CN118169291A - 一种脑脉利颗粒指纹图谱的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物分析技术领域，尤其是指一种脑脉利颗粒指纹图谱的构建方法及其应用，包括以下步骤：S1，制备脑脉利颗粒的供试品溶液；S2，制备混合对照品溶液；S3，上机测定；S4，生成对照指纹图谱。本发明能够通过一次检测，将全部药材的不同类型成分呈现在一个图谱上，提取方法简便，重现性好。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，尤其是指一种脑脉利颗粒指纹图谱的构建方法及其应用。
背景技术
脑脉利颗粒源于治疗脑卒中的古方“补阳还五汤”，具有活血化瘀，益气通脉之功效，适用于气虚血瘀型中风病中经络急性期，临床上可用于半身不遂、偏身麻木、口舌歪斜、语言蹇涩等症状的治疗。现代药理学研究表明，脑脉利颗粒可减轻大鼠缺血再灌注损伤、过氧化及炎症损伤，具有促进血管新生、抑制血小板聚焦、降低血脂水平之功效，对治疗脑卒中能够体现出多靶点、多途径等作用特点。
脑脉利由益母草、三七、黄芪、川芎、姜黄、红花、丹参、赤芍、当归、白芍、川牛膝共11味药组成。目前，该制剂执行标准中仅包括颗粒剂的常规检查及利用薄层法的盐酸水苏碱含量测定项，对关于脑脉利颗粒的质量研究文献较少，尚未有对其质量进行整体控制的研究报道。
中药指纹图谱是目前能够为国内外广泛接受的一种中药或天然药物质量评价模式，它的应用与快速发展体现了中药的全面质量评价，符合中药质量控制整体表征分析的特点。建立中药指纹图谱的测定技术涉及众多分析手段。其中，高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱法(GC)已成为公认的中药指纹图谱的常用分析技术。然而相比于HPLC，超高效液相色谱法(UPLC)具有分离效果好，稳定性高，重复性好、分析时间少等优点。因此，本发明采用UPLC来构建脑脉利颗粒指纹图谱。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种脑脉利颗粒指纹图谱的构建方法及其应用，能够通过一次检测，将全部药材的不同类型成分呈现在一个图谱上，提取方法简便，重现性好。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种脑脉利颗粒指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
S1，制备脑脉利颗粒的供试品溶液：用甲醇超声处理不同批次的脑脉利颗粒供试品，取上清液得脑脉利供试品溶液；
S2，制备混合对照品溶液：取对照品分别加甲醇超声溶解，制成单一的对照品储备液后，各取等体积的单一对照品储备液置于同一容器中，加甲醇定容，即得混合对照品溶液；
S3，上机测定：分别精密吸取S2中制得的混合对照品溶液和S1中值得的供试品溶液注入超高效液相色谱仪，记录色谱图；
S4，生成对照指纹图谱：将S3中获得的脑脉利颗粒色谱文件从仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统；选择不同批次脑脉利颗粒的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成脑脉利颗粒的对照指纹图谱。
优选的，步骤S1中制备脑脉利颗粒的供试品溶液的具体方法如下：称取脑脉利颗粒置于锥形瓶中，加入甲醇，300W/40kHz超声处理30min，冷却，补足重量，摇匀，静置，取上清液于14000rpm离心8min，取上清液即得脑脉利供试品溶液。
优选的，步骤S2中的对照品为：没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、羟基红花黄色素A、芍药内酯苷、芍药苷、益母草碱、毛蕊异黄酮苷、金丝桃苷、芦丁、芍药新苷、丹酚酸B、丹酚酸A、毛蕊异黄酮、芒柄花素、汉黄芩素、姜黄素、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA。
优选的，步骤S3中注入超高效液相色谱仪(UPLC)进行色谱分析的样品的进样量为3μL。
优选的，步骤S3中脑脉利颗粒指纹图谱测定的色谱条件为：色谱柱规格为：WatersXBridge C18 column(3.0×150mm,3.5μm)；以体积百分比浓度0.3％甲酸水溶液为流动相A，甲醇为流动相B，流速为0.3mL/min；检测波长为254nm；柱温为35℃。
优选的，步骤S3中脑脉利颗粒指纹图谱测定的梯度洗脱的流程为：0～4分钟，95→90％流动相A，5→10％流动相B；4～8分钟，90→80％流动相A，10→20％流动相B；8～18分钟，80→74％流动相A，20→26％流动相B；18～21分钟，74→68％流动相A，26→32％流动相B；21～36分钟，68→62％流动相A，32→38％流动相B；36～46分钟，62→42％流动相A，38→58％流动相B；46～53分钟，42→32％流动相A，58→68％流动相B；53～65分钟，32→28％流动相A，68→72％流动相B；65～70分钟，28→25％流动相A，72→75％流动相B；70～75分钟，25→15％流动相A，75→85％流动相B。
优选的，步骤S4生成的所述指纹图谱包括32个色谱共有峰，具体为：与没食子酸对应的1号峰、与原儿茶酸对应的4号峰、与新绿原酸对应的6号峰、与羟基红花黄色素A对应的7号峰、与芍药内酯苷对应的8号峰、与芍药苷对应的9号峰、与益母草碱对应的10号峰、与毛蕊异黄酮苷对应的11号峰、与金丝桃苷对应的12号峰、与芦丁对应的13号峰、与芍药新苷对应的14号峰、与丹酚酸B对应的S峰、与丹酚酸A对应的17号峰、与毛蕊异黄酮对应的18号峰、与芒柄花素对应的21号峰、与汉黄芩素对应的22号峰、与姜黄素对应的24号峰、与丹参酮I对应的26号峰、与隐丹参酮对应的28号峰、与丹参酮IIA对应的32号峰。
优选的，特征峰以丹酚酸B色谱峰为参照，20个色谱峰的相对保留时间分别为0.134、0.236、、0.297、0.767、0.475、0.575、0.645、0.697、0.775、0.814、0.905、1.000、1.166、1.182、1.400、1.478、1.551、1.759、1.779、1.987。
根据上述任意一项所述的一种脑脉利颗粒指纹图谱的构建方法的应用，该脑脉利颗粒指纹图谱在脑脉利颗粒特征成分的质量监控的应用。
根据上述任意一项所述的一种脑脉利颗粒指纹图谱的构建方法的应用，其特征在于：该脑脉利颗粒指纹图谱在脑脉利颗粒生产质量管控中的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明对脑脉利颗粒建立了UPLC指纹图谱，采用UPLC-MS进行相关物质指认，明确了20个特征峰，可充分展示脑脉利颗粒的化学特征。所构建的指纹图谱可全面地反应脑脉利颗粒的药效成分，提升对脑脉利颗粒化学物质基础的认识。
2、本发明样品前处理简单、快捷。对所构建的脑脉利颗粒指纹图谱方法进行方法学考察，包括仪器精密度实验、方法重复性实验、样品稳定性实验。各实验结果的RSD值均≤2％。表明该方法重现性好可以满足大批量样本分析测试需求。能够通过一次检测，将全部药材的不同类型成分呈现在一个图谱上，提取方法简便，重现性好。
3、本发明方法稳定、准确可靠，可实现同时分析不同生产批次脑脉利颗粒中多个特征成分的含量。该方法也可为脑脉利颗粒大量生产的质量控制提供数据基础，保证和提升产品质量的稳定性和可控性。
附图说明
图1为20个化合物混合对照品溶液色谱图。
图2为脑脉利颗粒UPLC对照指纹图谱(共有模式，n＝27)。
图3-1～3-3为不同检测波长下脑脉利颗粒样品检测色谱图。
图4-1～4-5为不同洗脱系统下脑脉利颗粒样品检测色谱图。
图5-1～5-2为不同色谱柱脑脉利颗粒样品检测色谱图。
图6-1～6-3为不同流速脑脉利颗粒样品检测色谱图。
图7-1～7-3为不同柱温脑脉利颗粒样品检测色谱图。
图8-1～8-6为不同洗脱梯度脉利颗粒样品检测色谱图。
图9-1～9-5为不同提取溶剂脉利颗粒样品检测色谱图。
图10为27批脑脉利颗粒UPLC指纹图谱。
图11为27批脑脉利颗粒UPLC指纹图谱相似度计算结果。
其中，图1-9的图谱横坐标表示时间，单位为：min；图谱纵坐标表示吸光度，单位为：AU。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例与附图对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1
1、仪器与试药：
1.1仪器
表1仪器信息表
| 仪器名称 | 生产厂家 |
| WatersUPLC超高效液相色谱仪 | 美国沃特世公司 |
| KQ5200B型超声清洗器 | 昆山市超声仪器有限公司 |
| AUW120ASSY(CHN)型电子分析天平 | 日本岛津公司 |
| ME155DU型十万分之一电子天平 | 梅特勒-托利多科技有限公司 |
1.2试药
1.2.1对照品信息
表2对照品信息
1.2.2试剂
表3试剂信息表
| 试剂 | 厂家 |
| 色谱乙腈 | 北京迈瑞达科技有限公司 |
| 色谱甲醇 | 北京迈瑞达科技有限公司 |
| 超纯水 | 屈臣氏蒸馏水 |
| 甲酸 | Fisher公司 |
1.2.3实验样品：实验中所有批次脑脉利颗粒均由南京柯菲平盛辉制药有限公司提供。批号详情如表4所示：
表4样品信息表
实施例2
2、脑脉利颗粒指纹图谱构建方法
2.1色谱条件：色谱柱Waters XBridge C18 column(3.0×150mm,3.5μm)。以含体积百分比浓度0.3％甲酸水溶液为流动相A，甲醇为流动相B。按下表5中的规定进行梯度洗脱；流速为0.3mL/min；检测波长为254nm；柱温为35℃。
表5梯度洗脱表
| Time(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 95％ | 5％ |
| 4 | 90％ | 10％ |
| 8 | 80％ | 20％ |
| 18 | 74％ | 26％ |
| 21 | 68％ | 32％ |
| 36 | 62％ | 38％ |
| 46 | 42％ | 58％ |
| 53 | 32％ | 68％ |
| 65 | 28％ | 72％ |
| 70 | 25％ | 75％ |
| 70 | 15％ | 85％ |
2.2供试品溶液制备
取脑脉利颗粒0.1g，置于锥形瓶中，精密加入100％甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再次称定重量，用100％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液于14000rpm离心8min，取上清液置于液相瓶中即得。
2.3混合对照品溶液制备
精密称定没食子酸对照品(1.22mg)、原儿茶酸对照品(1.09mg)、新绿原酸对照品(1.11mg)、羟基红花黄色素A对照品(1.20mg)、芍药内酯苷对照品(1.32mg)、芍药苷对照品(1.42mg)、益母草碱对照品(1.15mg)、毛蕊异黄酮苷对照品(1.15mg)、金丝桃苷对照品(1,13mg)、芦丁对照品(1.18mg)、芍药新苷对照品(1.37mg)、丹酚酸B对照品(1.27mg)、丹酚酸A对照品(1.30mg)、毛蕊异黄酮对照品(1.44mg)、芒柄花素对照品(1.41mg)、汉黄芩素对照品(1.25mg)、姜黄素对照品(1.33mg)、丹参酮I对照品(1.16mg)、隐丹参酮对照品(1.23mg)、丹参酮IIA对照品(1.22mg)，，分别加100％甲醇溶液超声溶解，冷却，定容，摇匀，制成单一的对照品储备液。分别取单标对照品溶液各50μL，定容至1mL，摇匀，静置，取上清液于14000rpm离心8min，取上清液置于液相瓶即得。
2.4脑脉利颗粒指纹图谱与数据分析
取2.3项下制备的混合对照品溶液各3μL。注入超高效液相色谱仪，记录75min的色谱图。按2.2项下方法制备27批脑脉利颗粒供试品，各取3μL注入超高效液相色谱仪。混合对照品溶液的色谱图见图1；供试品溶液的色谱图见图2。将测得的脑脉利颗粒指纹图谱从仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次脑脉利颗粒色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成对照指纹图谱，并计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
实施例3
3.脑脉利颗粒指纹图谱构建方法的考察
3.1色谱条件的优化
3.1.1检测波长的选择
脑脉利颗粒由11味中药组成，其化学成分性质、数量和种类复杂，本实验建立的指纹图谱要尽可能多的显示其化学成分的信息。因此本实验选用PDA检测器，PDA检测器的检测范围为190nm～400nm。本实验比较了常用紫外检测波(254nm、280nm、320nm)下的色谱图。结果显示：在320nm检测波长下，弱极性成分物质基本检测不到，在280nm检测波长下，弱极性成分色谱峰数量较254nm检测波长有所减少，可以看出在254nm下基线平稳且共有峰数量较多，且响应值较高。因此本实验选择254nm作为脑脉利颗粒指纹图谱的检测波长。结果见图3-1～3-3。
3.1.2流动相的选择
本实验考察了甲醇-0.2％甲酸水、甲醇-0.3％甲酸水、乙腈-0.3％甲酸水、甲醇-0.1％磷酸水、甲醇-0.2％乙酸水作为流动相，除洗脱系统条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。以色谱峰的分离度以及基线平稳性为指标来确定脑脉利颗粒指纹图谱的洗脱系统。结果显示：若以乙腈-0.3％甲酸水为流动相、色谱峰较多成分出峰较早，且分离度较差；若以甲醇-0.2％乙酸水为流动相，前20min基线波动较大；若以甲醇-0.1％磷酸水为流动相，色谱峰峰型较差，对称性不好。且磷酸对色谱柱寿命影响较大。确定甲醇-甲酸体系后，又对酸的浓度进行了考察，若以甲醇-0.2％甲酸水为流动相，中极性成分的分离度较差；若以甲醇-0.3％甲酸水为流动相，色谱图信息较为丰富，色谱峰分离度较好，出峰时间适宜，基线平稳。因此最终确定甲醇-0.3％甲酸水作为脑脉利颗粒指纹图谱的流动相洗脱系统。结果见图4-1～4-5。
3.1.3色谱柱的选择
本实验比较了Waters XBridge C18 column(3.0×150mm,3.5μm)和T3column(3.0×150mm,3.0μm)两根色谱柱对脑脉利颗粒指纹图谱色谱峰的影响。除色谱柱外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。以色谱峰的分离度、峰数目、峰型以及基线平稳性为指标来确定脑脉利颗粒指纹图谱的色谱柱。结果显示：若以/>T3column(3.0×150mm,3.0μm)为色谱柱，色谱峰分离度、对称性较差，基线波动较大。若以WatersXBridge C18 column(3.0×150mm,3.5μm)为色谱柱，色谱峰峰数较多、分离度、峰型较好，且基线较平稳。因此选择Waters XBridge C18 column(3.0×150mm,3.5μm)柱为脑脉利颗粒指纹图谱研究色谱柱。结果见图5-1～5-2。
3.1.4流速的选择
本实验比较了0.2mL/min、0.3mL/min、0.4mL/min三种流速对脑脉利颗粒指纹图谱色谱峰的影响。除流速外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。以色谱峰的分离度、峰数目、峰型以及基线平稳性为指标来确定脑脉利颗粒指纹图谱的流速。结果显示：若以0.2mL/min作为检测流速，前端极性较大成分分离度较差且分析时间较长；若以0.4mL/min作为检测流速，中极性成分色谱峰分离度降低、峰变宽；若以0.3mL/min作为检测流速，色谱峰分离度、峰型较好，且基线较平稳。因此选择0.3mL/min作为脑脉利颗粒指纹图谱检测流速。结果见图6-1～6-3。
3.1.5柱温的选择
本实验比较了25℃、30℃、35℃三种色谱柱柱温对脑脉利颗粒指纹图谱色谱峰的影响。除色谱柱柱温外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。以色谱峰的分离度、峰数目、峰型以及基线平稳性为指标来确定脑脉利颗粒指纹图谱的色谱柱柱温。结果显示：若以25℃作为检测温度，前端极性较大成分分离度较差；若以30℃作为检测温度，前端极性较大成分分离度有所改善，但极性较小成分分离度仞较差；若以35℃作为检测温度，极性较小成分分离度明显较好，峰数明显较多，且基线较平稳。因此本实验选择35℃作为脑脉利颗粒指纹图谱研究色谱柱柱温。结果见图7-1～7-3。
3.1.6洗脱梯度的选择
以Waters XBridge C18 column(3.0×150mm,3.5μm)为色谱柱，以含体积百分比浓度0.3％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，按表6-表11中的规定进行梯度洗脱。除洗脱梯度外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。流速为0.3mL/min；检测波长为254nm；柱温为35℃。以色谱峰的分离度、峰数目、峰型以及基线平稳性为指标来确定脑脉利颗粒指纹图谱的色谱柱柱温。结果见图8-1～8-6，根据实验结果，本实验选择表11中的洗脱梯度6作为脑脉利颗粒指纹图谱的梯度条件。
表6洗脱梯度1
| Time(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 95 | 5 |
| 3 | 90 | 10 |
| 8 | 80 | 20 |
| 18 | 70 | 30 |
| 25 | 60 | 40 |
| 40 | 55 | 45 |
| 43 | 30 | 70 |
| 52 | 12 | 88 |
| 58 | 10 | 90 |
表7洗脱梯度2
表8洗脱梯度3
| Time(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0.01 | 95 | 5 |
| 2 | 90 | 10 |
| 5 | 80 | 20 |
| 13 | 70 | 30 |
| 18 | 60 | 40 |
| 34 | 52 | 48 |
| 40 | 30 | 70 |
| 43 | 15 | 85 |
| 49 | 15 | 85 |
| 55 | 5 | 95 |
表9洗脱梯度4
表10洗脱梯度5
| Time(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 95 | 5 |
| 4 | 90 | 10 |
| 8 | 80 | 20 |
| 18 | 74 | 26 |
| 21 | 68 | 32 |
| 36 | 62 | 38 |
| 48 | 40 | 60 |
| 55 | 25 | 75 |
| 63 | 22 | 78 |
| 68 | 15 | 85 |
表11洗脱梯度6
3.1.7色谱条件的确定
综合以上实验结果，脑脉利颗粒指纹图谱色谱条件确定为：色谱柱选用WatersXBridge C18 column(3.0×150mm,3.5μm)。以含体积百分比浓度0.3％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B；流速为0.3mL/min、柱温为35℃，检测波长为254nm。按表中的规定进行梯度洗脱。
3.2.供试品溶液制备方法考察
3.2.1提取溶剂的选择
本实验对脑脉利颗粒指纹图谱供试品溶液提取溶剂进行了考察，比较了水、50％、70％、100％甲醇溶剂体系，结果显示，若用水做提取溶剂时，前面极性较大化合物色谱峰强度较高。然而小极性化合物色谱峰个数相比于其他溶剂体系较少。随着体系中甲醇浓度的升高，小极性化合物色谱峰个数明显增加，70％甲醇溶剂体系与100％溶剂体系在色谱峰峰数与分离度无显著差异，但100％甲醇溶剂体系基线较平稳。因此本实验选择100％甲醇作为脑脉利颗粒指纹图谱供试品溶液的提取溶剂。结果见图9-1～9-5。
3.2.2提取方式的选择
本实验对脑脉利颗粒指纹图谱供试品溶液提取方式进行了考察，比较了超声30min与回流30min两种方式对脑脉利颗粒指纹图谱色谱峰的影响。除提取方式外，其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。以主峰面积除以称样量为指标，来确定脑脉利颗粒指纹图谱供试品溶液的提取方式。结果显示，两种提取方式所得结果相当。因此，选择操作简便的超声作为脑脉利颗粒指纹图谱供试品溶液提取方式。结果见表12。
表12提取方式
| 提取方式 | 主峰面积/称样量 |
| 超声30min | 4326640 |
| 回流30min | 4325871 |
3.3.3提取时间的选择
本实验对脑脉利颗粒指纹图谱供试品溶液提取时间进行了考察，比较了15min、30min、40min三个水平对脑脉利颗粒指纹图谱色谱峰的影响。除提取时间外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。以主峰面积除以称样量为指标来确定脑脉利颗粒指纹图谱供试品溶液的提取时间。结果显示，30min优于15min，与40min无明显差异，因此最终确定脑脉利颗粒指纹图谱供试品溶液提取时间为30min。结果见表13
表13提取时间
| 提取时间 | 主峰面积/称样量 |
| 15min | 3936780 |
| 30min | 4156342 |
| 40min | 4198774 |
3.3.4提取溶剂用量的选择
本实验对脑脉利颗粒指纹图谱供试品溶液提取溶剂用量进行了考察。比较了5mL、10mL、20mL两种溶剂用量对脑脉利颗粒指纹图谱色谱峰的影响。除溶剂用量外，其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。以主峰面积除以称样量为指标，来确定脑脉利颗粒指纹图谱供试品溶液的提取溶剂用量。结果显示，增加溶剂用量对总峰面积除以称样量略有不同但无显著影响，各色谱峰提取均较充分；而溶剂用量为5mL时，样品粘度较大。因此，因此最终确定脑脉利颗粒指纹图谱供试品溶液提取溶剂用量为10mL。结果见表14
表14提取溶剂用量
| 提取溶剂用量 | 主峰面积/称样量 |
| 5mL | 4587564 |
| 10mL | 4464321 |
| 20mL | 4397785 |
3.3.5供试品溶液制备方法的确定
综合以上实验结果，脑脉利颗粒指纹图谱供试品溶液制备方法为：
取脑脉利颗粒0.1g，置于锥形瓶中，精密加入100％甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再次称定重量，用100％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液于14000rpm离心8min，取上清液置于液相瓶中即得。
实施例4
方法学验证
精密度实验
取批号为11-210806批的脑脉利颗粒指纹图谱，按2.2项下制备方法制备供试品溶液。精密吸取供试品3μL，连续进样6次，进行UPLC分析。结果表明，共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均≤2％，表明仪器精密度良好。结果见表15-表16。
表15脑脉利颗粒指纹图谱精密度考察结果(相对保留时间)
/>
表16脑脉利颗粒指纹图谱精密度考察结果(相对峰面积)
/>
稳定性实验
取批号为11-210806批的脑脉利颗粒指纹图谱，按2.2项下制备方法制备供试品溶液。精密吸取供试品3μL，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h共测定6个时间点，进行UPLC分析。结果表明，共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均≤2％，表明供试品在室温条件下24h内稳定性良好。结果见表17-表18。
表17脑脉利颗粒指纹图谱稳定性考察结果(相对保留时间)
/>
表18脑脉利颗粒指纹图谱稳定性考察结果(相对峰面积)
/>
重复性实验
取批号为11-210806批的脑脉利颗粒指纹图谱，按2.2项下制备方法制备供试品溶液6份。精密吸取供试品3μL，进行UPLC分析。结果表明，共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均≤2％，表明该方法重复性良好。结果见表19-表20。
表19脑脉利颗粒指纹图谱重复性考察结果(相对保留时间)
/>
表20脑脉利颗粒指纹图谱重复性考察结果(相对峰面积)
/>
/>
实施例5
脑脉利颗粒指纹图谱的建立
5.127批脑脉利颗粒指纹图谱的检测
取27批脑脉利颗粒按照3.3.5项下配置成供试品溶液，按照3.1.7项下色谱条件进行UPLC分析。将生成的27批脑脉利颗粒指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，生成对照指纹图谱，27批脑脉利颗粒指纹图谱如图10所示。同时计算各批次脑脉利颗粒指纹图谱的相似度值。结果显示相似度计算值均大于0.9，各批次相似度高。
5.2共有峰的确定及对照指纹图谱的获得
将27批脑脉利颗粒指纹图谱的AIA格式从仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(如图11)。选择指纹图谱中均存在的色谱峰作为共有峰。用平均值计算法生成脑脉利颗粒的对照指纹图谱，见图10。计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积和相似度，结果见表21～26。
表21 27批脑脉利颗粒指纹图谱测定结果1(相对保留时间)
/>
/>
表22 27批脑脉利颗粒指纹图谱测定结果2(相对保留时间)
/>
表23 27批脑脉利颗粒指纹图谱测定结果3(相对保留时间)
/>
表24 27批脑脉利颗粒指纹图谱测定结果1(相对峰面积)
/>
表25 27批脑脉利颗粒指纹图谱测定结果2(相对峰面积)
/>
/>
表26 27批脑脉利颗粒指纹图谱测定结果3(相对峰面积)
/>
综上所述，本发明采用超高效液相对脑脉利颗粒进行色谱分析，所建立的UPLC指纹图谱能够在75min内实现32个共有峰的色谱表征，并对其中20个主要色谱峰进行了化学成分的指认，覆盖了益母草、黄芪、丹参、红花、丹参、白芍、赤芍、姜黄等药材。可为脑脉利颗粒临床应用与质量控制提供技术支撑。
以上具体实施方式仅是对本发明所涉及的分析方法进行了具体介绍，不是对相关内容的限制。
本实施例中的所有技术特征均可根据实际需要而进行外观修改。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本技术方案构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种脑脉利颗粒指纹图谱的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1，制备脑脉利颗粒的供试品溶液：用甲醇超声处理不同批次的脑脉利颗粒供试品，取上清液得脑脉利供试品溶液；
S2，制备混合对照品溶液：取对照品分别加甲醇超声溶解，制成单一的对照品储备液后，各取等体积的单一对照品储备液置于同一容器中，加甲醇定容，即得混合对照品溶液；
S3，上机测定：分别精密吸取S2中制得的混合对照品溶液和S1中值得的供试品溶液注入超高效液相色谱仪，记录色谱图；
S4，生成对照指纹图谱：将S3中获得的脑脉利颗粒色谱文件从仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统；选择不同批次脑脉利颗粒的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成脑脉利颗粒的对照指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的一种脑脉利颗粒指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤S1中制备脑脉利颗粒的供试品溶液的具体方法如下：称取脑脉利颗粒置于锥形瓶中，加入甲醇，300W/40kHz超声处理30min，冷却，补足重量，摇匀，静置，取上清液于14000rpm离心8min，取上清液即得脑脉利供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的一种脑脉利颗粒指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤S2中的对照品为：没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、羟基红花黄色素A、芍药内酯苷、芍药苷、益母草碱、毛蕊异黄酮苷、金丝桃苷、芦丁、芍药新苷、丹酚酸B、丹酚酸A、毛蕊异黄酮、芒柄花素、汉黄芩素、姜黄素、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA。
4.根据权利要求1所述的一种脑脉利颗粒指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤S3中注入超高效液相色谱仪进行色谱分析的样品的进样量为3μL。
5.根据权利要求1所述的一种脑脉利颗粒指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤S3中脑脉利颗粒指纹图谱测定的色谱条件为：色谱柱规格为：Waters XBridge C18 column；以体积百分比浓度0.3％甲酸水溶液为流动相A，甲醇为流动相B，流速为0.3mL/min；检测波长为254nm；柱温为35℃。
6.根据权利要求1所述的一种脑脉利颗粒指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤S3中脑脉利颗粒指纹图谱测定的梯度洗脱的流程为：0～4分钟，95→90％流动相A，5→10％流动相B；4～8分钟，90→80％流动相A，10→20％流动相B；8～18分钟，80→74％流动相A，20→26％流动相B；18～21分钟，74→68％流动相A，26→32％流动相B；21～36分钟，68→62％流动相A，32→38％流动相B；36～46分钟，62→42％流动相A，38→58％流动相B；46～53分钟，42→32％流动相A，58→68％流动相B；53～65分钟，32→28％流动相A，68→72％流动相B；65～70分钟，28→25％流动相A，72→75％流动相B；70～75分钟，25→15％流动相A，75→85％流动相B。
7.根据权利要求1所述的一种脑脉利颗粒指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤S4生成的所述指纹图谱包括32个色谱共有峰，具体为：与没食子酸对应的1号峰、与原儿茶酸对应的4号峰、与新绿原酸对应的6号峰、与羟基红花黄色素A对应的7号峰、与芍药内酯苷对应的8号峰、与芍药苷对应的9号峰、与益母草碱对应的10号峰、与毛蕊异黄酮苷对应的11号峰、与金丝桃苷对应的12号峰、与芦丁对应的13号峰、与芍药新苷对应的14号峰、与丹酚酸B对应的S峰、与丹酚酸A对应的17号峰、与毛蕊异黄酮对应的18号峰、与芒柄花素对应的21号峰、与汉黄芩素对应的22号峰、与姜黄素对应的24号峰、与丹参酮I对应的26号峰、与隐丹参酮对应的28号峰、与丹参酮IIA对应的32号峰。
8.根据权利要求7所述的一种脑脉利颗粒指纹图谱的构建方法，其特征在于：特征峰以丹酚酸B色谱峰为参照，20个色谱峰的相对保留时间分别为0.134、0.236、、0.297、0.767、0.475、0.575、0.645、0.697、0.775、0.814、0.905、1.000、1.166、1.182、1.400、1.478、1.551、1.759、1.779、1.987。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的一种脑脉利颗粒指纹图谱的构建方法的应用，其特征在于：该脑脉利颗粒指纹图谱在脑脉利颗粒特征成分的质量监控的应用。
10.根据权利要求1-8任意一项所述的一种脑脉利颗粒指纹图谱的构建方法的应用，其特征在于：该脑脉利颗粒指纹图谱在脑脉利颗粒生产质量管控中的应用。
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