CN107064386A - 一种ase‑hplc法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法 - Google Patents

一种ase‑hplc法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种ASE‑HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法，该方法提取时耗时少，且检测精度高，属于化学检测领域。该方法采用ASE法萃取黄芪粉末，并收集甲醇萃取液；采用HPLC法测定甲醇萃取液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量。本发明可以代替药典方法对黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷进行提取，以及含量检测。

Description

一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法
技术领域
本发明属于化学检测领域，尤其是一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法。
背景技术
《中国药典》2015年版一部制备供试品方法：供试品溶液的制备取本品粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流4小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
该方法回流时间较长，且对技术人员的专业水平较高。
发明内容
针对上述不足，本发明旨在提供一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法，该方法提取时耗时少，且检测精度高。
为了实现上述技术效果，本发明提供的技术方案是这样的：一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法，依次包括下述步骤：
步骤1：采用ASE法萃取黄芪粉末，并收集甲醇萃取液；
步骤2：采用HPLC法测定甲醇萃取液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量。
优选地，所述的步骤1包括下述子步骤：
步骤S1：将黄芪样品粉碎，过四号筛，取1g与1g硅藻土混合；
步骤S2：将步骤S1所得的混合物装于放有滤膜的ASE萃取池中，加硅藻土至与池口平行；
步骤S3：用甲醇萃取，结束后，将其蒸干后，再用甲醇定容至10ml，过滤。
优选地，步骤S3所述的萃取参数为：压力为1500psi，温度为110℃，时间为5min，次数为3次，冲洗体积为60％，吹扫时间为60％。
优选地，步骤2所述的HPLC法的检测参数为仪器：色谱柱为Thermo SyncronisDim.AQ；柱温为40℃；流速为0.3mL/min；流动相为甲醇-醋酸-水；检测波为283nm。
优选地，所述的色谱柱的规格为1.7μm，50×2.1mm。
优选地，所述的流动相为体积比等于35:4:65的甲醇-醋酸-水。
优选地，所述的ASE萃取池的体积为10ml。
优选地，步骤S3所述的过滤步骤所使用的滤膜为0.22μm。
本发明与传统方法相比，具有下述优点：
本发明曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察，有论文提到使用50％乙醇提取毛蕊异黄酮葡萄糖苷相对含量较高，杂质较少，故对使用甲醇和50％乙醇进行了溶剂考察，结果显示甲醇与50％乙醇提取毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量一致，且杂质峰基本相同，故采用与药典一致的提取溶剂。
本发明采用3因素3水平正交实验方案L9(33)安排实验，考察了3个因素对加速溶剂萃取黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷过程的影响。并最终确定最佳的葡萄糖苷的快速溶剂萃取工艺。
附图说明
图1为以毛蕊异黄酮葡萄糖苷的浓度(ng)-峰面积进行的线性回归图；
图2为毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品的色谱图；
图3为采用ASE法萃取所得的样品供试品溶液的色谱图；
图4为采用药典方法提取所得的样品供试品溶液的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求书做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明的权利要求保护范围内所做的有限次修改，仍在本发明的权利要求保护范围内。
实施例1
1、仪器设备及试剂
1.1仪器：
电子分析天平(XA205DU)、ASE350快速溶剂萃取仪(美国DIONEX公司)、ThermoU3000 UHPLC液相色谱仪
1.2试剂：
水：符合GB/T 6682规定的一级水；
甲醇(CH4O)：色谱纯(液相色谱用)；
醋酸(CH3COOH)：分析纯。
1.3材料
黄芪(产地内蒙古，批号1511100；产地甘肃，批号15081901；产地内蒙古，批号150718)均购于梧州或玉林药材市场，经广西梧州食品药品检验所副主任中药师黄蘅鉴别。
对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷由中国生物制品检定研究院提供，批号：111920-201505。
2、方法
2.1对照品溶液的制备：取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得。
2.2供试品溶液的制备
《中国药典》2015年版一部制备供试品方法：供试品溶液的制备取本品粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流4小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
快速溶剂萃取法(ASE)制备供试品方法：样品经粉碎机粉碎，过四号筛，约1g，精密称定，与1g硅藻土混合均匀，待用，移入到预先放好过滤膜的ASE 10ml萃取池中再加入适量硅藻土，轻轻振摇使之与池口在同一水平线上，拧紧萃取池上盖。萃取结束后，把萃取液转移至蒸发皿中蒸干后用甲醇溶解并定容至10mL容量瓶，溶液过0.22微米滤膜后进入HPLC测定。
2.3 ASE萃取条件
压力为1500psi，温度为110℃，时间为5min，次数为3次，冲洗体积为60％，吹扫时间为60％。
2.4色谱条件与系统适用性试验
a)仪器：Agilent 1290高效液相色谱仪；
b)色谱柱：Thermo Syncronis Dim.(mm)AQ，1.7μm，50×2.1mm；
c)柱温：40℃；
d)流速：0.3mL/min；
e)流动相：：甲醇-醋酸-水(35:4:65)；
f)检测波长：283nm；
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于3000。
2.5测定法
照高效液相色谱法(通则0512)测定
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.6标准限值要求
本品按干燥品计算，含毛蕊异黄酮葡萄糖苷(C22H22O10)不得少于0.020％。
2.7计算(外标法)
式中CR—对照品溶液浓度，单位为微克每升(mg/L)；
AX—供试品的峰面积；
AR—对照品峰面积。
注意：
使用前萃取池底部应拆卸清理干净，否则容易引起压力不稳；
萃取池底部的滤纸应在密封圈内，否则引起渗漏；
萃取池装样时松紧适中，太松容易导致提取液过多；
开机前检查气瓶气压是否达到1Mpa；
使用结束后清理干净，萃取池要及时晾干(容易生锈)。
3、结果
3.1线性关系
取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液(0.06358mg/ml),分别精密吸取该溶液0.1μl、0.3μl、0.5μl、1.0μl、1.2μl进入LC测定，并依照上述方法测定。以浓度(ng)-峰面积进行线性回归，求得回归方程：y＝11.334x+22.62、R2＝0.9914,毛蕊异黄酮葡萄糖苷在6.358～76.296ng范围内呈良好的线性关系。
表1毛蕊异黄酮葡萄糖苷的线性实验结果
3.2重复性试验
取相同批号的样品(批号：1511100)1.0g，共5份，精密称定，按ASE提取方法提取供试品溶液，进样量为1μL，以上述的色谱条件平行试验，测得样品结果见表1，RSD为1.9％。
表2重复性实验结果
批号 重复性1 重复性2 重复性3 重复性4 重复性5 RSD％
1511100 0.0285 0.0289 0.0277 0.0285 0.0291 1.9％
3.3精密度和稳定性试验
取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液(0.06358mg/ml)，连续进样6次，记录峰面积，峰面积RSD为2.3％，表明仪器精密度良好。
取同一供试品溶液，室温下放置，分别于0，2，4，8，12h依法测定。结果黄芪甲苷峰面积的RSD为2.7％，表明供试品溶液在12h内稳定。
3.4样品不同仪器提取结果及与药典方法结果比较(3批)
表3
表4
4、讨论：
4.1 ASE提取溶剂的选择：
在实验中曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察，有论文提到使用50％乙醇提取毛蕊异黄酮葡萄糖苷相对含量较高，杂质较少，故对使用甲醇和50％乙醇进行了溶剂考察，结果显示甲醇与50％乙醇提取毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量一致，且杂质峰基本相同，故采用与药典一致的提取溶剂。
4.2 ASE提取条件的优化
在上述实验基础上，我们采用3因素3水平正交实验方案L9(33)安排实验，考察了3个因素对加速溶剂萃取黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷过程的影响。本实验确定萃取温度、静态萃取时间、循环次数为考察因素(见表5)。
确定l从黄芪中提取毛蕊异黄酮葡萄糖苷的最佳快速溶剂萃取工艺，结果见表6。
表5因素水平
表6正交实验极差分析结果
由极差分析可以看出，提取温度对毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量影响最大，其次是提取次数和提取时间。最终确定最佳提取工艺组合为提取温度110℃，提取时间5min，提取次数3次。
以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：
步骤1：采用ASE法萃取黄芪粉末，并收集甲醇萃取液；
步骤2：采用HPLC法测定甲醇萃取液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量。
2.根据权利要求1所述的一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法，其特征在于，所述的步骤1包括下述子步骤：
步骤S1：将黄芪样品粉碎，过四号筛，取1g与1g硅藻土混合；
步骤S2：将步骤S1所得的混合物装于放有滤膜的ASE萃取池中，加硅藻土至与池口平行；
步骤S3：用甲醇萃取，结束后，将其蒸干后，再用甲醇定容至10ml，过滤。
3.根据权利要求2所述的一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法，其特征在于，步骤S3所述的萃取参数为：压力为1500psi，温度为110℃，时间为5min，次数为3次，冲洗体积为60％，吹扫时间为60％。
4.根据权利要求1所述的一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法，其特征在于，步骤2所述的HPLC法的检测参数为仪器：色谱柱为Thermo SyncronisDim.AQ；柱温为40℃；流速为0.3mL/min；流动相为甲醇-醋酸-水；检测波为283nm。
5.根据权利要求4所述的一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法，其特征在于，所述的色谱柱的规格为1.7μm，50×2.1mm。
6.根据权利要求4所述的一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法，其特征在于，所述的流动相为体积比等于35:4:65的甲醇-醋酸-水。
7.根据权利要求2所述的一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法，其特征在于，所述的ASE萃取池的体积为10ml。
8.根据权利要求2所述的一种ASE-HPLC法测定黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法，其特征在于，步骤S3所述的过滤步骤所使用的滤膜为0.22μm。
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