CN107064386A - 一种ase‑hplc法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法 - Google Patents
一种ase‑hplc法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种ASE‑HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法,该方法提取时耗时少,且检测精度高,属于化学检测领域。该方法采用ASE法萃取黄芪粉末,并收集甲醇萃取液;采用HPLC法测定甲醇萃取液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量。本发明可以代替药典方法对黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷进行提取,以及含量检测。
Description
技术领域
本发明属于化学检测领域,尤其是一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法。
背景技术
《中国药典》2015年版一部制备供试品方法:供试品溶液的制备取本品粉末(过四号筛)约1g,精密称定,置圆底烧瓶中,精密加入甲醇50ml,称定重量,加热回流4小时,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液25ml,回收溶剂至干,残渣加甲醇溶解,转移至5ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
该方法回流时间较长,且对技术人员的专业水平较高。
发明内容
针对上述不足,本发明旨在提供一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法,该方法提取时耗时少,且检测精度高。
为了实现上述技术效果,本发明提供的技术方案是这样的:一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法,依次包括下述步骤:
步骤1:采用ASE法萃取黄芪粉末,并收集甲醇萃取液;
步骤2:采用HPLC法测定甲醇萃取液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量。
优选地,所述的步骤1包括下述子步骤:
步骤S1:将黄芪样品粉碎,过四号筛,取1g与1g硅藻土混合;
步骤S2:将步骤S1所得的混合物装于放有滤膜的ASE萃取池中,加硅藻土至与池口平行;
步骤S3:用甲醇萃取,结束后,将其蒸干后,再用甲醇定容至10ml,过滤。
优选地,步骤S3所述的萃取参数为:压力为1500psi,温度为110℃,时间为5min,次数为3次,冲洗体积为60%,吹扫时间为60%。
优选地,步骤2所述的HPLC法的检测参数为仪器:色谱柱为Thermo SyncronisDim.AQ;柱温为40℃;流速为0.3mL/min;流动相为甲醇-醋酸-水;检测波为283nm。
优选地,所述的色谱柱的规格为1.7μm,50×2.1mm。
优选地,所述的流动相为体积比等于35:4:65的甲醇-醋酸-水。
优选地,所述的ASE萃取池的体积为10ml。
优选地,步骤S3所述的过滤步骤所使用的滤膜为0.22μm。
本发明与传统方法相比,具有下述优点:
本发明曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察,有论文提到使用50%乙醇提取毛蕊异黄酮葡萄糖苷相对含量较高,杂质较少,故对使用甲醇和50%乙醇进行了溶剂考察,结果显示甲醇与50%乙醇提取毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量一致,且杂质峰基本相同,故采用与药典一致的提取溶剂。
本发明采用3因素3水平正交实验方案L9(33)安排实验,考察了3个因素对加速溶剂萃取黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷过程的影响。并最终确定最佳的葡萄糖苷的快速溶剂萃取工艺。
附图说明
图1为以毛蕊异黄酮葡萄糖苷的浓度(ng)-峰面积进行的线性回归图;
图2为毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品的色谱图;
图3为采用ASE法萃取所得的样品供试品溶液的色谱图;
图4为采用药典方法提取所得的样品供试品溶液的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式,对本发明的权利要求书做进一步的详细说明,但不构成对本发明的任何限制,任何在本发明的权利要求保护范围内所做的有限次修改,仍在本发明的权利要求保护范围内。
实施例1
1、仪器设备及试剂
1.1仪器:
电子分析天平(XA205DU)、ASE350快速溶剂萃取仪(美国DIONEX公司)、ThermoU3000 UHPLC液相色谱仪
1.2试剂:
水:符合GB/T 6682规定的一级水;
甲醇(CH4O):色谱纯(液相色谱用);
醋酸(CH3COOH):分析纯。
1.3材料
黄芪(产地内蒙古,批号1511100;产地甘肃,批号15081901;产地内蒙古,批号150718)均购于梧州或玉林药材市场,经广西梧州食品药品检验所副主任中药师黄蘅鉴别。
对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷由中国生物制品检定研究院提供,批号:111920-201505。
2、方法
2.1对照品溶液的制备:取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含50μg的溶液,即得。
2.2供试品溶液的制备
《中国药典》2015年版一部制备供试品方法:供试品溶液的制备取本品粉末(过四号筛)约1g,精密称定,置圆底烧瓶中,精密加入甲醇50ml,称定重量,加热回流4小时,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液25ml,回收溶剂至干,残渣加甲醇溶解,转移至5ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
快速溶剂萃取法(ASE)制备供试品方法:样品经粉碎机粉碎,过四号筛,约1g,精密称定,与1g硅藻土混合均匀,待用,移入到预先放好过滤膜的ASE 10ml萃取池中再加入适量硅藻土,轻轻振摇使之与池口在同一水平线上,拧紧萃取池上盖。萃取结束后,把萃取液转移至蒸发皿中蒸干后用甲醇溶解并定容至10mL容量瓶,溶液过0.22微米滤膜后进入HPLC测定。
2.3 ASE萃取条件
压力为1500psi,温度为110℃,时间为5min,次数为3次,冲洗体积为60%,吹扫时间为60%。
2.4色谱条件与系统适用性试验
a)仪器:Agilent 1290高效液相色谱仪;
b)色谱柱:Thermo Syncronis Dim.(mm)AQ,1.7μm,50×2.1mm;
c)柱温:40℃;
d)流速:0.3mL/min;
e)流动相::甲醇-醋酸-水(35:4:65);
f)检测波长:283nm;
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于3000。
2.5测定法
照高效液相色谱法(通则0512)测定
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
2.6标准限值要求
本品按干燥品计算,含毛蕊异黄酮葡萄糖苷(C22H22O10)不得少于0.020%。
2.7计算(外标法)
式中CR—对照品溶液浓度,单位为微克每升(mg/L);
AX—供试品的峰面积;
AR—对照品峰面积。
注意:
使用前萃取池底部应拆卸清理干净,否则容易引起压力不稳;
萃取池底部的滤纸应在密封圈内,否则引起渗漏;
萃取池装样时松紧适中,太松容易导致提取液过多;
开机前检查气瓶气压是否达到1Mpa;
使用结束后清理干净,萃取池要及时晾干(容易生锈)。
3、结果
3.1线性关系
取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液(0.06358mg/ml),分别精密吸取该溶液0.1μl、0.3μl、0.5μl、1.0μl、1.2μl进入LC测定,并依照上述方法测定。以浓度(ng)-峰面积进行线性回归,求得回归方程:y=11.334x+22.62、R2=0.9914,毛蕊异黄酮葡萄糖苷在6.358~76.296ng范围内呈良好的线性关系。
表1毛蕊异黄酮葡萄糖苷的线性实验结果
3.2重复性试验
取相同批号的样品(批号:1511100)1.0g,共5份,精密称定,按ASE提取方法提取供试品溶液,进样量为1μL,以上述的色谱条件平行试验,测得样品结果见表1,RSD为1.9%。
表2重复性实验结果
批号 | 重复性1 | 重复性2 | 重复性3 | 重复性4 | 重复性5 | RSD% |
1511100 | 0.0285 | 0.0289 | 0.0277 | 0.0285 | 0.0291 | 1.9% |
3.3精密度和稳定性试验
取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液(0.06358mg/ml),连续进样6次,记录峰面积,峰面积RSD为2.3%,表明仪器精密度良好。
取同一供试品溶液,室温下放置,分别于0,2,4,8,12h依法测定。结果黄芪甲苷峰面积的RSD为2.7%,表明供试品溶液在12h内稳定。
3.4样品不同仪器提取结果及与药典方法结果比较(3批)
表3
表4
4、讨论:
4.1 ASE提取溶剂的选择:
在实验中曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察,有论文提到使用50%乙醇提取毛蕊异黄酮葡萄糖苷相对含量较高,杂质较少,故对使用甲醇和50%乙醇进行了溶剂考察,结果显示甲醇与50%乙醇提取毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量一致,且杂质峰基本相同,故采用与药典一致的提取溶剂。
4.2 ASE提取条件的优化
在上述实验基础上,我们采用3因素3水平正交实验方案L9(33)安排实验,考察了3个因素对加速溶剂萃取黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷过程的影响。本实验确定萃取温度、静态萃取时间、循环次数为考察因素(见表5)。
确定l从黄芪中提取毛蕊异黄酮葡萄糖苷的最佳快速溶剂萃取工艺,结果见表6。
表5因素水平
表6正交实验极差分析结果
由极差分析可以看出,提取温度对毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量影响最大,其次是提取次数和提取时间。最终确定最佳提取工艺组合为提取温度110℃,提取时间5min,提取次数3次。
以上所述的仅为本发明的较佳实施例,凡在本发明的精神和原则范围内所做的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法,其特征在于,依次包括下述步骤:
步骤1:采用ASE法萃取黄芪粉末,并收集甲醇萃取液;
步骤2:采用HPLC法测定甲醇萃取液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量。
2.根据权利要求1所述的一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法,其特征在于,所述的步骤1包括下述子步骤:
步骤S1:将黄芪样品粉碎,过四号筛,取1g与1g硅藻土混合;
步骤S2:将步骤S1所得的混合物装于放有滤膜的ASE萃取池中,加硅藻土至与池口平行;
步骤S3:用甲醇萃取,结束后,将其蒸干后,再用甲醇定容至10ml,过滤。
3.根据权利要求2所述的一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法,其特征在于,步骤S3所述的萃取参数为:压力为1500psi,温度为110℃,时间为5min,次数为3次,冲洗体积为60%,吹扫时间为60%。
4.根据权利要求1所述的一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法,其特征在于,步骤2所述的HPLC法的检测参数为仪器:色谱柱为Thermo SyncronisDim.AQ;柱温为40℃;流速为0.3mL/min;流动相为甲醇-醋酸-水;检测波为283nm。
5.根据权利要求4所述的一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法,其特征在于,所述的色谱柱的规格为1.7μm,50×2.1mm。
6.根据权利要求4所述的一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法,其特征在于,所述的流动相为体积比等于35:4:65的甲醇-醋酸-水。
7.根据权利要求2所述的一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法,其特征在于,所述的ASE萃取池的体积为10ml。
8.根据权利要求2所述的一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法,其特征在于,步骤S3所述的过滤步骤所使用的滤膜为0.22μm。
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