CN1844913A - 一种黄芪皂苷注射液指纹图谱的质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种黄芪皂苷注射液的指纹图谱质量检测方法。该方法用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈一水为流动相，进行梯度洗脱；流速0.5～1.0ml/min；柱温20～40℃；取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解，作为参照品溶液；取黄芪皂苷注射液浓缩，以水饱和的正丁醇为提取溶剂，以正丁醇饱和的水除杂，待水饱和的正丁醇提取物挥干后，在残留物中加入甲醇溶解，取甲醇溶解作为黄芪皂苷注射液指纹图谱检测供试液。供试液指纹图谱检测，用高效液相色谱对黄芪皂苷注射液指纹图谱检测供试液进行检测，供试品指纹图谱应与对照指纹图谱有良好的相似性，相似度＞0.90。本发明还提供了注射用黄芪皂苷指纹图谱的质量检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种注射液的质量检测方法，特别涉及黄芪皂苷注射液的指纹图谱质量检测方法。
背景技术
中药指纹图谱是指一种中药材或中成药所共有的，具有特征性的一类成分的色谱或光谱的图谱。指纹图谱技术是评价中药质量的关键手段，有利于中药现代化。日本、美国、德国、法国等国先后已开始使用指纹图谱对天然药物进行质量控制，能有效的控制药物的质量，保证药物的安全有效，目前已为国际所共识。今天，我国的一些制药企业在国家的倡导下，已对一些中药产品进行了指纹图谱研究，特别是对中药注射剂的研究。然而，现在的研究并未涉及黄芪皂苷注射剂指纹图谱，相关研究也较少。
发明内容
本发明目的在于提供一种黄芪皂苷注射液的质量检测方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的。
本发明黄芪皂苷注射液指纹图谱的质量检测方法，该方法包括如下步骤：
色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈—水的比例为0.1～0.5∶1作为流动相，进行梯度洗脱：0至20分钟，乙腈浓度为10～30％，继后15分钟，乙腈浓度从10～30％至30～40％，30～40％乙腈浓度维持至60分钟；流速0.5～1.0ml/min；柱温20～40℃；检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度95～125℃，气体流速2.5～3.2SLPM；参照品溶液的制备，精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含0.5mg的溶液，作为参照品溶液；供试品溶液的制备，精密吸取黄芪皂苷注射液100ml，水浴浓缩至约25ml，定量转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取2～6次，每次10～50ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水洗涤1～4次，每次5～30ml，弃去水层，正丁醇提取液在水浴上蒸干，残渣再用甲醇溶解并定容至5ml量瓶中，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为黄芪皂苷注射液指纹图谱检测供试液；供试液指纹图谱检测，用高效液相色谱对黄芪皂苷注射液指纹图谱检测供试液进行检测，进样量为5～50μl，记录60分钟的色谱图，得黄芪皂苷注射液的指纹图谱；供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似度应大于0.90；黄芪皂苷注射液指纹图谱共有6个共有指纹峰，参照峰S为黄芪甲苷色谱峰，6个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.800±0.080，2号峰0.850±0.085，3号峰0.873±0.087，4号峰0.908±0.091，S峰1.000±0.000，5号峰1.031±0.010。
本发明黄芪皂苷注射液的指纹图谱质量检测方法，优选如下检测方法：
色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈—水的比例为0.22∶1作为流动相，进行梯度洗脱：0至20分钟，乙腈浓度为22％，继后15分钟，乙腈浓度从22％至33％，33％乙腈浓度维持至60分钟；流速0.8ml/min；柱温30℃；检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度110℃，气体流速2.90SLPM；参照品溶液的制备，精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含0.5mg的溶液，作为参照品溶液；供试品溶液的制备，精密吸取黄芪皂苷注射液100ml，水浴浓缩至约25ml，定量转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次15ml，弃去水层，正丁醇提取液在水浴上蒸干，残渣再用甲醇溶解并定容至5ml量瓶中，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取继滤液作为黄芪皂苷注射液指纹图谱检测供试液；供试液指纹图谱检测，用高效液相色谱对黄芪皂苷注射液指纹图谱检测供试液进行检测，进样量为20μl，记录60分钟的色谱图，得黄芪皂苷注射液的指纹图谱；供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似度应大于0.90；黄芪皂苷注射液指纹图谱共有6个共有指纹峰，参照峰S为黄芪甲苷色谱峰，6个共有指纹峰的优选相对保留时间分别为：1号峰0.800，2号峰0.850，3号峰0.873，4号峰0.908，S峰1.000，5号峰1.031；1号峰0.730，2号峰0.934，3号峰0.787，4号峰0.998，S峰1.000，5号峰1.022或1号峰0.879，2号峰0.766，3号峰0.959，4号峰0.818，S峰1.000，5号峰1.040。
注射用黄芪皂苷指纹图谱的质量检测方法，该方法包括如下步骤：
色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈—水的比例为0.1～0.5∶1作为流动相，进行梯度洗脱：0至20分钟，乙腈浓度为10～30％，继后15分钟，乙腈浓度从10～30％至30～40％，30～40％乙腈浓度维持至60分钟；流速0.5～1.0ml/min；柱温20～40℃；检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度95～125℃，气体流速2.5～3.2SLPM；参照品溶液的制备，精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含0.5mg的溶液，作为参照品溶液；供试品溶液的制备，精密称取注射用黄芪皂苷0.2g，加水25ml使溶解，定量转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取2～6次，每次10～50ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水洗涤1～4次，每次5～30ml，弃去水层，正丁醇提取液在水浴上蒸干，残渣再用甲醇溶解并定容至5ml量瓶中，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为注射用黄芪皂苷指纹图谱检测供试液；供试液指纹图谱检测，用高效液相色谱对注射用黄芪皂苷指纹图谱检测供试液进行检测，进样量为5～50μl，记录60分钟的色谱图，得注射用黄芪皂苷的指纹图谱；注射用黄芪皂苷供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似度应大于0.90；注射用黄芪皂苷指纹图谱共有6个共有指纹峰，参照峰S为黄芪甲苷色谱峰，6个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.807±0.081，2号峰0.857±0.086，3号峰0.883±0.088，4号峰0.925±0.092，S峰1.000±0.000，5号峰1.023±0.010。
注射用黄芪皂苷指纹图谱的质量检测方法，优选如下检测方法：
色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈—水的比例为0.2∶1作为流动相，进行梯度洗脱：0至20分钟，乙腈浓度为20％，继后15分钟，乙腈浓度从20％至35％，35％乙腈浓度维持至60分钟；流速0.9ml/min；柱温25℃；检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度105℃，气体流速2.80SLPM；参照品溶液的制备，精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含0.5mg的溶液，作为参照品溶液；供试品溶液的制备，精密称取注射用黄芪皂苷0.2g，加水25ml使溶解，定量转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次15ml，弃去水层，正丁醇提取液在水浴上蒸干，残渣再用甲醇溶解并定容至5ml量瓶中，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为注射用黄芪皂苷指纹图谱检测供试液；供试液指纹图谱检测，用高效液相色谱对注射用黄芪皂苷指纹图谱检测供试液进行检测，进样量为20μl，记录60分钟的色谱图，得注射用黄芪皂苷的指纹图谱；供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似度应大于0.90；注射用黄芪皂苷指纹图谱共有6个共有指纹峰，参照峰S为黄芪甲苷色谱峰，6个共有指纹峰的优选相对保留时间分别为：1号峰0.807，2号峰0.857，3号峰0.883，4号峰0.925，S峰1.000，5号峰1.023；1号峰0.887，2号峰0.772，3号峰0.970，4号峰0.834，S峰1.000，5号峰1.033或1号峰0.727，2号峰0.942，3号峰0.796，4号峰1.026，S峰1.000，5号峰1.014。
本发明使用指纹图谱技术有效的控制了黄芪皂苷注射液、注射用黄芪皂苷的质量采用本发明指纹图谱质量检测方法对黄芪皂苷注射液及其注射用黄芪皂苷进行质量控制后，共有峰相对保留时间的相对标准偏差小于1％，一致性好；非共有峰总面积占总峰面积的比例均小于5％，而且本发明指纹图谱测定方法操作起来具有简便、重现性好等优点；本发明提供的指纹图谱技术，可作为评价中药质量的关键手段，有利于中药现代化。
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1 黄芪皂苷注射液指纹图谱共有峰的确定
1、指纹图谱
根据3批供试品HPLC图谱所给出的相关参数，黄芪皂苷注射液按前述制备方法进行测定所得的主要色谱峰均在60分钟内出现；2小时的供试品溶液色谱图表明60分钟以后未出现色谱峰。比较各批样品的色谱峰发现其中6个峰是各批共有的，由此建立标准指纹图谱。
2、共有指纹峰的标定
根据3批供试品指纹图谱有关数据的计算结果，各共有峰平均相对保留时间(峰号)依次为0.800(1)、0.850(2)、0.873(3)、0.908(4)、1.000(S)、1.031(5)，以此作为共有指纹峰标定的依据，允许相对偏差为±10％。
3、共有指纹峰相对保留时间
3批供试品指纹图谱中共有指纹峰相对保留时间表1。
表1黄芪皂苷注射液共有指纹峰相对保留时间(n＝3)
| 共有峰峰号 | 1 | 2 | 3 | 平均 | RSD(％) |
| 1 | 0.800 | 0.801 | 0.798 | 0.800 | 0.18 |
| 2 | 0.851 | 0.852 | 0.849 | 0.850 | 0.18 |
| 3 | 0.874 | 0.874 | 0.872 | 0.873 | 0.13 |
| 4 | 0.908 | 0.908 | 0.907 | 0.908 | 0.10 |
| S | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000. | 0.00 |
| 5 | 1.030 | 1.031 | 1.031 | 1.031 | 0.03 |
由以上结果可以看出，共有峰相对保留时间的相对标准偏差小于1％，一致性非常好。
4、非共有峰面积
除不经柱保留的峰，计算了3批样品的非共有峰总面积占总峰面积的比例，结果见表2。
表2黄芪皂苷注射液样品的非共有峰总面积占总峰面积的百分比(n＝3)
| 样品编号 | 1 | 2 | 3 | 平均 |
| 所占比例％ | 0.46 | 0.82 | 0.84 | 0.71 |
各批注射液样品非共有峰总面积占总峰面积的比例均小于5％，均符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》的规定。
5、黄芪皂苷注射液指纹图谱相似性评价
取黄芪皂苷注射液三批，按上述方法进行检测，得出三批样品的指纹图谱，采用中国药典委员会推荐的计算机辅助相似度评价软件(中南大学中药现代化研究中心编制)计算，相似度见表3。
表3
| 批号 | 1 | 2 | 3 |
| 相似度 | 0.998 | 0.997 | 0.996 |
实验例2 注射用黄芪皂苷指纹图谱共有峰的确
1、指纹图谱
根据3批供试品HPLC图谱所给出的相关参数，注射用黄芪皂苷按前述制备方法进行测定所得的主要色谱峰均在60分钟内出现；2小时的供试品溶液色谱图表明60分钟以后未出现色谱峰。比较各批样品的色谱峰发现其中6个峰是各批共有的，由此建立标准指纹图谱。
2、共有指纹峰的标定
根据3批供试品指纹图谱有关数据的计算结果，各共有峰平均相对保留时间(峰号)依次为0.807(1)、0.857(2)、0.883(3)、0.925(4)、1.000(S)、1.023(5)，以此作为共有指纹峰标定的依据，允许相对偏差为±10％。
3、共有指纹峰相对保留时间
3批供试品指纹图谱中共有指纹峰相对保留时间表4。
表4 注射用黄芪皂苷共有指纹峰相对保留时间(n＝3)
| 共有峰峰号 | 031201 | 031202 | 031203 | 平均 | RSD(％) |
| 1 | 0.807 | 0.807 | 0.807 | 0.807 | 0.01 |
| 2 | 0.857 | 0.857 | 0.857 | 0.857 | 0.03 |
| 3 | 0.883 | 0.883 | 0.883 | 0.883 | 0.02 |
| 4 | 0.925 | 0.925 | 0.926 | 0.925 | 0.01 |
| S | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.00 |
| 5 | 1.023 | 1.022 | 1.023 | 1.023 | 0.02 |
由以上结果可以看出，共有峰相对保留时间的相对标准偏差小于1％，一致性非常好。
4、非共有峰面积
除不经柱保留的峰，计算了3批样品的非共有峰总面积占总峰面积的比例，结果见表5。
表5注射用黄芪皂苷样品的非共有峰总面积占总峰面积的百分比(n＝3)
| 样品编号 | 031201 | 031202 | 031203 | 平均 |
| 所占比例％ | 3.91 | 3.60 | 3.67 | 3.73 |
各批样品非共有峰总面积占总峰面积的比例均小于5％，均符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》的规定。
5、注射用黄芪皂苷指纹图谱相似性评价
取注射用黄芪皂苷三批，按上述方法进行检测，得出三批样品的指纹图谱，采用中国药典委员会推荐的计算机辅助相似度评价软件计算，相似度见表6。
表6
| 批号 | 031201 | 031202 | 031203 |
| 相似度 | 0.994 | 0.999 | 0.996 |
实验例3 黄芪皂苷注射液供试品溶液稳定性试验
取本发明黄芪皂苷注射液供试品溶液为测定对象，分别在0小时、2小时、6小时、12小时、24小时依照前述色谱条件测定(4℃保存)，记录各共有色谱峰保留时间和峰面积。以参照物黄芪甲苷的保留时间为参照，计算出各共有峰的相对保留时间，结果见表7～8。
表7 稳定性试验相对保留时间
| 共有峰编号 | 0小时 | 2小时 | 6小时 | 12小时 | 24小时 | 平均 | RSD(％) |
| 1 | 0.809 | 0.808 | 0.807 | 0.808 | 0.797 | 0.806 | 0.62 |
| 2 | 0.860 | 0.859 | 0.861 | 0.863 | 0.857 | 0.860 | 0.26 |
| 3 | 0.888 | 0.888 | 0.889 | 0.892 | 0.889 | 0.889 | 0.18 |
| 4 | 0.931 | 0.931 | 0.933 | 0.936 | 0.937 | 0.934 | 0.30 |
| S | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0 |
| 5 | 1.022 | 1.022 | 1.021 | 1.020 | 1.018 | 1.021 | 0.16 |
表8 稳定性试验参照峰占总峰面积百分比
| 实验时间 | 0小时 | 2小时 | 6小时 | 12小时 | 24小时 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积％ | 91.4 | 91.1 | 90.9 | 90.7 | 91.0 | 91.0 | 0.25 |
实验结果显示：各共有峰相对保留时间的相对标准偏差均小于1％，十分稳定；参照峰的峰面积百分比的相对标准偏差为0.25％，结果表明供试品溶液在24小时内基本保持稳定。
实验例4 黄芪皂苷注射液重现性试验
取本发明黄芪皂苷注射液供试品6份，依照实验例3的方法制备测定，记录各共有色谱峰保留时间和积分峰面积。以参照物黄芪甲苷的保留时间为参照，计算出各共有峰的相对保留时间，统计结果见表9～10。
表9 重现性试验相对保留时间(n＝6)
| 共有峰编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 1 | 0.808 | 0.808 | 0.808 | 0.808 | 0.808 | 0.808 | 0.808 | 0 |
| 2 | 0.858 | 0.858 | 0.858 | 0.858 | 0.858 | 0.858 | 0.858 | 0 |
| 3 | 0.884 | 0.884 | 0.884 | 0.884 | 0.884 | 0.884 | 0.884 | 0 |
| 4 | 0.926 | 0.926 | 0.927 | 0.926 | 0.926 | 0.927 | 0.926 | 0.06 |
| S | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0 |
| 5 | 1.023 | 1.023 | 1.023 | 1.023 | 1.023 | 1.023 | 1.023 | 0 |
表10 重现性试验参照峰占总峰面积百分比
| 实验次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积％ | 90.0 | 90.3 | 89.9 | 90.5 | 90.5 | 90.3 | 90.2 | 0.28 |
实验结果显示：各共有峰相对保留时间相对标准偏差均小于1％；参照峰的峰面积百分比的相对标准偏差为0.28％，结果显示方法的重现性良好。
实验例5 注射用黄芪皂苷供试品溶液稳定性试验
取本发明注射用黄芪皂苷供试品溶液为测定对象，分别在0小时、2小时、6小时、12小时、24小时依照前述色谱条件测定(4℃保存)，记录各共有色谱峰保留时间和峰面积。以参照物黄芪甲苷的保留时间为参照，计算出各共有峰的相对保留时间，结果见表11～12。
表11 稳定性试验相对保留时间
| 共有峰编号 | 0小时 | 2小时 | 6小时 | 12小时 | 24小时 | 平均 | RSD(％) |
| 1 | 0.806 | 0.805 | 0.804 | 0.805 | 0.794 | 0.803 | 0.61 |
| 2 | 0.861 | 0.860 | 0.862 | 0.864 | 0.858 | 0.861 | 0.26 |
| 3 | 0.886 | 0.886 | 0.887 | 0.890 | 0.887 | 0.887 | 0.17 |
| 4 | 0.932 | 0.932 | 0.934 | 0.937 | 0.938 | 0.935 | 0.30 |
| S | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0 |
| 5 | 1.023 | 1.023 | 1.022 | 1.021 | 1.019 | 1.022 | 0.17 |
表12 稳定性试验参照峰占总峰面积百分比
| 实验时间 | 0小时 | 2小时 | 6小时 | 12小时 | 24小时 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积％ | 91.6 | 91.3 | 91.1 | 90.9 | 91.2 | 91.2 | 0.26 |
实验结果显示：各共有峰相对保留时间的相对标准偏差均小于1％，十分稳定；参照峰的峰面积百分比的相对标准偏差为0.26％；结果表明供试品溶液在24小时内基本保持稳定。
实验例6 注射用黄芪皂苷重现性试验
取本发明注射用黄芪皂苷供试品6份，依照实验例5的方法制备测定，记录各共有色谱峰保留时间和积分峰面积。以参照物黄芪甲苷的保留时间为参照，计算出各共有峰的相对保留时间，统计结果见表13～14。
表13 重现性试验相对保留时间(n＝6)
| 共有峰编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 1 | 0.806 | 0.806 | 0.806 | 0.806 | 0.806 | 0.806 | 0.806 | 0 |
| 2 | 0.857 | 0.857 | 0.857 | 0.857 | 0.857 | 0.857 | 0.857 | 0 |
| 3 | 0.885 | 0.885 | 0.885 | 0.885 | 0.885 | 0.885 | 0.885 | 0 |
| 4 | 0.927 | 0.927 | 0.928 | 0.927 | 0.927 | 0.928 | 0.927 | 0.07 |
| S | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0 |
| 5 | 1.024 | 1.024 | 1.024 | 1.024 | 1.024 | 1.024 | 1.024 | 0 |
表14 重现性试验参照峰占总峰面积百分比
| 实验次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积％ | 91.0 | 91.3 | 90.9 | 91.5 | 91.5 | 91.3 | 91.2 | 0.29 |
实验结果显示：各共有峰相对保留时间相对标准偏差均小于1％；参照峰的峰面积百分比的相对标准偏差为0.29％；结果显示方法的重现性良好。
附图说明：
图1为黄芪皂苷注射液标准指纹图谱；
图2为注射用黄芪皂苷标准指纹图谱。
下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。
实施例1：黄芪皂苷注射液质量检测方法
采用指纹图谱质量检测方法：
色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈—水为流动相，进行梯度洗脱：0至20分钟，乙腈浓度为22％，继后15分钟，乙腈浓度从22％至33％，33％乙腈浓度维持至60分钟；流速0.8ml/min；柱温30℃；检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度110℃，气体流速2.90SLPM。
参照品溶液的制备，精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含0.5mg的溶液，即得；供试品溶液的制备，精密吸取黄芪皂苷注射液100ml，水浴浓缩至约25ml，定量转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次15ml，弃去水层，正丁醇提取液在水浴上蒸干，残渣再用甲醇溶解并定容至5ml量瓶中，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
测定法，分别精密吸取参照物溶液10μl和供试品溶液15μl，注入液相色谱仪，记录60分钟的色谱图。
实施例2：黄芪皂苷注射液质量检测方法
采用指纹图谱质量检测方法：
色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈—水(0.22∶1)为流动相，进行梯度洗脱：0至20分钟，乙腈浓度为22％，继后15分钟，乙腈浓度从22％至33％，33％乙腈浓度维持至60分钟；流速0.6ml/min；柱温35℃；检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度100℃，气体流速3.00SLPM；参照品溶液的制备，精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含0.5mg的溶液，作为参照品溶液；供试品溶液的制备，精密吸取黄芪皂苷注射液100ml，水浴浓缩至约25ml，定量转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取5次，每次45ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次25ml，弃去水层，正丁醇提取液在水浴上蒸干，残渣再用甲醇溶解并定容至5ml量瓶中，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为黄芪皂苷注射液指纹图谱检测供试液；供试液指纹图谱检测，用高效液相色谱对黄芪皂苷注射液指纹图谱检测供试液进行检测，进样量为10μl，记录60分钟的色谱图，得黄芪皂苷注射液的指纹图谱；供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似度应大于0.90；黄芪皂苷注射液指纹图谱共有6个共有指纹峰，参照峰S为黄芪甲苷色谱峰，6个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.800，2号峰0.850，3号峰0.873，4号峰0.908，S峰1.000，5号峰1.031。
实施例3：黄芪皂苷注射液质量检测方法
采用指纹图谱质量检测方法：
色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈—水(0.22∶1)为流动相，进行梯度洗脱：0至20分钟，乙腈浓度为22％，继后15分钟，乙腈浓度从22％至33％，33％乙腈浓度维持至60分钟；流速0.8ml/min；柱温30℃；检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度110℃，气体流速2.90SLPM；参照品溶液的制备，精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含0.5mg的溶液，作为参照品溶液；供试品溶液的制备，精密吸取黄芪皂苷注射液100ml，水浴浓缩至约25ml，定量转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次15ml，弃去水层，正丁醇提取液在水浴上蒸干，残渣再用甲醇溶解并定容至5ml量瓶中，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取继滤液作为黄芪皂苷注射液指纹图谱检测供试液；供试液指纹图谱检测，用高效液相色谱对黄芪皂苷注射液指纹图谱检测供试液进行检测，进样量为20μl，记录60分钟的色谱图，得黄芪皂苷注射液的指纹图谱；供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似度应大于0.90；黄芪皂苷注射液指纹图谱共有6个共有指纹峰，参照峰S为黄芪甲苷色谱峰，6个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.730，2号峰0.934，3号峰0.787，4号峰0.998，S峰1.000，5号峰1.022。
实施例4：黄芪皂苷注射液质量检测方法
采用指纹图谱质量检测方法：
色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈—水(0.15∶1)为流动相，进行梯度洗脱：0至20分钟，乙腈浓度为15％，继后15分钟，乙腈浓度从15％至38％，38％乙腈浓度维持至60分钟；流速0.9ml/min；柱温25℃；检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度120℃，气体流速2.6SLPM；参照品溶液的制备，精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含0.5mg的溶液，作为参照品溶液；供试品溶液的制备，精密吸取黄芪皂苷注射液100ml，水浴浓缩至约25ml，定量转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水洗涤4次，每次8ml，弃去水层，正丁醇提取液在水浴上蒸干，残渣再用甲醇溶解并定容至5ml量瓶中，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为黄芪皂苷注射液指纹图谱检测供试液；供试液指纹图谱检测，用高效液相色谱对黄芪皂苷注射液指纹图谱检测供试液进行检测，进样量为45μl，记录60分钟的色谱图，得黄芪皂苷注射液的指纹图谱；供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似度应大于0.90；黄芪皂苷注射液指纹图谱共有6个共有指纹峰，参照峰S为黄芪甲苷色谱峰，6个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.879，2号峰0.766，3号峰0.959，4号峰0.818，S峰1.000，5号峰1.040。
实施例5：注射用黄芪皂苷质量检测方法
采用指纹图谱质量检测方法：
色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈—水为流动相，进行梯度洗脱：0至20分钟，乙腈浓度为20％，继后15分钟，乙腈浓度从20％至35％，35％乙腈浓度维持至60分钟；流速0.9ml/min；柱温25℃；检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度105℃，气体流速2.80SLPM；参照品溶液的制备，精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含0.5mg的溶液，作为参照品溶液；供试品溶液的制备，精密称取注射用黄芪皂苷0.2g，加水25ml使溶解，定量转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取3次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次20ml，弃去水层，正丁醇提取液在水浴上蒸干，残渣再用甲醇溶解并定容至5ml量瓶中，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液即得；测定法，分别精密吸取参照物溶液20μl和供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，记录60分钟的色谱图。
实施例6：注射用黄芪皂苷质量检测方法
采用指纹图谱质量检测方法：
色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈—水为流动相，进行梯度洗脱：0至20分钟，乙腈浓度为20％，继后15分钟，乙腈浓度从20％至35％，35％乙腈浓度维持至60分钟；流速0.7ml/min；柱温28℃；检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度120℃，气体流速3.10SLPM；参照品溶液的制备，精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含0.5mg的溶液，作为参照品溶液；供试品溶液的制备，精密称取注射用黄芪皂苷0.2g，加水25ml使溶解，定量转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取5次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水洗涤4次，每次10ml，弃去水层，正丁醇提取液在水浴上蒸干，残渣再用甲醇溶解并定容至5ml量瓶中，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液即得；供试液指纹图谱检测，用高效液相色谱对注射用黄芪皂苷指纹图谱检测供试液进行检测，进样量为10μl，记录60分钟的色谱图，得注射用黄芪皂苷的指纹图谱；供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似度应大于0.90；注射用黄芪皂苷指纹图谱共有6个共有指纹峰，参照峰S为黄芪甲苷色谱峰，6个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.727，2号峰0.942，3号峰0.796，4号峰1.026，S峰1.000，5号峰1.014。
实施例7：注射用黄芪皂苷质量检测方法
色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈—水(0.2∶1)为流动相，进行梯度洗脱：0至20分钟，乙腈浓度为20％，继后15分钟，乙腈浓度从20％至35％，35％乙腈浓度维持至60分钟；流速0.9ml/min；柱温25℃；检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度105℃，气体流速2.80SLPM；参照品溶液的制备，精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含0.5mg的溶液，作为参照品溶液；供试品溶液的制备，精密称取注射用黄芪皂苷0.2g，加水25ml使溶解，定量转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次15ml，弃去水层，正丁醇提取液在水浴上蒸干，残渣再用甲醇溶解并定容至5ml量瓶中，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为注射用黄芪皂苷指纹图谱检测供试液；供试液指纹图谱检测，用高效液相色谱对注射用黄芪皂苷指纹图谱检测供试液进行检测，进样量为20μl，记录60分钟的色谱图，得注射用黄芪皂苷的指纹图谱；供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似度应大于0.90；注射用黄芪皂苷指纹图谱共有6个共有指纹峰，参照峰S为黄芪甲苷色谱峰，6个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.807，2号峰0.857，3号峰0.883，4号峰0.925，S峰1.000，5号峰1.023。
实施例8：注射用黄芪皂苷质量检测方法
色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈—水(0.12∶1)为流动相，进行梯度洗脱：0至20分钟，乙腈浓度为12％，继后15分钟，乙腈浓度从12％至32％，32％乙腈浓度维持至60分钟；流速0.6ml/min；柱温38℃；检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度110℃，气体流速2.6SLPM；参照品溶液的制备，精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含0.5mg的溶液，作为参照品溶液；供试品溶液的制备，精密称取注射用黄芪皂苷0.2g，加水25ml使溶解，定量转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取6次，每次45ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次25ml，弃去水层，正丁醇提取液在水浴上蒸干，残渣再用甲醇溶解并定容至5ml量瓶中，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为注射用黄芪皂苷指纹图谱检测供试液；供试液指纹图谱检测，用高效液相色谱对注射用黄芪皂苷指纹图谱检测供试液进行检测，进样量为40μl，记录60分钟的色谱图，得注射用黄芪皂苷的指纹图谱；注射用黄芪皂苷供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似度应大于0.90；注射用黄芪皂苷指纹图谱共有6个共有指纹峰，参照峰S为黄芪甲苷色谱峰，6个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.887，2号峰0.772，3号峰0.970，4号峰0.834，S峰1.000，5号峰1.033。
Claims (4)
1、一种黄芪皂苷注射液的指纹图谱质量检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水的比例为0.1～0.5∶1作为流动相，进行梯度洗脱：0至20分钟，乙腈浓度为10～30％，继后15分钟，乙腈浓度从10～30％至30～40％，30～40％乙腈浓度维持至60分钟；流速0.5～1.0ml/min；柱温20～40℃；检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度95～125℃，气体流速2.5～3.2SLPM；参照品溶液的制备，精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含0.5mg的溶液，作为参照品溶液；供试品溶液的制备，精密吸取黄芪皂苷注射液100ml，水浴浓缩至约25ml，定量转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取2～6次，每次10～50ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水洗涤1～4次，每次5～30ml，弃去水层，正丁醇提取液在水浴上蒸干，残渣再用甲醇溶解并定容至5ml量瓶中，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为黄芪皂苷注射液指纹图谱检测供试液；供试液指纹图谱检测，用高效液相色谱对黄芪皂苷注射液指纹图谱检测供试液进行检测，进样量为5～50μl，记录60分钟的色谱图，得黄芪皂苷注射液的指纹图谱；供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似度应大于0.90；黄芪皂苷注射液指纹图谱共有6个共有指纹峰，参照峰S为黄芪甲苷色谱峰，6个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.800±0.080，2号峰0.850±0.085，3号峰0.873±0.087，4号峰0.908±0.091，S峰1.000±0.000，5号峰1.031±0.010。
2、如权利要求1所述的黄芪皂苷注射液的指纹图谱质量检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水的比例为0.22∶1作为流动相，进行梯度洗脱：0至20分钟，乙腈浓度为22％，继后15分钟，乙腈浓度从22％至33％，33％乙腈浓度维持至60分钟；流速0.8ml/min；柱温30℃；检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度110℃，气体流速2.90SLPM；参照品溶液的制备，精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含0.5mg的溶液，作为参照品溶液；供试品溶液的制备，精密吸取黄芪皂苷注射液100ml，水浴浓缩至约25ml，定量转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次15ml，弃去水层，正丁醇提取液在水浴上蒸干，残渣再用甲醇溶解并定容至5ml量瓶中，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取继滤液作为黄芪皂苷注射液指纹图谱检测供试液；供试液指纹图谱检测，用高效液相色谱对黄芪皂苷注射液指纹图谱检测供试液进行检测，进样量为20μl，记录60分钟的色谱图，得黄芪皂苷注射液的指纹图谱；供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似度应大于0.90；黄芪皂苷注射液指纹图谱共有6个共有指纹峰，参照峰S为黄芪甲苷色谱峰，6个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.800，2号峰0.850，3号峰0.873，4号峰0.908，S峰1.000，5号峰1.031。
3、注射用黄芪皂苷的指纹图谱质量检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水的比例为0.1～0.5∶1作为流动相，进行梯度洗脱：0至20分钟，乙腈浓度为10～30％，继后15分钟，乙腈浓度从10～30％至30～40％，30～40％乙腈浓度维持至60分钟；流速0.5～1.0ml/min；柱温20～40℃；检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度95～125℃，气体流速2.5～3.2SLPM；参照品溶液的制备，精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含0.5mg的溶液，作为参照品溶液；供试品溶液的制备，精密称取注射用黄芪皂苷0.2g，加水25ml使溶解，定量转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取2～6次，每次10～50ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水洗涤1～4次，每次5～30ml，弃去水层，正丁醇提取液在水浴上蒸干，残渣再用甲醇溶解并定容至5ml量瓶中，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为注射用黄芪皂苷指纹图谱检测供试液；供试液指纹图谱检测，用高效液相色谱对注射用黄芪皂苷指纹图谱检测供试液进行检测，进样量为5～50μl，记录60分钟的色谱图，得注射用黄芪皂苷的指纹图谱；注射用黄芪皂苷供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似度应大于0.90；注射用黄芪皂苷指纹图谱共有6个共有指纹峰，参照峰S为黄芪甲苷色谱峰，6个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.807±0.081，2号峰0.857±0.086，3号峰0.883±0.088，4号峰0.925±0.092，S峰1.000±0.000，5号峰1.023±0.010。
4、如权利要求3所述的注射用黄芪皂苷的指纹图谱质量检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水的比例为0.2∶1作为流动相，进行梯度洗脱：0至20分钟，乙腈浓度为20％，继后15分钟，乙腈浓度从20％至35％，35％乙腈浓度维持至60分钟；流速0.9ml/min；柱温25℃；检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度105℃，气体流速2.80SLPM；参照品溶液的制备，精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含0.5mg的溶液，作为参照品溶液；供试品溶液的制备，精密称取注射用黄芪皂苷0.2g，加水25ml使溶解，定量转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次15ml，弃去水层，正丁醇提取液在水浴上蒸干，残渣再用甲醇溶解并定容至5ml量瓶中，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为注射用黄芪皂苷指纹图谱检测供试液；供试液指纹图谱检测，用高效液相色谱对注射用黄芪皂苷指纹图谱检测供试液进行检测，进样量为20μl，记录60分钟的色谱图，得注射用黄芪皂苷的指纹图谱；供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似度应大于0.90；注射用黄芪皂苷指纹图谱共有6个共有指纹峰，参照峰S为黄芪甲苷色谱峰，6个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.807，2号峰0.857，3号峰0.883，4号峰0.925，S峰1.000，5号峰1.023。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |