CN103149300A - 黄芪颗粒指纹图谱的测定方法及其特征指纹图谱 - Google Patents

黄芪颗粒指纹图谱的测定方法及其特征指纹图谱 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黄芪颗粒指纹图谱的测定方法，包括以下步骤：供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、高效液相色谱仪测定及对数据和图谱的处理，以及由该方法得到的黄芪颗粒特征指纹图谱。与现有技术相比，本发明所得黄芪颗粒指纹图谱的峰多，峰形好，峰分离效果好，峰面积较大，易于鉴别，相似性高，准确可靠；本发明方法简便、快捷、准确、稳定、可靠，可用于黄芪颗粒样品的质量控制，能更加全面、客观、科学地评价黄芪颗粒的质量，为黄芪颗粒的合理用药及进一步药效研究提供了依据与参考。

Description

黄芪颗粒指纹图谱的测定方法及其特征指纹图谱
技术领域
本发明涉及中药指纹图谱分析方法，特别是黄芪颗粒HPLC特征指纹图谱的测定方法以及由此方法所得到的黄芪颗粒的特征指纹图谱。
背景技术
我国传统的中药及其制剂大多缺乏严密的质量标准和科学的检测手段，难以有效的控制其内在质量，不能保证用药的安全、有效，也不符合国际医药市场的要求，严重制约了我国中药行业的发展。加强中药材质量控制研究是中药规范化、标准化的关键问题。只有对中药材进行科学的质量控制，才能保证中药质量，实现中药的“安全、有效、稳定、可控”。
黄芪颗粒收载于《中药部颁标准》，标准编号：WS3-B-2224-96，是黄芪药材全成分提取物，为棕黄色颗粒，该药疗效确切，临床应用广泛，对慢性肾病、心血管系统疾病、糖尿病、肿瘤化疗放疗以及手术后、慢性鼻炎、骨质疏松等疾病具有较好的临床效果。该标准中主要以薄层色谱定性鉴别方法控制制剂质量，目前市场上生产黄芪颗粒的厂家较多，临床需求量巨大，现行的质量控制技术标准已经不能满足黄芪颗粒应用发展之需要。
近年来，关于黄芪颗粒质量控制已有一定研究报道，有学者采用分光光度法建立黄芪颗粒中总黄酮的含量测定方法，四川大学华西药学院对黄芪颗粒中黄芪甲苷和总皂苷含量测定进行了研究，这些研究为黄芪颗粒的质量控制提供了一定参考，具有一定价值。
目前，也有一些采用HPLC建立黄芪颗粒的特征指纹图谱分析方法，比如：
公开号为“CN102353729A”、名称为“一种黄芪药材的质量检测方法”的专利文献中，采用乙腈-水系统作为流动相系统，但得到的指纹图谱中只有7个共有色谱峰；并且其针对的是黄芪药材，而不是黄芪颗粒制剂。
公告号为“CN101327246B”、名称为“黄芪药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法和标准指纹图谱”的专利文件中，采用80%-95%的甲醇作为提取溶剂，乙腈-水系统作为流动相系统，其得到的指纹图谱分离度不是很好，只有19个特征色谱峰。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种黄芪颗粒指纹图谱的测定方法及其特征指纹图谱。本发明通过对黄芪颗粒HPLC指纹图谱的研究，提供了一种快速评价黄芪颗粒质量的方法，弥补了现有质量控制技术的不足，使黄芪颗粒的质量控制技术更为完善、科学。
本发明的技术方案：黄芪颗粒指纹图谱的测定方法包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：取黄芪颗粒粉碎，过筛，称取粉末，加甲醇溶液溶解，超声提取1～2次，每次5～30min，然后冷却，补足损失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
（2）对照品溶液的制备：取减压干燥至恒重的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素对照品，分别加入甲醇制成对照品溶液；
（3）测定：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；供试品溶液注入高效液相色谱仪后，以甲醇-0.5%甲酸水为流动相进行梯度洗脱；
（4）用指纹图谱软件对所得的图谱进行处理，即得到黄芪颗粒特征指纹图谱。
前述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法中，高效液相色谱测定时的色谱条件为：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱；流动相A为甲醇，流动相B为0.5%甲酸水，A∶B=2%-90%∶98%-10%；流速1mL·min-1；柱温30℃；检测波长254nm。
前述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法中，供试品溶液的制备过程为：取黄芪颗粒粉碎，过60目筛，精密称取粉末1.0g，加入10%甲醇溶液10mL溶解，超声提取5min，然后冷却，补足损失重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。
前述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法中，对照品溶液的制备为：取减压干燥至恒重的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素对照品，分别加入甲醇，制成每1mL分别含0.562mg毛蕊异黄酮苷、0.254mg芒柄花苷、0.357mg毛蕊异黄酮、0.274mg芒柄花素的对照品溶液。
前述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法中，步骤（3）中分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5-20μL，优选为10μL。
前述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法中，流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的A、B相变化为：0～10min，A相2%-2%；10～15min，A相2%-3%；15～20min，A相3%-10%；20-25min，A相10%-15%；25-40min，A相15%-20%；40-45min，A相20%-30%；45-50min，A相30%-40%；50-60min，A相40%-56%；60-72min，A相56%-70%；72-80min，A相70%-90%；80-90min，A相90%-90%。
前述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法中，配制好的对照品溶液储存在4℃的冰箱中备用。
如前所述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法得到的黄芪颗粒特征指纹图谱；所述图谱中的共有峰为23个。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明采用高效液相色谱法，建立黄芪颗粒的特征指纹图谱分析方法，除了应用常用的相似度分析外，还采用Simca-P11.5软件进行主成分分析（PCA），同时结合SPSS聚类分析对多个批次样品进行系统分析，能更加全面、客观、科学评价黄芪颗粒的质量，为黄芪颗粒的合理用药及进一步药效研究提供依据与参考。
2.本发明建立了黄芪颗粒HPLC特征指纹图谱共有模式，标定了23个共有峰，指认了其中4个共有峰，比现有技术指认的色谱峰多，表明其建立的指纹图谱技术含量高。统计结果显示，不同生产时间30批次黄芪颗粒被分为两大类，两类样品的色谱峰共有模式具有一定差异，这与黄芪颗粒原料黄芪药材有两个法定来源相吻合。因而本发明方法简便、快捷、准确、稳定、可靠，可用于黄芪颗粒样品的质量控制。
3.由于指纹图谱不是为了测定某个成分的精确含量，而是要充分反映化学成分的信息。因此，本发明选择在254nm波长处进行测定，其出峰较多，反映的信息较完全；各个峰吸收值良好，基线平稳，也避免了近紫外杂质峰较大吸收情况。
4.本发明方法所得黄芪颗粒指纹图谱的峰多，峰形好，易于鉴别，相似性高，准确可靠。
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。
附图说明
图1是30批次黄芪颗粒指纹图谱叠加图；
图2是黄芪颗粒样品的共有模式图谱；
图3是不同批次黄芪颗粒样品主成分分析结果图；
图4是不同批次黄芪颗粒样品聚类分析结果图；
图5是黄芪颗粒样品的共有模式差异性比较图；
图6是选用不同提取溶剂的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；
图7是选取不同提取溶剂用量的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；
图8是选取不同超声提取时间的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；
图9是以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；
图10是以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；
图11是以甲醇-0.5%甲酸水为流动相进行梯度洗脱的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；
图12是以甲醇-0.1%甲酸水为流动相进行梯度洗脱的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；
图13是以甲醇-0.1%乙酸水为流动相进行梯度洗脱的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；
图14是用色谱柱Diamonsil C18（4.6mm*150mm，25μm）测得的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；
图15是用色谱柱Hypersil ODS（4.0*250mm，5μm）测得的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；
图16是用色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18（4.6*250mm，5μm）测得的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；
图17是用色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18（4.6*150mm，5μm）测得的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；
图18是用色谱柱Phecda C18（4.6*250mm，5μm）测得的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；
图19是在210nm、230nm、254nm、270nm、290nm、300nm、330nm波长处进行测定的黄芪颗粒HPLC指纹图谱；
图20是柱温为25℃、30℃、35℃时测得的黄芪颗粒HPLC指纹图谱。
具体实施方式
本发明的实施例1：黄芪颗粒指纹图谱的测定方法包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：取黄芪颗粒粉碎，过60目筛，精密称取粉末1.0g，加入10%甲醇溶液10mL溶解，超声提取5min，然后冷却，补足损失重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液；
（2）对照品溶液的制备：取减压干燥至恒重的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素对照品，分别加入甲醇，制成每1mL分别含0.562mg毛蕊异黄酮苷、0.254mg芒柄花苷、0.357mg毛蕊异黄酮、0.274mg芒柄花素的对照品溶液（储存在4℃的冰箱中备用）；
（3）测定：色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（5μm×4.6×250mm）；流动相A为甲醇，流动相B为0.5%甲酸水，A∶B=2%-90%∶98%-10%；流速1mL·min-1；柱温30℃；检测波长254nm；分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；供试品溶液注入高效液相色谱仪后，以甲醇-0.5%甲酸水为流动相进行梯度洗脱；梯度洗脱过程中，洗脱液的A、B相变化为：0～10min，A相2%-2%；10～15min，A相2%-3%；15～20min，A相3%-10%；20-25min，A相10%-15%；25-40min，A相15%-20%；40-45min，A相20%-30%；45-50min，A相30%-40%；50-60min，A相40%-56%；60-72min，A相56%-70%；72-80min，A相70%-90%；80-90min，A相90%-90%；
（4）用指纹图谱软件对所得的图谱进行处理，即得到黄芪颗粒特征指纹图谱。
本发明的实施例2：黄芪颗粒指纹图谱的测定方法包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：取黄芪颗粒粉碎，过60目筛，精密称取粉末1.0g，加入10%甲醇溶液10mL溶解，超声提取10min，然后冷却，补足损失重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液；
（2）对照品溶液的制备：取减压干燥至恒重的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素对照品，分别加入甲醇，制成每1mL分别含0.562mg毛蕊异黄酮苷、0.254mg芒柄花苷、0.357mg毛蕊异黄酮、0.274mg芒柄花素的对照品溶液（储存在4℃的冰箱中备用）；
（3）测定：色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（5μm×4.6×250mm）；流动相A为甲醇，流动相B为0.5%甲酸水，A∶B=2%-90%∶98%-10%；流速1mL·min-1；柱温30℃；检测波长254nm；分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5μL，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；供试品溶液注入高效液相色谱仪后，以甲醇-0.5%甲酸水为流动相进行梯度洗脱；
（4）用指纹图谱软件对所得的图谱进行处理，即得到黄芪颗粒特征指纹图谱。
本发明的实施例3：黄芪颗粒指纹图谱的测定方法包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：取黄芪颗粒粉碎，过60目筛，精密称取粉末1.0g，加入10%甲醇溶液10mL溶解，超声提取2次，每次30min，然后冷却，补足损失重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液；
（2）对照品溶液的制备：取减压干燥至恒重的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素对照品，分别加入甲醇，制成每1mL分别含0.562mg毛蕊异黄酮苷、0.254mg芒柄花苷、0.357mg毛蕊异黄酮、0.274mg芒柄花素的对照品溶液；
（3）测定：色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱；流动相A为甲醇，流动相B为0.5%甲酸水，A∶B=2%-90%∶98%-10%；流速1mL·min-1；柱温30℃；检测波长254nm；分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；供试品溶液注入高效液相色谱仪后，以甲醇-0.5%甲酸水为流动相进行梯度洗脱；
（4）用指纹图谱软件对所得的图谱进行处理，即得到黄芪颗粒特征指纹图谱。
实验例：
1.仪器与试药
1.1仪器
安捷伦1260高效液相色谱仪（Agilent G1315D-1260DAD检测器）；KQ-250B型超声波清洁器（昆山市超声仪器有限公司，功率250w)；电子分析天平（Al205型，梅特勒-托利多仪器，上海有限公司）。
1.2试药
甲醇，色谱纯；乙腈，色谱纯；水为蒸馏水；其他试剂为分析纯。
毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素，其批号分别为：M-020-110119，M-021-101215，C-018-101228，M-013-101116，成都瑞芬思生物科技有限公司提供；黄芪颗粒，贵州汉方制药有限公司提供的2010-2011年生产的30批次黄芪颗粒，其样品信息见表1。
表1不同批次样品信息表
2.测定条件的筛选
2.1供试品制备条件
2.1.1提取溶剂的选择
试验研究过程中，申请人首先对不同提取溶剂蒸馏水、10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇进行了对比研究。结果见图6。
研究结果显示，10%甲醇提取效果最好。
2.1.2溶剂用量的选择
申请人对溶剂用量10mL、15mL、20mL、25mL进行了对比研究，结果见图7（S1：10mL、S2：15mL、S3：20mL、S4：25mL）。
随着溶剂体积的增加，峰的响应值明显减小，暂以精密加入10mL和定容到10mL比较，基本没有差别，故定容到10mL为宜。一来可以节约溶剂，二来使得操作方便。
2.1.3超声提取时间的选择
申请人对超声提取5min、10min、15min、20min、25min、30min进行了对比研究，结果见图8（S1：5min、S2：10min、S3：15min、S4：20min、S5：25min、S6：30min）。
从上图可以明显看出，不同提取时间的0-70min峰型与响应值差别不大，关键在于约82分钟出的峰在明显减小，这可能是由于化合物被分解，故选取5min作为超声提取时间，一来可以节约时间和电能，二来峰型和响应值都比较优良。
综上所述，通过以上试验，确定的供试品溶液制备条件为：取黄芪颗粒粉碎，过60目筛，精密称取粉末1.0g，置25mL具塞锥形瓶中，加入10%甲醇溶液10mL溶解，超声提取5min，然后冷却，补足损失重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得。
2.2色谱条件
2.2.1流动相的选择
申请人采用（1）甲醇-水，（2）乙腈-水，(3)甲醇-0.5%甲酸水，（4）甲醇-0.1%甲酸水，（5）甲醇-0.1%乙酸水这五组流动相系统，进行了不同梯度洗脱条件的优选，结果见图9-13。
结论：甲醇-水和乙腈-水作流动相时，峰的分离度不好；用甲醇-0.1%甲酸水和甲醇-0.1%乙酸水作流动相时，在前15min的两个峰明显未分离开；而甲醇-0.5%甲酸水作为流动相时，洗脱效果比其他四种流动相系统明显要好，梯度洗脱效果最佳，谱图上各个色谱峰的分离度良好，保留时间适中，因此选择甲醇-0.5%甲酸水系统作为流动相梯度洗脱系统。
2.2.2液相色谱柱的选择
指纹图谱的研究一般需要用三根以上不同的色谱柱进行比较，经过实验比较后，固定用同一根色谱柱做完整个指纹图谱。申请人考察了5根不同的色谱柱[①色谱柱Diamonsil C18（4.6mm*150mm，25μm）；②色谱柱Hypersil ODS（4.0*250mm，5μm）；③色谱柱AgilentZORBAX SB-C18（4.6*250mm，5μm）；④色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18（4.6*150mm，5μm）；⑤色谱柱Phecda C18（4.6*250mm，5μm）]，在选定的相同色谱条件下进行测定，结果见图14-18。
结论：可见柱③的分离效果最好，柱效最高，故选择柱③进行黄芪颗粒指纹图谱的检测。
2.2.3检测波长的选择
采用DAD检测器3D图谱对检测波长210nm、230nm、254nm、270nm、290nm、300nm、330nm进行了筛选，结果见图19。
从图19明显看出，在254nmDAD波长下，化合物吸收达最大，其出峰较多，反映的信息较完全，各个峰吸收值良好，基线平稳，因此选择254nm作为DAD检测波长。
2.2.4柱温的选择
柱温是一个重要的操作参数，直接影响分离效能和分析速度。对不同柱温25℃、30℃、35℃分别进行了考察，结果见图20（S1：25℃、S2：30℃、S3：35℃）。
由图20可知，25℃时的出峰时间稍晚于30℃和35℃时，13min左右的峰未分离开，且柱温较低，增长了分析时间；30℃和35℃的色谱图区别不大，根据一般原则：在使最难分离的组分有尽可能好的分离前提下，采取适当低的柱温，但以保留时间适宜，峰形不拖尾为度，因此选择柱温为30℃。
通过以上实验，最终优化确定了色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(5μm×4.6×250mm)；流动相：甲醇（A相）-0.5%甲酸水（B相）；流速：1mL·min-1；柱温：30℃；检测波长：254nm；进样量：10μL；在此条件下，各色谱峰分离良好，可用于黄芪颗粒指纹图谱分析。
3.黄芪颗粒指纹图谱的测定
3.1色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(5μm×4.6×250mm)；流动相：甲醇（A）-0.5%甲酸水（B）；梯度洗脱：0-10min,2%-2%A；10-15min,2%-3%A；15-20min,3%-10%A；20-25min,10%-15%A；25-40min,15%-20%A；40-45min,20%-30%A；45-50min,30%-40%A；50-60min,40%-56%A；60-72min,56%-70%A；72-80min,70%-90%A；80-90min,90%-90%A；流速1mL·min-1；柱温30℃；检测波长254nm；进样量10μL。
3.2对照品溶液的制备：取减压干燥至恒重的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素对照品于10mL容量瓶中，分别加入甲醇，制成每1mL分别含0.562mg毛蕊异黄酮苷、0.254mg芒柄花苷、0.357mg毛蕊异黄酮、0.274mg芒柄花素的对照品溶液，将配制好的对照品溶液储存在4℃的冰箱中，备用。
3.3供试品溶液的制备：取黄芪颗粒粉碎，过60目筛，精密称取粉末1.0g，置25mL具塞锥形瓶中，加入10%甲醇溶液10mL溶解，超声提取5min，然后冷却，补足损失重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得。
3.4方法学考察
3.4.1精密度实验
取同一份供试品溶液，按3.1项下色谱条件连续进样6次，测定结果见表2。
表2  精密度试验结果表
编号1 编号2 编号3 编号4 编号5 编号6 RSD(%)
1号峰 78.8 77.22 79.59 78.01 79.19 78.41 0.65
2号峰 57.6 56.45 58.18 57.02 57.89 57.31 0.50
3号峰 105.7 103.59 106.76 104.64 106.23 105.17 0.90
4号峰 201.6 197.57 203.62 199.58 202.61 200.59 1.87
5号峰 443.2 434.34 447.63 438.77 445.42 440.98 1.50
6号峰 378.5 370.93 382.29 374.72 380.39 376.61 2.25
7号峰 50.7 49.69 51.21 50.19 50.95 50.45 0.42
8号峰 90.2 88.40 91.10 89.30 90.65 89.75 0.55
9号峰 203 198.94 205.03 200.97 204.02 201.99 1.80
10号峰 344.5 337.61 347.95 341.06 346.22 342.78 2.68
11号峰 82 80.36 82.82 81.18 82.41 81.59 0.58
12号峰 204.7 200.61 206.75 202.65 205.72 203.68 1.48
13号峰 82.3 80.65 83.12 81.48 82.71 81.89 0.54
14号峰 75.3 73.79 76.05 74.55 75.68 74.92 0.79
15号峰 34.4 33.71 34.74 34.06 34.57 34.23 0.25
16号峰 433.1 424.44 437.43 428.77 435.27 430.93 2.59
17号峰 63.3 62.03 63.93 62.67 63.62 62.98 0.55
18号峰 33.9 33.22 34.24 33.56 34.07 33.73 0.32
19号峰 133.8 131.12 135.14 132.46 134.47 133.13 0.90
20号峰 278.8 273.22 281.59 276.01 280.19 277.41 1.63
21号峰 76.5 74.97 77.27 75.74 76.88 76.12 0.70
22号峰 20.8 20.38 21.01 20.59 20.90 20.70 0.22
23号峰 23.8 23.32 24.04 23.56 23.92 23.68 0.25
由表2可知，测得各共有峰峰面积的RSD均小于3%，说明精密度良好。
3.4.2重复性实验
取同一批样品6份，分别按3.3项下操作制备供试品溶液，按3.1项下色谱条件分别进样，测定结果见表3。
表3  重复性试验结果表
编号1 编号2 编号3 编号4 编号5 编号6 RSD(%)
1号峰 94.9 94 94.2 93.9 95.8 96.2 0.72
2号峰 61.7 61.1 61.3 61 62.3 62.6 0.56
3号峰 73.3 72.6 72.8 72.5 74 74.3 0.74
4号峰 154.8 153.4 153.7 153.1 156.3 157 1.66
5号峰 349.9 346.8 347.5 346.1 353.4 354.8 4.71
6号峰 319.7 316.8 317.5 316.2 322.9 324.2 1.93
7号峰 37 36.7 36.7 36.6 37.4 37.5 1.05
8号峰 57.7 57.2 57.3 57.1 58.3 58.5 0.62
9号峰 214.8 212.9 213.3 212.4 216.9 217.8 1.79
10号峰 286.3 283.7 284.3 283.2 289.2 290.3 3.67
11号峰 54.7 54.2 54.3 54.1 55.2 55.5 0.62
12号峰 244.9 242.7 243.2 242.2 247.3 248.3 1.57
13号峰 72.9 72.2 72.4 72.1 73.6 73.9 1.22
14号峰 66 65.4 65.5 65.3 66.7 66.9 0.99
15号峰 19.3 19.1 19.2 19.1 19.5 19.6 0.37
16号峰 318.8 315.9 316.6 315.3 322 323.3 1.3
17号峰 50 49.6 49.7 49.5 50.5 50.7 0.58
18号峰 36 35.7 35.7 35.6 36.3 36.5 0.32
19号峰 108.8 107.8 108 107.6 109.9 110.3 0.99
20号峰 227 225 225.4 224.5 229.3 230.2 3.19
21号峰 74.4 73.7 73.9 73.6 75.1 75.4 0.96
22号峰 23.5 23.3 23.3 23.2 23.7 23.8 0.2
23号峰 26.3 26.1 26.1 26 26.6 26.7 0.23
由表3可知，测得其各共有峰峰面积的RSD均小于3%，表明重复性较好。
3.4.3稳定性实验
取同一份供试品溶液，按3.1项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24h进样测定，测定结果见表4。
表4  稳定性试验结果表
0h 2h 4h 6h 8h 12h 24h RSD(%)
1号峰 99.6 98.7 98.9 98.5 100.6 101 99.4 0.73
2号峰 88 87.2 87.4 87 88.9 89.2 87.8 0.89
3号峰 75.4 74.7 74.9 74.6 76.2 76.5 75.2 0.6
4号峰 130.4 129.2 129.5 129 131.7 132.2 130.1 1.81
5号峰 379.7 376.3 377 375.5 383.5 385 378.9 1.85
6号峰 247.1 244.9 245.4 244.4 249.6 250.6 246.6 1.19
7号峰 75.5 74.8 75 74.7 76.3 76.6 75.3 0.52
8号峰 66.6 66 66.1 65.9 67.3 67.5 66.5 0.55
9号峰 78.4 77.7 77.9 77.5 79.2 79.5 78.2 1.86
10号峰 137.5 136.3 136.5 136 138.9 139.4 137.2 2.78
11号峰 71.5 70.9 71 70.7 72.2 72.5 71.4 0.73
12号峰 380.7 377.3 378 376.5 384.5 386 379.9 2.44
13号峰 113 112 112.2 111.8 114.1 114.6 112.8 1.12
14号峰 101.2 100.3 100.5 100.1 102.2 102.6 101 0.86
15号峰 39.7 39.3 39.4 39.3 40.1 40.3 39.6 0.35
16号峰 453.6 449.5 450.4 448.6 458.1 460 452.7 1.53
17号峰 58.7 58.2 58.3 58.1 59.3 59.5 58.6 0.6
18号峰 33.4 33.1 33.2 33 33.7 33.9 33.3 0.33
19号峰 146.9 145.6 145.9 145.3 148.4 149 146.6 1.06
20号峰 266.6 264.2 264.7 263.7 269.3 270.3 266.1 1.36
21号峰 85.9 85.1 85.3 85 86.8 87.1 85.7 0.97
22号峰 23.6 23.4 23.4 23.3 23.8 23.9 23.6 0.21
23号峰 26.8 26.6 26.6 26.5 27.1 27.2 26.7 0.23
由表4可知，其各共有峰峰面积的RSD均小于3%，表明样品溶液在24h内稳定。
3.5样品测定
取30批黄芪颗粒样品，按3.3项下方法制备供试品溶液，在3.1项的色谱条件下依次进样检测，记录色谱图及各共有峰的峰面积。
4.数据、结果分析
4.1HPLC指纹图谱
由图1可见共有模式图谱有23个共有峰（S1-S30分别指第1到第30批药材，是药材批次的代码；R代表30批药材的共有模式图谱），峰位指认见图2，根据对照品指认4号峰为芒柄花苷，5号峰为毛蕊异黄酮苷，10号峰为毛蕊异黄酮，13号峰为芒柄花素。
4.2相似度计算与分析
按中国药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》2004A版进行计算，得出相应的对照图谱及相似度值。
将30批次黄芪颗粒样品的图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》，经过选峰，设定其匹配模板，将色谱峰进行自动匹配；设定标准模板，进行色谱峰差异性评价和整体相似性评价，计算相似度，相似度结果见表5。由相似度结果可知，不同批次样品之间存在较大差异，相似度在0.74-0.99之间。
表5不同批次黄芪颗粒样品相似度结果
Figure BDA00002883282600111
4.3主成分分析
用Simca-P11.5软件(Umetrics,Umea,Sweden)，以黄芪颗粒样品HPLC图谱中各相对峰面积值为变量,进行主成分分析研究。
从测定结果来看，不同批次的黄芪颗粒样品中各色谱峰的峰面积数据离散，利用化学计量学中的主成分分析，可以把离散的数据标准化处理，以便对样品中的特征色谱峰进行明确的评价。应用Simca-P11.5软件对原始数据进行标准化处理后进行主成分分析，分析结果见图3。主成分分析结果显示，不同批次30批黄芪颗粒样品被分为2类，其中22-30号样品为一类；1-21号样品为第二类。
4.4聚类分析
以黄芪颗粒样品HPLC图谱各相对峰面积值为变量，数据通过SPSS17.0软件进行聚类分析与t检验，置信区间设为95%，所得P值与0.05比较，当P>0.05时没有显著性差异；P<0.05时有显著性差异。
根据黄芪颗粒样品中各色谱峰的峰面积采用最长距离法分别对30批样品应用SPSS17.0统计软件进行聚类分析(见图4)。结果显示：30批黄芪颗粒样品被分为2类，其中22-30号样品为一类；1-21号样品为第二类，这与主成分分析结果一致。
4.5黄芪颗粒样品差异性分析
由“4.2-4.4”项下分析结果可知，30批次黄芪颗粒样品整体差异性较大，为此，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件（国家药典委员会2004A版），对两类黄芪颗粒进行进一步分析，分析发现：1-21号样品之间的相似度均在0.9以上，22-30号样品之间除30号样品外，其余样品相似度均在0.9以上，结果见表6、表7。1-21号样品共有模式（A）与22-30号样品共有模式（B）之间具有一定差异，见图5，主要区别在于区域Ⅰ和Ⅱ存在较大差异，这可能与黄芪颗粒制备过程中所投原料药黄芪药材在《中国药典》中有两种法定来源有关。
表6  1-21批次黄芪颗粒样品相似度结果
Figure BDA00002883282600121
表7  22-30批次黄芪颗粒样品相似度结果
Figure BDA00002883282600122
4.6不同批次样品质量分析结果：对2010-2011年贵州汉方制药有限公司生产的30个批次黄芪颗粒进行考察，不同批次样品被分为两大类，两类样品色谱峰共有模型差异较大，其原因与黄芪颗粒制剂原料黄芪药材在《中国药典》中具有两个法定来源有关，分别是蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.monghoLicus(Bge.)Hsiao、膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge。

Claims (10)

1.一种黄芪颗粒指纹图谱的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：取黄芪颗粒粉碎，过筛，称取粉末，加甲醇溶液溶解，超声提取1～2次，每次5～30min，然后冷却，补足损失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
（2）对照品溶液的制备：取减压干燥至恒重的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素对照品，分别加入甲醇制成对照品溶液；
（3）测定：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；供试品溶液注入高效液相色谱仪后，以甲醇-0.5%甲酸水为流动相进行梯度洗脱；
（4）用指纹图谱软件对所得的图谱进行处理，即得到黄芪颗粒特征指纹图谱。
2.根据权利要求1所述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法，其特征在于：高效液相色谱测定时的色谱条件为：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱；流动相A为甲醇，流动相B为0.5%甲酸水，A∶B=2%-90%∶98%-10%；流速1mL·min-1；柱温30℃；检测波长254nm。
3.根据权利要求1所述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法，其特征在于：供试品溶液的制备过程为：取黄芪颗粒粉碎，过60目筛，精密称取粉末1.0g，加入10%甲醇溶液10mL溶解，超声提取5min，然后冷却，补足损失重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。
4.根据权利要求1所述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法，其特征在于：对照品溶液的制备为：取减压干燥至恒重的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素对照品，分别加入甲醇，制成每1mL分别含0.562mg毛蕊异黄酮苷、0.254mg芒柄花苷、0.357mg毛蕊异黄酮、0.274mg芒柄花素的对照品溶液。
5.根据权利要求1所述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法，其特征在于：步骤（3）中分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5-20μL。
6.根据权利要求5所述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法，其特征在于：步骤（3）中分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μL。
7.根据权利要求2所述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法，其特征在于：流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的A、B相变化为：0～10min，A相2%-2%；10～15min，A相2%-3%；15～20min，A相3%-10%；20-25min，A相10%-15%；25-40min，A相15%-20%；40-45min，A相20%-30%；45-50min，A相30%-40%；50-60min，A相40%-56%；60-72min，A相56%-70%；72-80min，A相70%-90%；80-90min，A相90%-90%。
8.根据权利要求4所述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法，其特征在于：配制好的对照品溶液储存在4℃的冰箱中备用。
9.如权利要求1～8中任一项所述黄芪颗粒指纹图谱的测定方法得到的黄芪颗粒特征指纹图谱。
10.根据权利要求9所述的黄芪颗粒特征指纹图谱，其特征在于：所述图谱中的共有峰为23个。
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