CN101551365B - 当归补血口服液中黄芪甲苷含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种当归补血口服液中黄芪甲苷的含量测定方法，它采用正丁醇提取--氨试液洗涤，用高效液相-蒸发光散射检测法测定含量，通过对测试时的几个重要参数进行确定，测试结果表明，此方法所得到的色谱图基线平稳，峰形良好，可达到基线分离。灵敏度、稳定性及重现性亦能符合含量测定的要求，且操作简便，是一种检测口服液中黄芪甲苷成分有效的分析方法。

Description

当归补血口服液中黄芪甲苷含量的测定方法

技术领域

本发明涉及中药制剂中有效成份的测定方法，尤其是涉及一种当归补血口服液中黄芪甲苷的测定方法。

背景技术

当归补血口服液是由郑州市协和制药厂生产的成方制剂，为国内首创的治疗性补气、补血四类新药，经国家中药保护委员会批准为国家中药保护品种，全国独家生产。该口服液补气养血，适用于气血两虚症。用于营养不良、脾胃虚弱引起的贫血症及妇科疾病引起的贫血症；同时还具有美容驻颜之功效。由于当归补血口服液为液体制剂，药物吸收快，作用迅速，服用方便。

当归补血口服液中黄芪为主药，且用量最大，起主要作用，黄芪是传统中药，为补气药，性甘温，归肺脾经，具有补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌之功效。现代研究表明黄芪含有多种化学成分，如皂苷类，黄酮类，木脂素类，氨基酸类，多糖类及多种微量元素等。其所含的三萜皂苷类化合物-黄芪甲苷，是黄芪的主要的有效成分，也是当归补血口服液的主要有效成分。因此，作为当归补血口服液的质量标准评价手段，，黄芪甲苷含量测定的准确与是保证产品疗效的技术关键。

常规测定制剂中黄芪甲苷含量的方法主要有两种方法：高效液相色谱-紫外检测法和薄层色谱扫描法。高效液相-紫外检测法测定黄芪甲苷含量，系统平衡慢(1-2小时)，基线不稳定，再加上黄芪甲苷无共轭体系，仅在200nm左右有弱的紫外末端吸收，则色谱峰的响应值较底；又紫外末端吸收易受影响，尤其是受溶剂吸收的干扰大，噪音对结果的影响也较大，噪音大时，检测限也较大，那么低于此检测限的组分峰将被噪音所淹没，而监测不出来。由此可知，当样品中黄芪甲苷含量较低时，此法很难准确测定。为此，对黄芪甲苷的含量测定一般采用薄层色谱扫描法。但薄层色谱扫描法操作较繁琐，且受影响因素较多，如薄层层析时，展开温度，展开系统的饱和性，所用硅胶板颗粒的大小，硅胶板的紧密性等都会影响黄芪甲苷的含量测定，虽然用了共薄层的方法消除了部分误差，但各次实验间的重现性较差；为了排除其它成分的干扰和背景的干扰，须经过多步分离纯化，而且在纯化过程中黄芪甲苷的损失也较多。

近年来，有用蒸发光散射检测器测定黄芪甲苷含量的报道，蒸发光散射检测器是一种通用的质量型监测器，能检测到半挥发或不挥发性分子中无紫外吸收的化合物；所得到的色谱图基线平稳，峰形良好，可达到基线分离；灵敏度、稳定性及重现性亦能符合含量测定的要求，且操作简便，是一种检测黄芪甲苷成分的新型有效的分析方法。与高效液相-紫外检测法相比，高效液相-蒸发光散射检法主要用于测定无紫外吸收的化合物，因其在测定有紫外吸收的组分时，灵敏度比紫外检测器要低。

当归补血口服液原质量标准采用薄层色谱扫描法，实验过程中发现，薄层色谱扫描法受外部环境干扰较大，实验结果重现形较差，且分离纯化复杂。由于当归补血口服液的中黄芪甲苷已存在于液体样品，对其进行测定不同于生药及其制剂，按常规方法直接改用高效液相-蒸发光散射检测法，样品经过正丁醇提取-氨试液洗涤，进样，结果表明色谱杂质峰较多，峰形不对称，分离的重现性较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用高效液相-蒸发光散射检测器准确检测当归补血口服液中黄芪甲苷含量的测定方法。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的当归补血口服液中黄芪甲苷含量的测定方法，其具体步骤为：

(一)确定色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水36∶64为流动相；柱温：室温；流速：1.0mL/min。蒸发光散射检测器条件：漂移管温度：35℃～45℃，载气流速2.7L/min，载气压力3.1Bar；

(二)对照品溶液的制备：称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml溶液中含黄芪甲苷0。4mg的溶液备用；

(三)供试品溶液的制备：量取待测品10ml，置分液漏斗中，加水饱和正丁醇提取4次，每次振摇200～250次，正丁醇用量每次20ml，合并四次正丁醇提取液；用氨试液将上述所得的正丁醇提取液洗涤两次，每次取氨试液20ml，第一次氨试液洗涤待完全分层后，弃去氨液；第二次氨试液洗涤时需静置2～4小时，再弃去氨液；取所得正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液；

(四)分别吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，蒸发光散射检测器测定，即得测定结果。

由于振摇次数低于200次(如150次)时，提取的黄芪甲苷含量要底，而高于200次(如250次以上)，提取的黄芪甲苷含量变化不大，故在第三步供试品溶液的制备中，正定醇提取时每次振摇200次为最佳；第二次氨试液洗涤时需静置2小时，由于静置时间过短，黄芪甲苷的含量偏低，如果过长(如再2小时以上)，黄芪甲苷的含量也无大的变化。

表1正定醇提取时不同振摇次数对黄芪甲苷含量的影响

表2氨试液洗涤静置不同时间对黄芪甲苷含量的影响

本发明的优点在于用高效液相-蒸发光散射检测法对当归补血口服液中的黄芪甲苷进行含量测定时，根据当归补血口服液的特殊性，确定了测试时的几个重要技术参数：

1、将溶液确定为水饱和的正丁醇，由于黄芪甲苷已存在于液体中，易溶于正丁醇，又黄芪甲苷为三萜皂苷类，可用水饱和的正丁醇直接振摇提取，借以与亲水性的糖，蛋白质等分离。水饱和的正丁醇直接振摇提取，利用的是被提取成分在两相溶剂中分配系数不同而实现提取与分离的。

2、对于正丁醇提取液，文献报道有用1％氢氧化钠，2％氢氧化钾，氨试液等洗涤的，它们都为碱性成分，目的主要为了除去酸性杂质。这是因为黄芪除含有皂苷类成分外，尚含有较多的氨基酸、多糖、黄酮、酚性化合物等酸性成分，以及多种微量元素。在当归补血口服液中，因只有当归、黄芪两味药

组成，成份较简单，且加入的辅料也为酸性成分，经正丁醇提取-氨试液洗涤后，完全可以达到含量测定的要求。

3、对于蒸发光散射检测器，漂移管温度和载气流速是检测器的两个重要参数，温度低时，溶剂挥发不够完全，基线噪音增大；温度高时，由于被测样品部分挥发导致检测器响应下降；载气流速太低时，会形成大量的微滴，从而导致尖峰信号或噪音信号；另一方面当载气流速太高时微滴会大量下降，导致信号响应降低。基于当归补血口服液的特殊性，将漂移管温度确定为35℃～45℃，即为获得低噪音时的最低温度；选取载气流速2.7/min，载气压力3.1Bar；

采用本发明所述的测定方法对当归补血口服液中黄芪甲苷进行测定，其线性范围、重复性、重现性、稳定性、准确度等考察指标如下：

1、线性关系考察

线性关系是考察被测样品浓度的变化与试样结果成正比关系的程度，常用绘制标准曲线来确定。可取黄芪甲苷对照品溶液，通过进样不同体积来绘制标准曲线。分别进样1ul、5ul、10ul、15ul、20ul，以对照品峰面积的常用对数值(Y)，进样量(ug)的常用对数值(X)为横坐标进行线性回归，得回归方程Y＝0.9119X+5.7605(r＝0.9998)。结果表明，黄芪甲苷进样量在0.413～8.16ug范围内的对数值与峰面积对数值成良好线性。

2、重复性试验

精密吸取供试品溶液10ul，重复进样5次，依法测得黄芪甲苷峰面积，计算RSD％＝0.56％。

重复性试验结果

3、重现性试验

精密吸取供试品溶液10ul，重复进样5次，依法测得黄芪甲苷峰面积，计算RSD％＝1.98％。

重现性试验结果

4、稳定性试验

放置不同的时间，精密吸取供试品溶液10ul，进样，依法测得黄芪甲苷峰面积，计算RSD％＝1.76％，表明样品溶液在12小时内稳定。

稳定性试验结果

5、耐用性试验考察

蒸发光散射检测器测定含量时，漂移管的温度是一主要参数，为此，比较不同温度，对同一份样品溶液进行测定。结果见表4，表明在确定的温度范围内变化，都可以满足试验的要求。

耐用性试验结果

通过上述方法学考察，确定本发明采用的当归补血口服液含量测定方法满足于分析要求。

具体实施方式

本反明所述的当归补血口服液中黄芪甲苷含量的测定方法，其具体步骤为：

(一)确定色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水36∶64为流动相；柱温：室温；流速：1.0mL/min。蒸发光散射检测器条件：漂移管温度：35℃～45℃，载气流速2.7L/min，载气压力3.1Bar；

(二)对照品溶液的制备：称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml溶液中含黄芪甲苷0.4mg的溶液备用；

(三)供试品溶液的制备：量取待测品10ml，置分液漏斗中，加水饱和正丁醇提取4次，每次振摇200～250次，正丁醇用量每次20ml，合并四次正丁醇提取液；用氨试液将上述所得的正丁醇提取液洗涤两次，每次取氨试液20ml，第一次氨试液洗涤待完全分层后，弃去氨液；第二次氨试液洗涤时需静置2～4小时，再弃去氨液；取所得正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

(四)分别吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，蒸发光散射检测器测定，以外标两点法对数方程计算，即得测定结果。

为了进一步评价测定的结果与真实值接近的程度，表示上述方法的准确性，采用加样回收的方法对此进行评价。

例1.取当归补血口服液样品6份，每份10ml，每份各精密加入黄芪甲苷对照品溶液(浓度为0.413mg/ml)2ml，按前面已确定的方法制备，按选定色谱条件，因温度为一范围值，本次选取35℃为漂移管的温度，各取10ul进样测定，根据结果计算回收率。结果见下表。

加样回收率试验结果

例2.取当归补血口服液样品6份，每份10ml，每份各精密加入黄芪甲苷对照品溶液(浓度为0.413mg/ml)5ml，按前面已确定的方法制备，按选定色谱条件，因温度为一范围值，本次选取45℃为漂移管的温度，各取10ul进样测定，根据结果计算回收率。结果见下表。

加样回收率试验结果

从上述两个实例的测定结果表明，通过加入不同对照量的黄芪甲苷，均得到了良好的回收率，表明所确定的含量测定方法能够准确的测定当归补血口服液的含量。而且，通过对所确定的35℃～45℃这一范围之内的漂移管温度进一步考察，发现，只要选取35℃～45℃这一范围之内的温度，对结果不会产生大的影响。

Claims (2)

1.一种用高效液相-蒸发光散射检测器测定当归补血口服液中黄芪甲苷含量的方法，其具体步骤为：

(一)对照品溶液的制备：称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml溶液中含黄芪甲苷0.4mg的溶液备用；

(二)供试品溶液的制备：量取待测品10ml，置分液漏斗中，加水饱和正丁醇提取4次，每次振摇200～250次，正丁醇用量每次20ml，合并四次正丁醇提取液；用氨试液将上述所得的正丁醇提取液洗涤两次，每次取氨试液20ml，第一次氨试液洗涤待完全分层后，弃去氨液；第二次氨试液洗涤时需静置2～4小时，再弃去氨液；取所得正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液；

(三)分别吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，蒸发光散射检测器测定，以外标两点法对数方程计算，即得测定结果，其中高效液相色谱条件为：填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：乙腈-水36∶64；柱温：室温；流速：1.0mL/min；蒸发光散射检测器条件：漂移管温度：35℃～45℃，载气流速2.7L/min，载气压力3.1Bar。

2.根据权利要求1所述的测定当归补血口服液中黄芪甲苷含量的方法，其特征在于：所述第二步供试品溶液的制备中，正丁醇提取时每次振摇200次；第二次氨试液洗涤时需静置2小时。