炭的抗血吸虫尾蚴缓释药物制剂制备方法，其特征在于，在所述工序2）中，对生物质炭材料的组分官能团、表面形貌和比表面积的表征包括如下步骤：

a）生物质炭材料组分官能团的表征：采用红外光谱KBr压片法，波长扫描范围从4000cm^-1到400cm^-1，扫描次数为32次，对350-1000℃的炭化产物进行红外表征；

b）生物质炭材料表面形貌的表征：将不同温度炭化的生物质炭材料在FEIQUANTA450扫描电子显微镜的高真空模式下扫描，扫描电压为15kV，获得炭材料的SEM图片；

c）生物质炭材料的微介孔测定：炭化材料样品在105℃脱气3小时以上处理后在QuantaAutosorb系统上进行测试，测定温度为-196℃，通过Brunauer-Emmett-Teller法计算得到不同生物质炭材料的比表面积。

6.根据权利要求1所述的一种生物质炭的抗血吸虫尾蚴缓释药物制剂制备方法，其特征在于，在所述工序3）中，抗血吸虫尾蚴药物为聚醚苯酰胺；聚醚苯酰胺药物通过不同分子量的聚乙二醇基对甲苯磺酸酯和氯硝柳胺反应，生成醚键后得到聚醚苯酰胺。

7.根据权利要求6所述的一种生物质炭的抗血吸虫尾蚴缓释药物制剂制备方法，其特征在于，在所述工序3）中，抗血吸虫尾蚴的药物聚醚苯酰胺合成步骤如下：取三缩四乙二醇（0.05mol），5mL二氯甲烷，7mL吡啶加入100mL三颈烧瓶中，冰浴控制反应温度为0-5℃；将对甲苯磺酰氯（0.05mol）用CH₂Cl₂溶解，用恒压滴液漏斗缓慢滴入烧瓶中，温度不超过10℃反应5小时；反应结束后加冰水搅拌0.5小时，反应液依次用1M的HCl，5%的NaHCO₃的水溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，柱层析分离得到三缩四乙二醇对甲苯磺酸酯；

称取氯硝柳胺（4.8mmol）于100mL三颈烧瓶中，加入40mL1,4-二氧六环溶解，置于油浴锅中加热到83℃，称取0.553gK₂CO₃和0.1289gBu₄NBr加入到三颈瓶中；将5.0mmol三缩四乙二醇对甲苯磺酸酯溶解于20mL二氧六环，用恒压滴液漏斗缓慢滴加，继续反应24小时；反应结束后在反应液中加入适量的蒸馏水，用二氯甲烷萃取三次，合并有机层用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂进行柱色谱分离，得到产物三缩四乙二醇聚醚苯酰胺。

8.根据权利要求1所述的一种生物质炭的抗血吸虫尾蚴缓释药物制剂制备方法，其特征在于，在所述工序4）中，采用溶剂挥发法负载抗血吸虫尾蚴药物聚醚苯酰胺，且药物负载量为生物质炭材料质量分数的1%至20%之间。

9.根据权利要求1所述的一种生物质炭的抗血吸虫尾蚴缓释药物制剂制备方法，其特征在于，在所述工序4）中，操作步骤如下：a）标准曲线的测定：配制一系列浓度的聚醚苯酰胺药物标准溶液，浓度分别为：4、8、12、16和20μg/mL，用紫外-可见光谱仪测定聚醚苯酰胺的最大紫外吸收波长，再测定标准溶液在最大吸收波长下的吸光度，吸光度对浓度作图得到标准工作曲线；b）生物质炭材料抗血吸虫药物负载与缓释步骤：称2.5-50mg抗血吸虫药物聚醚苯酰胺于圆底烧瓶中，加入3mL二氯甲烷将其溶解，再称取25-300mg生物质炭材料加入到圆底烧瓶中，在37℃下搅拌除去溶剂二氯甲烷；将载药后的炭材料倒入离心管中，加适量去离子水洗涤，离心分离，收集上层清液，沉淀炭材料再加水洗涤离心一次，沉淀为负载药物的炭材料；将负载药物的炭材料加入布袋中，加入一定体积去离子水，磁力搅拌下进行药物缓释，取不同时间点的透析液进行紫外吸收光谱测定；参照标准工作曲线，得到不同缓释时间点的药物浓度；根据标准曲线算出未负载的药物含量，计算出负载药物的总量，同时计算药物的释放百分率；另外一种缓释方法为：将负载药物的炭材料加入透析袋中（截留分子量3500-14000），其他缓释操作相同。

10.根据权利要求1所述的一种生物质炭的抗血吸虫尾蚴缓释药物制剂制备方法，其特征在于，在所述工序5）中，操作步骤如下：

尾蚴从感染毛蚴的阳性钉螺得到，去阳性螺放入清水中，在白炽灯下光照2小时左右逸出新鲜尾蚴；

同工序4）中的b）步骤，将聚醚苯酰胺负载到杨树、桐树、和竹粉炭化材料中，用金属环移取适量的尾蚴加入上述不同负载材料缓释药物的水中，在18小时内观察尾蚴的活性，并记录0.5、1、1.5和2小时的尾蚴死亡数。