CN111024871A - 黄芪统货和选货分级标志物、检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了黄芪统货和选货分级标志物、检测试剂盒及其应用，所述的标志物包括精氨酸、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、黄芪甲苷中的一种或多种。基于该组分级标志物的分析检测方法具有高灵敏度、高通量、操作简便的优点，可在化学成分层面对黄芪统货与选货进行快速区分，对黄芪优质优价以及中药的科学分级管理具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及标志物及其应用，具体涉及黄芪统货和选货分级标志物、检测试剂盒及其应用。
背景技术
黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血等功效。现代药学研究表明，黄芪主要含有皂苷、黄酮、氨基酸以及多糖等多种活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤、降血压、降血糖、保护肝肾等药理作用。黄芪于2018年纳入药食同源目录，因此市场需求量大大增加，黄芪属根茎类药材，其大小通常与年限呈正比关系。在按大小分档的等级划分方法背后，包含着有效成分积累、资源可持续利用及后续炮制加工等多方面的因素。
目前中药饮片市场对黄芪药材等级评判参考的仍是国家于1984年发布的《七十六种药材商品规格》中关于黄芪等级划分方式，主要依据三个指标：长度、上部直径和末端直径，主要存在两种等级规格：统货和选货。通常来说，等级越高的药材，其价格也越高，这两种等级的黄芪市场价格相差近一倍。在经济利益的驱使及干燥、仓储、物流等技术提升的影响下，中药材产地加工、切片处理运输途径呈现越来越多的趋势，常用的根茎类药材几乎均以半成品形式，例如片、段等出售，不易通过外观形态来区分等级，可能存在以次充好的现象。因此，有必要寻找不依赖于外观形态区别黄芪统货与选货的新指标和新方法。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一组用于区分黄芪统货和选货的分级标志物；本发明的第二目的在于提供一种能够灵敏地分析检测所述标志物的方法；本发明的第三目的在于建立一种基于所述标志物的分类模型，用于区分黄芪统货与选货。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供一种区分黄芪统货与选货的分级标志物组合，所述分级标志物组合包括以下一种或几种分级标志物：精氨酸、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、黄芪甲苷。
本发明还提供权利要求1所述区分黄芪统货与选货的分级标志物组合在区分黄芪等级中的应用。
其中，上述分级标志物组合包括以下一种或几种：精氨酸、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、黄芪甲苷。
进一步地，上述应用包括以下步骤：
(1)加入有机试剂后离心并稀释，加入内标得到黄芪样品；
(2)对黄芪样品中精氨酸、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、黄芪甲苷中的一种或几种成分进行分析判断区分黄芪统货与选货。
优选地，步骤(2)中的成分通过将步骤(1)得到的黄芪样品通过超高效液相色谱串联质谱系统分析黄芪样本中代谢物的水平得到定量结果，并将所得的定量结果采用受试者工作曲线法进行验证。
优选地，上述超高效液相色谱串联质谱系统为基于超高效液相色谱-离子阱/飞行时间质谱，即UFLC-IT-TOF/MS技术分析不同产地黄芪的化学成分.中国药科大学学报.2019中收录的超高液相色谱-离子阱-飞行时间质谱非靶向分析方法。实现对黄芪统货和选货中小分子化合物的全谱扫描，筛选鉴定出组间相对含量差异明显且对分组有突出贡献的物质作为潜在的分级标志物。
优选地，上述步骤(2)所述分析为通过液质联用对所述分级标志物进行定量。
优选地，上述液质联用为本领域常用技术手段，包括到不限于LC-ELSD、UPLC-MS/MS。
优选地，步骤(2)中所述的标志物为精氨酸、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷或黄芪甲苷中的任意两种以上组成的组合物。
优选地，上述步骤(2)中所述的标志物为精氨酸、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷和黄芪甲苷5种组成的组合物。
进一步地，步骤(2)中所述的标志物为精氨酸、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷和黄芪甲苷中的任意4种组成的组合物。
进一步地，步骤(2)中所述的标志物为精氨酸、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷和黄芪甲苷中的任意3种组成的组合物。
进一步地，步骤(2)中所述的标志物为精氨酸、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷和黄芪甲苷中的任意2种组成的组合物。
优选地，上述精氨酸、毛蕊异黄酮、芒柄花素或芒柄花苷中的一种或几种含量较高，所述黄芪样品为选货；在黄芪选货中，精氨酸含量比黄芪统货高1.6～2.5倍，毛蕊异黄酮含量比黄芪统货高1.3～3.8倍，芒柄花素含量比黄芪统货高2.3～12.4倍，芒柄花苷含量比黄芪统货高2.3～4.4倍。
进一步地，上述黄芪甲苷含量较低，所述黄芪样品为选货；在黄芪选货中，黄芪甲苷含量为黄芪统货中含量的0.4～0.8倍。
本发明还提供一种检测试剂盒，包括权利要求1所述的分级标志物的标准品，所述标准品为分级标志物的化学单体或混合物。
优选地，上述检测试剂盒还包括溶解所述标准品的溶剂和提取富集所属标志物的溶剂中的一种或几种。
进一步地，上述溶剂为甲醇、乙腈、甲酸中的一种或几种。
本发明还提供上述的检测试剂盒在黄芪等级区分中的应用。
进一步地，其中所用到的分级标志物通过非靶向代谢组学结合参数或非参数检验、多元统计分析进行筛选。
本发明获得区分黄芪统货与选货分级标志物的具体实现步骤如下：
1、黄芪样本的分组与信息获取分析
(1)在亳州药材市场共购得36批不同等级的黄芪药材，随机分成两组：发现组和验证组，其中发现组有选货9批，统货7批，共16批药材，用超高效液相色谱-离子阱/飞行时间质谱，即UFLC-IT/TOF-MS进行非靶向代谢组学分析，寻找分级标志物；验证组有选货11批，统货9批，共20批药材，利用超高效液相色谱-三重四级杆质谱(LC-MS/MS)进行靶向代谢组学分析，用于验证分级标志物对不同等级黄芪的区分能力；
(2)整理比较两组黄芪药材的价格、长度、宽度等信息；
2、发现组黄芪样本的非靶向代谢组学分析
(1)将测试组的药材样品依次进行打粉、制备水煎液、样品前处理；
(2)UFLC-IT-TOF/MS非靶向分析；
3、数据处理与分级标志物的筛选
(1)经过预处理后的数据，运用主成分分析(Principal component analysis，PCA)和(非)参数检验等多元统计方法对数据进行分析，同时，计算每个变量在统货与选货组中均值倍数(Fold change，FC)关系；
(2)以p<0.05和|FC|>1.2为阈值来寻找黄芪选货与统货之间的分级标志物；
4、验证组黄芪样本的靶向代谢组学分析
(1)将验证组的药材样品依次进行打粉、制备水煎液、样品前处理；
(2)LC-MS/MS靶向分析；
5、黄芪统货与选货中分级标志物的含量差异比较及区分能力验证
本发明提供的一种区分黄芪统货与选货的方法，基于UFLC-IT-TOF/MS的非靶向代谢组学技术，利用非参数检验、多元统计分析等数据挖掘方法，对黄芪统货和选货样本进行分析，筛选并鉴定出差异成分，作为区分黄芪统货与选货的分级标志物，并采用基于LC-MS/MS的靶向代谢组学分析方法对所述分级标志物进行绝对定量，验证了这些分级标志物对黄芪统货与选货的区分能力。
有益效果：(1)本发明提供的一组区分黄芪统货与选货的分级标志物，实现不依靠黄芪药材的外部形态特征，在化学物质组成上对二者进行区分，而是通过黄芪样本进行验证，该组标志物相对含量在组间存在显著性差异，且结果稳定，说明该组分级标志物具有良好的特异性和灵敏度，对黄芪优质优价以及中药科学的分级分类的管理具有重要意义。(2)本发明提供的一组区分黄芪统货与选货的分级标志物，能够反映不同等级黄芪的化学成分差异，对黄芪的合理使用提供了指导。(3)从黄芪化学物质基础出发，依托本课题组建立的超高液相色谱-离子阱-飞行时间质谱非靶向分析方法(基于UFLC-IT-TOF/MS技术分析不同产地黄芪的化学成分.中国药科大学学报.2019)，实现对黄芪统货和选货中小分子化合物的全谱扫描，筛选鉴定出组间相对含量差异明显且对分组有突出贡献的物质作为潜在的分级标志物；进而利用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术对其进行定量分析。基于绝对定量结果建立机器学习分类模型，快速区分黄芪统货与选货，其对黄芪优质优价以及中药的科学分级管理具有重要意义。
附图说明
图1为基于UFLC-IT-TOF/MS的黄芪统货与选货的PCA得分图，PG为选货，UG为统货；
图2为五个分级标志物联合区分验证组黄芪统货VS黄芪选货的混淆矩阵图，PG为选货，UG为统货；
图3为五个分级标志物联合区分验证组黄芪统货VS黄芪选货ROC曲线图，A为黄芪选货的ROC曲线图；B为黄芪统货的ROC曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容。使用的试剂或仪器未做详细说明的均为常规仪器和试剂；未具体描述的实验操作方法均为本领域普通技术人员公知的常规操作方法。
实施例1
黄芪统货与选货之间分级标志物的筛选表征
一、对象和方法
1.药材采集与处理
取测试组黄芪药材，其中选货9批，统货7批，共16批药材。分别将每批药材粉碎后过40目筛，称取10g药粉，加100mL超纯水，煎煮2h后，收集滤液；滤渣再加100mL超纯水，再次煎煮2小时，收集滤液；合并两次滤液冻干成粉。
2.标准品与试剂
标准品黄芪甲苷(批号110781-201717)、芒柄花素(批号111703-201504)等均购自中国药品生物制品检定所；毛蕊异黄酮(批号DST171108-012)购自成都德思特生物技术有限公司；芒柄花苷购自中国食品药品检定研究院；HPLC级甲醇和乙腈购买自德国Merck公司；甲酸(色谱纯)购自美国ROE公司；超纯水由美国Millipore的Milli-Q纯水制备系统制备。
3.UFLC-IT-TOF/MS筛选表征
3.1样品制备
取冻干粉适量(相当于生药0.1g)，精密称定，加入70％甲醇1.0mL，涡旋(1min)、超声(10min)、离心(16000r/min，10min)，取上清，过0.22μm滤膜后进行LC-IT-TOF/MS分析。
3.2试验条件及参数
采用超快速液相色谱-离子阱飞行时间质谱(UFLC-IT-TOF/MS)对样品进行非靶向代谢组学分析。
色谱条件：选用Waters XSelect HSS T3 XP(2.1×100mm,2.5μm)色谱柱，以甲醇(A)和0.1％甲酸的水溶液(B)为流动相进行梯度洗脱，具体梯度如下：0～6min，1％A；6～7min，1～35％A；7～13min，35％A；13～15min，35～50％A；15～17min，50％A；17～18min，50～75％A；18～21min，75％A；21～22min，75～100％A；22～26min，100％A；26～27min，100～1％A；27～30min，1％A。流速：0.25mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL。
质谱条件：离子源为电喷雾(ESI)源，采用正、负离子切换同时检测模式；雾化气流速：1.5L/min；干燥气气压：104kPa；检测电压：1.8kV，离子源入口电压：正极4.5kV，负极-3.5kV。曲线脱溶剂管温度和加热模块温度均为200℃；离子积聚时间：20ms；扫描范围：m/z100-1000。
3.3数据处理与分级标志物的筛选
将UFLC-IT-TOF/MS采集到的代谢物峰信息进行预处理，包括填补缺失值，内标归一化等，得到的数据矩阵导入Mathematica软件(Ver 11.3,Wolfram,USA)进行主成分分析和(非)参数检验，差异显著性分析采用Student’s T Test(呈正态分布的变量)或Mann-Whitney U Test(呈非正态分布的变量)；同时，计算每个变量在统货与选货组中均值倍数(Fold change，FC)关系。寻找p<0.05且|FC|>1.2的小分子化合物。
将差异离子的质荷比、多级碎片等信息与TCMSP(tcmspw.com/tcmsp.php)、GNPS(gnps.ucsd.edu)等中药成分数据库以及文献中黄芪的成分信息进行比对，初步鉴定其化学结构；进而购买标准品，通过比对保留时间、准确质量数以及碎片离子，确定差异变量的归属。
二、结果
筛选表征出5个分级标志物，分别为精氨酸、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、黄芪甲苷。
上述标志物中，精氨酸、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素4个差异标志物在黄芪选货中含量较高，而黄芪甲苷在黄芪选货中含量较统货低。
实施例2
构建ROC曲线用于验证5个分级标志物用于区分黄芪统货和选货的能力1.药材采集与处理
取验证组黄芪药材，其中选货11批，统货9批，共20批药材。处理方法同实施例1“1.药材采集与处理”。
2.标准品与试剂
芦荟大黄素(纯度>98％)购自成都德思特生物技术有限公司；L-精氨酸(纯度>98％)和普瑞巴林(纯度>99％)购自美国Sigma-Aldrich公司。其他标准品与试剂同实施例1“2.标准品与试剂”。
3.LC-MS/MS靶向定量分析
3.1样本制备
称取冻干粉适量(折合成黄芪药材量0.1g)，加入1mL70％甲醇，涡旋1min，超声10min后，离心(3500rpm，4℃，10min)后取上清，加入70％甲醇稀释10倍后过有机相滤膜。取100μL稀释液，加入10μL内标(普瑞巴林2μg/mL，芦荟大黄素150μg/mL)，涡旋混匀后进样。
3.2试验条件及参数
采用超高效液相色谱串联质谱系统(LC-MS/MS 8040，Shimadzu Co.,Kyoto,Japan)下多反应监控(Multiple Reaction Monitoring，MRM)模式分析黄芪样本中代谢物的水平。
色谱条件：使用Zorbax SB C18(2.1×150mm，3.5μm)的色谱柱；柱温：40℃；进样器温度：4℃；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)二元梯度洗脱系统，洗脱梯度如下：0-9min，10％-85％B，9-11min，85％B，11-13min，85％-10％B，13-18min，10％B。流速：0.25mL/min；进样量：2μL。
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正、负离子多反应选择监测(MRM)结合选择离子监测(SIM)扫描方式采集数据；喷雾电压：0-4.5min：4.5kV；4.51-18min：-3.5kV；氮气作为雾化气和干燥气，流量分别为3L/min和15L/min；氩气作为CID气，压力为230kPa；DL管温度：250℃；加热部件温度:400℃；离子累积时间：100ms；各物质测定参数如表1所示：
表1基于LC-MS/MS的相关代谢物测定参数
3.3数据处理和分析
将所得的定量结果采用受试者工作曲线(ROC)法进行验证，通过黄芪统货与选货分级标志物的含量判断其用于区分黄芪统货与选货的能力。
二、结果
通过标准品定量，上述5个分级标志物在黄芪统货与选货中表达水平存在显著性差异，其中精氨酸、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素4个差异标志物在黄芪选货中含量较多，与黄芪统货相比，黄芪选货中精氨酸含量高1.6～2.5倍，毛蕊异黄酮含量高1.3～3.8倍，芒柄花素含量高2.3～12.4倍，芒柄花苷含量高2.3～4.4倍；而黄芪甲苷降低为0.4～0.8倍。
ROC曲线结果表明，5个分级标志物联合用于区分黄芪统货与选货的能力较强，随着联合个数的增加，AUC逐步步提高，5个全部联合时最高，AUC达到0.949，灵敏度和特异性分别为90.9％和90.9％，具有现实区分意义。任意2～4个联合诊断结果见表2。
表2任意二～四个分级标志物区分黄芪统货与选货
| 联合个数 | AUC | 灵敏度 | 特异性 |
| 二个 | ≥0.818 | ≥63.6％ | ≥66.7％ |
| 三个 | ≥0.848 | ≥72.7％ | ≥77.8％ |
| 四个 | ≥0.899 | ≥90.9％ | ≥88.9％ |
实施例3
检测试剂盒的制备：
基于本发明提供分的分级标志物制备了检测试剂盒，该试剂盒包含如下成分：
分级标志物标准品：精氨酸、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、黄芪甲苷；
检测试剂：甲醇、乙腈、甲酸；
内标：普瑞巴林、芦荟大黄素。
当然，设计检测试剂盒时，并不需要完全包含上述5个分级标志物的标准品，可以仅使用其中几个进行组合。这些标准品可以单独封装，也可以制成混合物封装。
该试剂盒是基于本发明提供的分级标志物而设计的，可以用于黄芪统货与选货的区分。
综上所述，本发明在化学成分上对黄芪统货与选货进行了区分，对黄芪优质优价管理具有重要意义。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
Claims (10)
1.一种区分黄芪统货与选货的分级标志物组合，其特征在于，所述分级标志物组合包括以下一种或几种分级标志物：精氨酸、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、黄芪甲苷。
2.权利要求1所述区分黄芪统货与选货的分级标志物组合在区分黄芪等级中的应用。
3.根据权利要求2中所述区分黄芪统货与选货的分级标志物组合在区分黄芪等级中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)加入有机试剂后离心并稀释，加入内标得到黄芪样品；
(2)对黄芪样品中精氨酸、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、黄芪甲苷中的一种或几种标志物进行分析判断区分黄芪统货与选货。
4.根据权利要求3中所述区分黄芪统货与选货的分级标志物组合在区分黄芪等级中的应用，其特征在于：步骤(2)所述分析为通过液质联用对所述分级标志物进行定量。
5.根据权利要求2-4中任一所述区分黄芪统货与选货的分级标志物组合在区分黄芪等级中的应用，其特征在于：步骤(2)中所述的标志物为精氨酸、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷或黄芪甲苷中的5种组成的组合物。
6.根据权利要求2-4中任一所述区分黄芪统货与选货的分级标志物组合在区分黄芪等级中的应用，其特征在于：步骤(2)中所述的标志物为精氨酸、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷和黄芪甲苷中的任意4种组成的组合物。
7.根据权利要求2-4中任一所述区分黄芪统货与选货的分级标志物组合在区分黄芪等级中的应用，其特征在于：步骤(2)中所述的标志物为精氨酸、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷和黄芪甲苷中的任意3种组成的组合物。
8.根据权利要求2-4中任一所述区分黄芪统货与选货的分级标志物组合在区分黄芪等级中的应用，其特征在于：步骤(2)中所述的标志物为精氨酸、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷和黄芪甲苷中的任意2种组成的组合物。
9.一种检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的分级标志物的标准品，所述标准品为分级标志物的化学单体或混合物。
10.权利要求9所述的检测试剂盒在黄芪等级区分中的应用。
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