CN102928520A

CN102928520A - 黄芪提取物中糖类成分的含量测定方法

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Publication number: CN102928520A
Application number: CN2011102272933A
Authority: CN
Inventors: 刘岩; 徐波; 牛涛; 陈红; 高阳
Original assignee: TIANJIN TASLY MODERN CHINESE MEDICINE RESOURCE CO Ltd
Current assignee: TIANJIN TASLY MODERN CHINESE MEDICINE RESOURCE CO Ltd
Priority date: 2011-08-10
Filing date: 2011-08-10
Publication date: 2013-02-13
Anticipated expiration: 2031-08-10
Also published as: CN102928520B

Abstract

本发明涉及一种中药提取物中有效成分的含量测定方法，特别涉及黄芪提取物中糖类成分的含量测定方法，该方法包括以下步骤：1)糖类成分对照品溶液的制备；2)对黄芪提取物进行溶解，上固相萃取小柱，水洗脱，收集洗脱液；3)采用高效液相色谱法进行样品测定。采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，以一定比例的有机溶剂和水为流动相，进行洗脱；4)以ELSD检测器进行检测；5)用外标两点法对数方程分别计算果糖和蔗糖的含量。本发明检测方法操作简单、快捷，专属性强、分离度高、准确度和精密度良好，适用于黄芪提取物的质量控制。

Description

黄芪提取物中糖类成分的含量测定方法

技术领域：

本发明涉及一种中药提取物中有效成分的含量测定方法，特别涉及黄芪提取物中糖类成分的含量测定方法，该提取物为芪参益气滴丸中间体之一。

背景技术：

中药材黄芪为豆科草本植物蒙古黄芪、膜荚黄芪的根，具有补气固表、利水退肿、托毒排脓、生肌等功效。黄芪的药用迄今已有2000多年的历史，现代研究，黄芪含皂甙、蔗糖、多糖、多种氨基酸、叶酸及硒、锌、铜等多种微量元素。有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用。

黄芪提取物(黄芪提取物)：黄芪提取物为黄芪经过乙醇提取得到的黄芪提取物，其在市场上有售，黄芪提取物可以作为如芪参益气滴丸的制剂的中间体。芪参益气滴丸是天士力集团研制的治疗心血管疾病的现代中药，是提取黄芪、丹参、三七、降香中的有效成分精制而成的滴丸制剂，适用于慢性心功能不全、心肌炎及后遗症、心肌梗塞恢复期、心肌纤维化等病症。芪参益气滴丸在上市七年中，已经建立起了一整套全面地的工艺质量控制体系，并且不断进行完善和补充。

黄芪提取物中含有的主要活性成分为：polysaccharides黄芪多糖，另有其他成分如：单糖、多糖、皂甙、黄酮、氨基酸、微量元素、蛋白质、核黄素、叶酸、维生素P、有机酸、香豆素、β-谷甾醇、胡萝卜甙、羽扁豆醇、正十六醇、胆碱、甜菜碱等多种成分。

中药中的糖类成分：糖类成分可分布于植物的各个部位，常常占植物干重的80％～90％，是中药材及中药产品中的主要组成成分，所占含量比例很高。另外，许多糖类成分对于中药活性成分具有辅助药效作用，同时糖类成分本身也具有为机体提供能量的作用，因此糖类成分的测定对于全面掌握中药材及中药产品质量非常重要。测定结果表明，黄芪提取物中主要含有蔗糖和果糖等小分子糖类物质，且含量较高，所以测定它们的含量非常必要。

糖类成分的测定：针对糖类成分的常用测定方法有化学分析法、气相色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、衍生化气相色谱法等。但这些方法稳定性差，灵敏度不高。

为得到一种新的黄芪提取物中糖类成分的含量测定方法，本发明采用高效液相色谱蒸发光散射检测器(HPLC-EL SD)法，具有稳定性好、灵敏度高、能够进行梯度洗脱等优点。

本发明采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，对于各个小分子糖类的分离度大大提高。相对于常用的氨基柱，具有噪音低，色谱柱寿命长的特点，是本专利的最大优势所在。

本发明以最简单的乙腈-水为流动相，能够在20分钟内完成测定，色谱峰分离度均大于3，达到高效、快速分离。

本发明采用固相萃取技术，能够有效去除黄酮、皂苷等干扰成分。

经验证本发明的质量控制方法精密度、灵敏度、稳定性良好，能够有效测定复方丹参浸膏中的糖类物质含量。

本发明针对黄芪提取物中含量较高的糖类成分建立的含量测定方法，目的是进一步提升产品质量控制水平，从而更加准确的把握产品质量。

发明内容：

本发明的目的是提供一种专属性强、灵敏度高、稳定准确的糖类成分测定方法，用于黄芪提取物中糖类成分的含量测定，该方法包括以下步骤：

1)糖类成分对照品溶液的制备

2)对黄芪提取物进行溶解，上固相萃取小柱，水洗脱，收集洗脱液；

3)采用高效液相色谱法进行样品测定。采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，以一定比例的有机溶剂和水为流动相，进行洗脱；

4)以ELSD检测器进行检测；

5)用外标两点法对数方程分别计算果糖和蔗糖的含量。

其中所述糖类成分为果糖和蔗糖。其中所述黄芪提取物为黄芪经过水煮得到的浸膏，或黄芪经过有机溶剂提取得到的浸膏。所述有机溶剂为醇类有机溶剂，醇类有机溶剂，优选乙醇，优选95％的食用乙醇。

本发明所述黄芪提取物还可以是经过水煮醇提得到的，也可以是经过醇提水沉得到的，还可以是在以上步骤的基础上进一步经过选自萃取，过柱，酸化，碱化等步骤得到的。

如采用以下方法得到黄芪提取物，提取方法包括以下步骤：黄芪药材加水煎煮3次，每次1.5h，第1次加水量为5倍量，第2、3次加水量为3倍量，合并煎煮液，浓缩至浸膏，加95％乙醇至溶液含醇量为70％，冷藏过夜，过滤，滤液浓缩至浸膏。加无水乙醇使浸膏含醇量为85％，冷藏过夜，滤过，滤液浓缩至浸膏，即可。

优选的本发明的测定方法如下：

1)对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷干燥过的果糖对照品、蔗糖对照品适量，加水制得每毫升含果糖和蔗糖分别为0.5mg和2.5mg的混合对照溶液。

2)供试品溶液的制备取黄芪提取物约0.25g，精密称定，加水约20ml，超声溶解，上至已处理好的固相萃取柱(Cleanert PS-SPE，0.5g/6ml)，流速约1ml/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液约45ml，转移至50ml量瓶中，加水至刻度，混匀，即得。

3)分别精密吸取各对照品溶液5μl、10μl，供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算果糖和蔗糖的含量，即得。其中高效液相色谱的色谱条件为：采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，以乙腈∶水＝75∶25为流动相，流速0.8ml/min，柱温30℃；以WATERS 2420 ELSD检测器进行检测，参数设置为增益10，气压25psi，漂移管60℃，Neb heater：60％。理论板数按蔗糖色谱峰计算应不低于2000。

本发明的测定方法，是经过筛选得到的，试验如下：

验证项目及验证合格标准：

项目	验证标准
		线性关系考察	R≥0.995
重复性实验	RSD％≤3.0％
		进样精密度实验	RSD％≤3.0％
加样回收率	100％±5％，RSD％≤3.0％

验证数据

1、线性关系考察：

1.1 果糖线性关系考察：

精密称取经五氧化二磷干燥过的果糖对照品，加水制得每毫升含果糖约为1mg的溶液，分别量取0.5、1、2、4、10ml上述溶液置于10ml量瓶中，加水至刻度，混匀，制成每毫升含有果糖为0.05、0.1、0.2、0.4、1.0mg的系列溶液，取10ul，注入液相色谱仪，测定，以浓度的对数对测得的峰面积的对数进行线性回归，求得回归方程。

浓度(mg/ml)	0.0521	0.1042	0.2084	0.4168	1.042
						峰面积	31935	136365	484106	985710	4753799

见图1

1.2 蔗糖线性关系考察：

精密称取经五氧化二磷干燥过的蔗糖对照品适量，加水制得每毫升含蔗糖约为5mg的溶液，分别量取0.5、1、2、4、10ml上述溶液置于10ml量瓶中，加水至刻度，混匀，制成每毫升含有蔗糖约为2.5、5.0、10.0、20.0、50.0mg的系列溶液，取10ul，注入液相色谱仪，测定，以浓度的对数对测得的峰面积的对数进行线性回归，求得回归方程。

浓度(mg/ml)	2.442	4.884	9.768	19.536	48.84
						峰面积	590810	1644976	4334261	7589296	27781251

见图2

2、进样精密度试验：

取20101202批样品，依法制备供试品溶液，重复进样6次，记录果糖和蔗糖的峰面积，计算相对标准偏差。

3、重现性试验：

取20101202批样品，依法制备供试品溶液6份，分别测定果糖和蔗糖的含量，计算相对标准偏差。

4、回收率试验：

精密称取20101202批浸膏6份，每份约0.12g，置烧杯中，各分别精密加入果糖和蔗糖对照品约7.6mg和55.0mg，自“加水约20ml”起，照含量测定项下依法处理，作为供试品溶液，取10ul注入色谱仪，记录峰面积，分别计算果糖和蔗糖的回收率。

4.1 果糖回收率数据：

4.2 蔗糖回收率数据：

验证结论：

针对黄芪提取物中糖类成分的测定方法，进行了线性关系考察、重复性、进样精密度和加样回收率等项目的方法学验证，结果如下：

结果表明，本含量测定方法回收率良好，精密度和重现性符合要求，能够有效控制黄芪提取物中的糖类物质含量。

附图说明：

图1为果糖的浓度的对数对测得的峰面积的对数曲线图

图2为蔗糖的浓度的对数对测得的峰面积的对数曲线图

图3为样品分离色谱图

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

黄芪提取物糖类成分测定方法：

照高效液相色谱法(中国药典2005版一部附录VI D)测定。

色谱条件和系统适用性试验采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，以乙腈∶水＝75∶25为流动相，流速0.8ml/min，柱温30℃；以WATERS 2420 ELSD检测器进行检测，参数设置为增益10，气压25psi，漂移管60℃，Neb heater：60％。理论板数按蔗糖色谱峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷干燥过的果糖对照品、蔗糖对照品适量，加水制得每毫升含果糖和蔗糖分别为0.5mg和2.5mg的混合对照溶液。

供试品溶液的制备取黄芪提取物约0.25g，精密称定，加水约20ml，超声溶解，上至已处理好的固相萃取柱(Cleanert PS-SPE，0.5g/6ml)，流速约1ml/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液约45ml，转移至50ml量瓶中，加水至刻度，混匀，即得。

测定法分别精密吸取各对照品溶液5μl、10μl，供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算果糖和蔗糖的含量，即得。

实施例2

黄芪提取物糖类成分测定方法：

照高效液相色谱法(中国药典2010版一部附录VI D)测定。

色谱条件和系统适用性试验采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，以乙腈∶水＝75；25为流动相，流速0.8ml/min，柱温30℃；以Alltech ELSD 2000检测器进行检测，气体流速：2.5ml/min，漂移管105℃。理论板数按蔗糖色谱峰计算应不低于4000。

以下按照实施例1同法进行。

实施例3

黄芪提取物糖类成分测定方法：

照高效液相色谱法(中国药典2010版一部附录VI D)测定。

色谱条件和系统适用性试验采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，以乙腈∶水＝70∶30为流动相，流速0.8ml/min，柱温30℃；以Alltech ELSD 2000检测器进行检测，气体流速：2.5ml/min，漂移管105℃。理论板数按蔗糖色谱峰计算应不低于4000。

以下按照实施例1同法进行。

实施例4、

黄芪提取物糖类成分测定方法：

照高效液相色谱法(中国药典2010版一部附录VI D)测定。

色谱条件和系统适用性试验采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，以甲醇∶水＝84∶16为流动相，流速0.8ml/min，柱温30℃；以Alltech ELSD 2000检测器进行检测，气体流速：2.5ml/min，漂移管105℃。理论板数按蔗糖色谱峰计算应不低于4000。

以下按照实施例1同法进行。

实施例5

黄芪提取物糖类成分测定方法：

照高效液相色谱法(中国药典2010版一部附录VI D)测定。

色谱条件和系统适用性试验采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，以乙腈为流动相A，水为流动相B，流速0.8ml/min，柱温30℃；以Alltech ELSD2000检测器进行检测，气体流速：2.5ml/min，漂移管105℃。理论板数按蔗糖色谱峰计算应不低于4000。

供试品溶液的制备取黄芪提取物约0.25g，精密称定，加水约20ml，超声溶解，上至已处理好的固相萃取柱(Waters Oasis WAX-SPE，200mg)，流速约1ml/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液约45ml，转移至50ml量瓶中，加水至刻度，混匀，即得。

Claims

1.一种黄芪提取物中糖类成分的含量测定方法，该提取物为芪参益气滴丸中间体之一，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)糖类成分对照品溶液的制备；

3)采用高效液相色谱法进行样品测定，采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，以一定比例的有机溶剂和水为流动相，进行洗脱；

4)以ELSD检测器进行检测；

5)用外标两点法对数方程分别计算果糖和蔗糖的含量。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤1)中糖类成分对照品溶液为一种混合物，是由果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等单糖、二糖、低聚糖单独、任何两种、三种、四种、五种等更多种混合配制而成。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤2)中黄芪提取物为黄芪经过有机溶媒提取得到，或在以上步骤的基础上进一步经过选自水沉，萃取，过柱，酸化，碱化等步骤得到的。

4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤2)中黄芪提取物为黄芪经过水煮得到，或在以上步骤的基础上进一步经过选自醇沉，萃取，过柱，酸化，碱化等步骤得到的。

5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤1)中糖类成分对照品溶液的制备方法为：精密称取经五氧化二磷干燥过的果糖对照品和蔗糖对照品适量，加水制得每毫升含上述物质各0.5mg的混合对照溶液。

6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤2)中黄芪提取物供试品溶液的制备方法为：取黄芪提取物0.25g，加水适量，超声溶解，上至已处理好的固相萃取柱(Cleanert PS-SPE或其他型号的聚苯乙烯基质型填料)，流速约1ml/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流，即得。

7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤3)中采用高效液相色谱法进行样品测定的方法为：采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，以乙腈或甲醇为流动相A，水为流动相B，乙腈或甲醇的比例在60-90％之间，水的比例在10-40％之间。

8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤4)中采用ELSD检测器为WATERS 2420 ELSD检测器或其他品牌ELSD检测器，采用WATERS 2420 ELSD检测器进行检测时，参数设置为增益10，气压25psi，漂移管60℃，Neb heater：60％。

9.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤5)中采用外标两点法对数方程分别计算样品中果糖和蔗糖的含量。

10.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述黄芪提取物中的糖类成分为果糖和蔗糖。