CN101139378B

CN101139378B - 一种从黄芪中提取毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法

Info

Publication number: CN101139378B
Application number: CN2007101763185A
Authority: CN
Inventors: 韩鲁佳; 肖卫华
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2007-10-24
Filing date: 2007-10-24
Publication date: 2010-12-15
Anticipated expiration: 2027-10-24
Also published as: CN101139378A

Abstract

本发明提供了一种从黄芪中提取分离纯化高纯度毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法，主要包括用醇从黄芪中提取黄芪黄酮，然后经大孔树脂柱层析获得富含毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的流份，用甲醇重结晶法即可获得纯度达97％以上的毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷。本发明所用原料廉价易得，对环境污染小，工艺简单易行，所获得的毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷成本较低、纯度高，适合工业规模化生产。

Description

一种从黄芪中提取毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法

技术领域

本发明涉及一种从中药中提取、分离单体化合物的方法，具体地说，涉及一种从黄芪黄酮粗提物中分离高纯度毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法。属中药有效成分提取方法。

背景技术

黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，具有补气固表、利尿排毒、排脓、敛疮生肌等功效。毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷属于黄酮类化合物中的异黄酮类，是黄芪中含量最高的一种黄酮成分。

药理研究表明：毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷具有多种药理活性，具有抑制低密度脂质蛋白的过氧化、清除DPPH自由基等抗氧化作用，同时具有抗心肌缺血(CN 01126608.2)以及抗柯萨奇病毒(CN200510110641.3)等药理作用，因此毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷具有非常重要的药用价值；同时毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷是黄芪中的主要黄酮成分，并且具有紫外吸收便于检测的特点，因此制备高纯度毛蕊异黄酮苷不仅为黄芪黄酮药效药理研究奠定物质基础，而且对于黄芪及相关制剂的质量控制和标准化具有重要的现实意义。

但由于黄芪中黄酮成分复杂且含量较低(＜1‰)，常规的分离方法需要反复硅胶柱层析，不仅工艺复杂耗时，而且需要消耗大量有毒有害有机溶剂，不利于工业化生产。最新的分离方法如高速逆流技术虽然能达到快速分离的目的，但对生产设备要求较高，同时进样量受到一定限制，因此目前还未能应用于大规模生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单易行、适合于工业化生产的从黄芪中分离高纯度毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种从黄芪中提取毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法，包括如下步骤：

1)黄芪黄酮的提取：以黄芪为原料，粉碎后用醇溶液进行回流提取，提取液减压浓缩除去溶剂，得到黄芪黄酮粗提物；

2)浓缩富集：黄芪黄酮粗提物加水溶解后上大孔树脂，分别用水及乙醇溶液进行分步洗脱，收集乙醇洗脱部分得到富集液；

3)重结晶：富集液减压蒸干后加甲醇重结晶，获得高纯度毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷。

其中，步骤1)中所述醇溶液为乙醇或甲醇，浓度为60～100％，醇溶液与黄芪原料的液固比为10～30ml/g。

所述回流提取的次数为2～3次，回流时间2～3小时。

本发明的回流提取还可采用醇溶液微波辅助提取或甲醇索氏提取。

所述醇溶液微波辅助提取的提取次数为2～3次，温度为90～110℃，时间为20～30分钟，醇溶液与黄芪原料的液固比为20～30ml/g。

所述甲醇索氏提取中提取时间为3～5小时。

本发明的减压浓缩可采用本领域常用的方法和设备进行。

步骤2)中乙醇溶液洗脱时，分别采用20％乙醇和40％乙醇溶液洗脱，或是采用40％乙醇溶液洗脱。

浓缩富集时，可将乙酸乙酯萃取与大孔树脂分离相结合，比如提取所用溶剂为低乙醇浓度时可采用水洗至澄清后2～4倍柱体积的20％乙醇分别洗脱除杂，然后用2～4倍柱体积40％乙醇溶液洗脱富集；或是先采用乙酸乙酯进行萃取3～5次，乙酸乙酯与黄芪黄酮粗提物的用量比为1∶1～3∶1，乙酸乙酯部分上大孔树脂用水至澄清后，用2～4倍柱体积40％乙醇溶液洗脱富集。

所述的大孔树脂为NKA12型大孔树脂。

洗脱收集时，采用薄层层析法(TLC)跟踪检测收集液，也可以采用其他方法如高效液相色谱法(HPLC)检测毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷。

步骤3)中甲醇重结晶进行数次，以5～7次为宜。

本发明步骤3)具体为：将富集液减压蒸干后，加热溶解于甲醇溶液中，然后静置8～12小时使析出沉淀，收集沉淀物并用甲醇重结晶5～7次，获得高纯度的毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷。

本发明分离后的毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷通过与标准品对照，保留时间基本一致，结晶产物的电喷雾质谱结果表明，[M+H]⁺481，[M+H-glc]⁺283，与文献报道的毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷质谱数据完全一致，因此确认分离后的产物毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷。

本发明利用毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷极性较大的特点，采用NKA12型大孔树脂对毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖成分进行了选择性富集分离，采用乙醇进行分步洗脱，将毛蕊异黄酮苷有效地富集，并与其他黄酮成分分离，因此所得的富集产物经重结晶即可得到纯度达到97％以上的高纯度的毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷。

本发明所用原料廉价易得，对环境污染小，工艺简单易行、快捷，所获得的毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷成本较低、纯度高，适合工业化生产。

目前黄芪药材廉价易得，每公斤价格为10～20元，毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷在国内市场价格为100～200元/毫克，每公斤黄芪产毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷400毫克，即产生价值6万元(以150元/毫克计)的高附加值产品，生产过程仅消耗乙醇、甲醇、乙酸乙酯等廉价易得的有机溶剂，原料消耗及劳动力成本以1万元计，每公斤黄芪将产生约5万元的经济效益。因此本发明实现规模化工业生产，产生可观的经济效益。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

取黄芪药材1kg粉碎后，加10倍量(ml/g)97％乙醇回流提取2次，每次2小时。将提取液减压浓缩成浸膏，加水稀释，过滤，滤液上样于NKA12型大孔树脂柱中，先用水洗至流出液澄清，后用4倍柱体积的20％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用2倍柱体积的40％乙醇溶液洗脱，TLC跟踪检测，洗至无毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷检出，收集合并含目标成分的洗脱液减压蒸至干，加甲醇溶解，静置12小时，离心分离得沉淀用甲醇反复重结晶7次，得到纯度达97％以上的白色粉末状固体450mg。

本实施例分离后的毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷通过与标准品对照，保留时间基本一致，结晶产物的电喷雾质谱结果表明，[M+H]⁺481，[M+H-glc]⁺283，与文献报道的毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷质谱数据完全一致，因此确认分离后的产物毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷。

实施例2

取黄芪药材1kg粉碎后，加30倍量(ml/g)60％甲醇回流提取3次，每次3小时。将提取液减压浓缩成浸膏，加水稀释，用乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯与黄芪黄酮粗提物(浸膏)的用量比为1∶1，将萃取液浓缩蒸干，回收乙酸乙酯，浓缩物加水溶解上样于NKA12型大孔树脂柱中，先用水洗至流出液澄清，再用2倍柱体积的40％乙醇溶液洗脱，TLC跟踪检测，洗至无毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷检出，收集合并含目标成分的洗脱液减压蒸干，加甲醇溶解，静置8小时，离心分离得沉淀用甲醇反复重结晶5次，得到纯度达97％以上的白色粉末状固体。

实施例3

取黄芪药材1kg粉碎后，加20倍量(ml/g)80％乙醇微波辅助提取2次，设定温度110℃，每次20min。将提取液减压浓缩成浸膏，加水稀释，过滤，滤液上样于NKA12型大孔树脂柱中，先用水洗至流出液澄清，后用2倍柱体积的20％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用3倍柱体积的40％乙醇溶液洗脱，TLC跟踪检测，洗至无毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷检出，收集合并含目标成分的洗脱液减压蒸干，加甲醇溶解，静置10小时，离心分离得沉淀用甲醇反复重结晶6次，得到纯度达97％以上的白色粉末状固体。

实施例4

取黄芪药材1kg粉碎后，加30倍量(ml/g)70％甲醇微波辅助提取3次，设定温度90℃，每次30min。将提取液减压浓缩成浸膏，加水稀释，用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯与黄芪黄酮粗提物(浸膏)的用量比为3∶1，将萃取液浓缩蒸干，回收乙酸乙酯，浓缩物加水溶解上样于NKA12型大孔树脂柱中，先用水洗至流出液澄清，再用4倍柱体积的40％乙醇溶液洗脱，TLC跟踪检测，洗至无毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷检出，收集合并含目标成分的洗脱液减压蒸干，加甲醇溶解，静置12小时，离心分离得沉淀用甲醇反复重结晶5次，得到纯度达97％以上的白色粉末状固体。

实施例5

取黄芪药材1kg粉碎后，加甲醇索氏提取3小时，将提取液减压浓缩成浸膏，加水稀释，用乙酸乙酯萃取4次，乙酸乙酯与黄芪黄酮粗提物(浸膏)的用量比为2∶1，将萃取液浓缩蒸干，回收乙酸乙酯，浓缩物加水溶解上样于NKA12型大孔树脂柱中，先用水洗至流出液澄清，再用3倍柱体积的40％乙醇溶液洗脱，TLC跟踪检测，洗至无毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷检出，收集合并含目标成分的洗脱液减压蒸干，加甲醇溶解，静置12小时，离心分离得沉淀用甲醇反复重结晶7次，得到纯度达97％以上的白色粉末状固体。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种从黄芪中提取毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2)浓缩富集：黄芪黄酮粗提物加水溶解后上NKA12型大孔树脂，分别用水及乙醇溶液进行分步洗脱，乙醇溶液洗脱时，分别采用20％乙醇和40％乙醇溶液洗脱，或是采用40％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱部分得到富集液；

2.根据权利要求1所述的从黄芪中提取毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法，其特征在于，步骤1)中所述醇溶液为乙醇或甲醇，浓度为60～100％，醇溶液与黄芪原料的液固比为10～30ml/g。

3.根据权利要求1或2所述的从黄芪中提取毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法，其特征在于，所述回流提取的次数为2～3次。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的从黄芪中提取毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法，其特征在于，所述回流提取的时间2～3小时。

5.根据权利要求1所述从黄芪中提取毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法，其特征在于，所述回流提取采用醇溶液微波辅助提取或甲醇索氏提取。

6.根据权利要求5所述从黄芪中提取毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法，其特征在于，所述醇溶液微波辅助提取的提取次数为2～3次，温度为90～110℃，时间为20～30分钟，醇溶液与黄芪原料的液固比为20～30ml/g。

7.根据权利要求5所述从黄芪中提取毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法，其特征在于，甲醇索氏提取时间为3～5小时。

8.根据权利要求1～7任意一项所述的从黄芪中提取毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法，其特征在于，所述黄芪黄酮粗提物在上大孔树脂前，先采用乙酸乙酯进行萃取3～5次，乙酸乙酯与黄芪黄酮粗提物的用量比为1∶1～3∶1。

9.根据权利要求1～7任意一项所述的从黄芪中提取毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法，其特征在于，步骤3)具体为：将富集液减压蒸干后，加热溶解于甲醇溶液中，然后静置8～12小时使析出沉淀，收集沉淀物并用甲醇重结晶5～7次，获得高纯度的毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷。

10.根据权利要求8所述的从黄芪中提取毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法，其特征在于，步骤3)具体为：将富集液减压蒸干后，加热溶解于甲醇溶液中，然后静置8～12小时使析出沉淀，收集沉淀物并用甲醇重结晶5～7次，获得高纯度的毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷。