CN102993143B - 一种从丹参中快速分离紫草酸单体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从丹参中快速分离紫草酸单体的方法，属中药分离纯化技术领域。该方法按如下工艺步骤进行：A.原料提取：以30-40%的乙醇溶液回流提取3次，每次2小时；B.大孔树脂富集：提取液以2-5倍柱体积每小时的速度通过活化好的大孔吸附树脂柱进行吸附；C.水解：以氢氧化钠水溶液调pH11-12，放置20-30min水解；D.高效制备液相分离：色谱柱填料为C18，流动相为30-40%的乙腈溶液，检测波长286nm；E.产品回收：制备液浓缩至小体积水液冷冻干燥，得纯度98%以上紫草酸单体。本发明方法简易快速，溶剂消耗少，产量大，得率高，经济环保，适合工业化生产，具有较高的经济价值和学术价值。

Description

一种从丹参中快速分离紫草酸单体的方法

技术领域

本发明涉及一种中药化学单体的制备方法，尤其是一种从中药材丹参中快速分离高纯度紫草酸单体的方法，属中药分离纯化技术领域。

背景技术

丹参为唇形科（Lamiaceae）鼠尾草属（Salvia）植物丹参（ Salvia miltiorrhiza Bge.） 的干燥根及根茎。性味苦，微寒，归心、肝经。活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神。用于月经不调，心烦失眠。紫草酸（lithospermic acid），分子式为C₂₇H₂₂O₁₂，由于其在丹参中的含量很少，因此所需药材量大，分离时间较长，且很难获得其高纯度单体。

如CN200510122346.X公开了一种丹参有效组分，制剂及其制备方法与用途。在有效组分中，以重量百分比计，紫草酸的含量为2.8-4.2%，丹酚酸B的含量为91.8-94.2%，丹酚酸E的含量为0.8-2.2%。该丹参有效组分的制备方法包括下列步骤：将丹参药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加热提取得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品，即得。其紫草酸含量较低，增加了制备分离难度，得率低。

由此，目前国内关于紫草酸分离纯化的文献报道很少，高效制备液相色谱用于紫草酸单体的分离纯化属首次。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的缺陷，提供一种从丹参中快速分离高纯度紫草酸单体的方法。该方法简便易行、消耗溶剂少、得率高，产品纯度能够达到98%以上，安全无毒、环保，适合工业化生产。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种从丹参中快速分离紫草酸单体的方法，其特征在于按如下工艺步骤进行：

A. 原料提取：将丹参药材粉碎成2-4mm粗粉投入提取罐中，按照kg/L的质量体积比加入8-10倍量的体积分数为30-40%的乙醇溶液提取丹酚酸B，回流提取3次，每次2小时，合并提取液，浓缩回收乙醇，水溶液冷却至室温；

B. 大孔吸附树脂富集：将冷却至室温后的丹酚酸B水溶液以每小时2-5倍柱体积的速度通过活化好的大孔吸附树脂柱进行吸附，然后用2-4倍量柱体积的的水洗脱杂质，再用1-3倍量柱体积的体积分数为50-60%乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱液，浓缩回收乙醇，浓缩液待下一步水解处理；

C. 水解：向浓缩液中缓缓加入浓度3~5%的氢氧化钠水溶液调pH至11~12，静置20~30min，待丹酚酸B水解成紫草酸，然后再以体积分数5-10%的盐酸水溶液将水解液pH调至中性；

D. 高效制备液相分离：先用薄层硅胶过滤水解液，然后用孔径0.45μm的微孔滤膜过滤，上高效制备液相色谱柱分离，色谱柱填料为C18填料，流动相为体积分数30-40%的乙腈水溶液，检测波长286nm，紫外检测器在线监测，针对性收集目标化合物色谱峰段制备溶液；

所述流动相的流速根据色谱柱内径大小进行确定，内径50mm的流速为60ml/min，内径80mm 的流速为140ml/min，内径100mm的流速为250ml/min，内径200mm的流速为800ml/min。

E. 产品回收：将步骤D所得制备溶液减压回收乙腈，剩余水溶液-50℃冷冻成冰，然后-50℃冷冻干燥得紫草酸单体。

步骤B所述大孔吸附树脂选自D101型或AB-8型。

本发明的优点在于：

1、通过步骤A对所述丹参药材的粉碎、回流提取及浓缩，充分保证了药材中紫草酸和丹酚酸B等水溶性成分的有效提取。

2、通过步骤B以大孔吸附树脂在相应条件下富集丹酚酸B，确保了色素等杂质与丹酚酸B的有效分离，起到了很好的除杂作用。

3、通过步骤C在相应控制条件下对丹酚酸B进行水解，从而大幅度提高了紫草酸的含量，并为制备分离创造了有利条件。

4、采用制备型高效液相色谱系统对紫草酸单体进行分离，通过最适宜的前处理方法和色谱条件等，达到良好的分离效果，并且紫外检测器在线监测，针对性收集紫草酸单体，目标明确，避免了常规柱层析和先分离后检测造成的资源浪费。

5、采用制备型高效液相色谱分离过程直观，目标性强，对产品的质量易于控制，产品纯度可达到98%以上。

6、步骤少，耗时短，操作简便，得率高，工艺稳定可靠，重现性好，适合工业化生产。

7、溶剂消耗少，制备液相色谱分离步骤中的溶剂都可回收再利用。

8、溶剂毒性小，所用的有机溶剂乙腈、乙醇等，环境污染小。

9、由于高效液相色谱对样品溶液的纯度、色泽、酸碱度等要求均较高，通过提取水解等简单处理得到的提取液不能直接作为样品溶液进入高效液相色谱系统，因此若在进行高效液相色谱分离前，不按照本发明方法步骤进行提取、大孔吸附树脂富集、水解，则有可能达不到良好的分离效果，还可能对高效液相色谱系统的色谱柱等配件产生难以逆转的影响，缩短其使用周期；而色谱柱等液相色谱的相关配件成本通常较高，其使用周期的缩短显然将造成最终产品的生产成本大大提高；因而，对进入高效液相色谱的样品溶液要求较高，其前处理过程非常重要。

10、由于丹参药材中除含有丹酚酸外，还含有丹参酮、丹参素等非常复杂的成分，其中紫草酸单体成分含量较低，大部分以丹酚酸形式存在，要获得可直接进入高效液相色谱系统的样品，需要先进行提取、富集及水解处理。针对丹参药材中存在的各种成分的理化性质，本发明方法通过前述步骤A、B、C的顺序搭配，以及适当的参数组合，可有效提取出丹酚酸B，并将丹酚酸B水解转化为紫草酸，同时除去大量杂质，获得可以进入制备型高效液相色谱系统的样品溶液，不至对高效液相色谱系统造成很大的影响，尽量延长其使用周期，节约生产成本。

11、在高效液相色谱分离过程中，色谱条件的选择非常重要，它对样品溶液中各物质的出峰顺序、峰形、分离效果等起着决定性的作用；本发明通过大量的试验研究及对比分析，确定了如上所述的各色谱条件，使样品溶液中各物质的出峰时间、峰形、分离效果等最佳化，有利于紫草酸单体得到充分有效的分离。

附图说明

图1为本发明实施例1步骤C制备分离在线监测图谱

图2为本发明实施例1制得的紫草酸单体的HPLC分析图谱

具体实施方式

实施例1

一种从丹参中快速分离紫草酸的方法，按如下工艺步骤进行：

A. 原料提取：将10kg丹参粉碎成2-4mm粗粉投入提取罐中，加入90L体积分数为30%的乙醇溶液提取丹酚酸B，回流提取3次，每次2小时，合并提取液，浓缩回收乙醇，水溶液冷却至室温；

B. 大孔吸附树脂富集：将冷却至室温后的丹酚酸B水溶液以每小时4倍柱体积的速度通过活化好的D101型大孔吸附树脂柱进行吸附，树脂床体积约8L，然后用25L的水洗脱杂质，再用20L体积分数为60%的乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱液，浓缩至8L左右；

C. 水解：向浓缩液中缓缓加入浓度为3%的氢氧化钠水溶液调pH至12，静置20min，待丹酚酸B水解成紫草酸，然后再以体积分数5%的盐酸水溶液将水解液pH调至中性；

D. 高效制备液相分离：先用薄层硅胶过滤水解液，然后用孔径0.45μm的微孔滤膜过滤，上高效制备液相色谱柱分离，色谱柱填料为C18填料，流动相为体积分数40%的乙腈水溶液，检测波长286nm，紫外检测器在线监测，针对性收集目标化合物色谱峰段制备溶液； 

E. 产品回收：步骤D所得制备溶液减压回收乙腈，剩余水溶液-50℃冷冻成冰，然后--50℃冷冻干燥得紫草酸单体。

所得紫草酸单体重12g，经HPLC分析纯度为98.7%。

实施例2

一种从丹参中快速分离紫草酸的方法，按如下工艺步骤进行：

A. 原料提取：将20kg丹参粉碎成2-4mm粗粉投入提取罐中，加入180L体积分数为30%的乙醇溶液，回流提取3次，每次2小时，合并提取液，浓缩回收乙醇，水溶液冷却至室温；

B. 大孔吸附树脂富集：将冷却至室温后的丹酚酸B水溶液以每小时5倍柱体积的的速度通过活化好的AB-8型大孔吸附树脂柱进行吸附，树脂床体积约15L，然后用60L体积水洗脱杂质，再用40L体积分数为50%的乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱液，浓缩至15L左右；

C. 水解：向浓缩液中缓缓加入浓度为3%的氢氧化钠水溶液调pH至11，静置30min，待丹酚酸B水解成紫草酸，然后再以体积分数10%盐酸水溶液将水解液pH调至中性；

D. 高效制备液相分离：先用薄层硅胶过滤水解液，然后用孔径0.45μm的微孔滤膜过滤，上高效制备液相色谱柱分离，色谱柱填料为C18填料，流动相为体积分数30%的乙腈水溶液，检测波长286nm，紫外检测器在线监测，针对性收集目标化合物色谱峰段制备溶液； 

E. 产品回收：步骤D所得制备溶液减压回收乙腈，剩余水溶液-50℃冷冻成冰，然后-50℃冷冻干燥得紫草酸单体。

所得紫草酸单体重25g，经HPLC分析纯度为98.6%。

实施例3

一种从丹参中快速分离紫草酸的方法，按如下工艺步骤进行：

A. 原料提取：将30kg丹参粉碎成2-4mm粗粉投入提取罐中，加入300L体积分数为35%的乙醇溶液提取丹酚酸B，回流提取3次，每次2小时，合并提取液，浓缩回收乙醇，水溶液冷却至室温；

B. 大孔吸附树脂富集：将冷却至室温后的丹酚酸B水溶液以每小时2倍柱体积的的速度通过活化好的D101型大孔吸附树脂柱进行吸附，树脂床体积约25L，然后用50L的水洗脱杂质，再用25L体积分数为55%的乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱液，浓缩至8L左右；

C. 水解：向浓缩液中缓缓加入浓度为4%的氢氧化钠水溶液调pH至12，静置25min，待丹酚酸B水解成紫草酸，然后再以体积分数8%的盐酸水溶液将水解液pH调至中性；

D. 高效制备液相分离：先用薄层硅胶过滤水解液，然后用孔径0.45μm的微孔滤膜过滤，上高效制备液相色谱柱分离，色谱柱填料为C18填料，流动相为体积分数35%的乙腈水溶液，检测波长286nm，紫外检测器在线监测，针对性收集目标化合物色谱峰段制备溶液； 

E. 产品回收：步骤D所得制备溶液减压回收乙腈，剩余水溶液-50℃冷冻成冰，然后-50℃冷冻干燥得紫草酸单体。

所得紫草酸单体重37g，经HPLC分析纯度为98.5%。

Claims (4)

1.一种从丹参中快速分离紫草酸单体的方法，其特征在于按如下工艺步骤进行：

A. 原料提取：将丹参药材粉碎成2-4mm粗粉投入提取罐中，按照kg/L的质量体积比加入8-10倍量的体积分数为30-40%的乙醇溶液提取丹酚酸B，回流提取3次，每次2小时，合并提取液，浓缩回收乙醇，水溶液冷却至室温；

B. 大孔吸附树脂富集：将冷却至室温后的丹酚酸B水溶液以每小时2-5倍柱体积的速度通过活化好的大孔吸附树脂柱进行吸附，然后用2-4倍量柱体积的的水洗脱杂质，再用1-3倍量柱体积的体积分数为50-60%乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱液，浓缩回收乙醇，浓缩液待下一步水解处理；

C. 水解：向浓缩液中缓缓加入浓度3~5%的氢氧化钠水溶液调pH至11~12，静置20~30min，待丹酚酸B水解成紫草酸，然后再以体积分数5-10%的盐酸水溶液将水解液pH调至中性；

D. 高效制备液相分离：先用薄层硅胶过滤水解液，然后用孔径0.45μm的微孔滤膜过滤，上高效制备液相色谱柱分离，色谱柱填料为C18填料，流动相为体积分数30-40%的乙腈水溶液，检测波长286nm，紫外检测器在线监测，针对性收集目标化合物色谱峰段制备溶液；

E. 产品回收：将步骤D所得制备溶液减压回收乙腈，剩余水溶液-50℃冷冻成冰，然后-50℃冷冻干燥得紫草酸单体；

步骤B所述大孔吸附树脂选自D101型或AB-8型；

步骤B所述流动相的流速根据色谱柱内径大小进行确定，内径50mm的流速为60ml/min，内径80mm 的流速为140ml/min，内径100mm的流速为250ml/min，内径200mm的流速为800ml/min。

2.根据权利要求1所述的从丹参中快速分离紫草酸单体的方法，其特征在于按如下工艺步骤进行：

A. 原料提取：将10kg丹参粉碎成2-4mm粗粉投入提取罐中，加入90L体积分数为30%的乙醇溶液提取丹酚酸B，回流提取3次，每次2小时，合并提取液，浓缩回收乙醇，水溶液冷却至室温；

B. 大孔吸附树脂富集：将冷却至室温后的丹酚酸B水溶液以每小时4倍柱体积的速度通过活化好的D101型大孔吸附树脂柱进行吸附，树脂床体积8L，然后用25L的水洗脱杂质，再用20L体积分数为60%的乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱液，浓缩至8L左右；

C. 水解：向浓缩液中缓缓加入浓度为3%的氢氧化钠水溶液调pH至12，静置20min，待丹酚酸B水解成紫草酸，然后再以体积分数5%的盐酸水溶液将水解液pH调至中性；

D. 高效制备液相分离：先用薄层硅胶过滤水解液，然后用孔径0.45μm的微孔滤膜过滤，上高效制备液相色谱柱分离，色谱柱填料为C18填料，流动相为体积分数40%的乙腈水溶液，检测波长286nm，紫外检测器在线监测，针对性收集目标化合物色谱峰段制备溶液； 

E. 产品回收：步骤D所得制备溶液减压回收乙腈，剩余水溶液-50℃冷冻成冰，然后-50℃冷冻干燥得紫草酸单体；

所得紫草酸单体重12g，经HPLC分析纯度为98.7%。

3.根据权利要求1所述的从丹参中快速分离紫草酸单体的方法，其特征在于按如下工艺步骤进行：

A. 原料提取：将20kg丹参粉碎成2-4mm粗粉投入提取罐中，加入180L体积分数为30%的乙醇溶液，回流提取3次，每次2小时，合并提取液，浓缩回收乙醇，水溶液冷却至室温；

B. 大孔吸附树脂富集：将冷却至室温后的丹酚酸B水溶液以每小时5倍柱体积的的速度通过活化好的AB-8型大孔吸附树脂柱进行吸附，树脂床体积15L，然后用60L体积水洗脱杂质，再用40L体积分数为50%的乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱液，浓缩至15L左右；

C. 水解：向浓缩液中缓缓加入浓度为3%的氢氧化钠水溶液调pH至11，静置30min，待丹酚酸B水解成紫草酸，然后再以体积分数10%盐酸水溶液将水解液pH调至中性；

D. 高效制备液相分离：先用薄层硅胶过滤水解液，然后用孔径0.45μm的微孔滤膜过滤，上高效制备液相色谱柱分离，色谱柱填料为C18填料，流动相为体积分数30%的乙腈水溶液，检测波长286nm，紫外检测器在线监测，针对性收集目标化合物色谱峰段制备溶液； 

E. 产品回收：步骤D所得制备溶液减压回收乙腈，剩余水溶液-50℃冷冻成冰，然后-50℃冷冻干燥得紫草酸单体；

所得紫草酸单体重25g，经HPLC分析纯度为98.6%。

4.根据权利要求1所述的从丹参中快速分离紫草酸单体的方法，其特征在于按如下工艺步骤进行：

A. 原料提取：将30kg丹参粉碎成2-4mm粗粉投入提取罐中，加入300L体积分数为35%的乙醇溶液提取丹酚酸B，回流提取3次，每次2小时，合并提取液，浓缩回收乙醇，水溶液冷却至室温；

B. 大孔吸附树脂富集：将冷却至室温后的丹酚酸B水溶液以每小时2倍柱体积的的速度通过活化好的D101型大孔吸附树脂柱进行吸附，树脂床体积25L，然后用50L的水洗脱杂质，再用25L体积分数为55%的乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱液，浓缩至8L左右；

C. 水解：向浓缩液中缓缓加入浓度为4%的氢氧化钠水溶液调pH至12，静置25min，待丹酚酸B水解成紫草酸，然后再以体积分数8%的盐酸水溶液将水解液pH调至中性；

D. 高效制备液相分离：先用薄层硅胶过滤水解液，然后用孔径0.45μm的微孔滤膜过滤，上高效制备液相色谱柱分离，色谱柱填料为C18填料，流动相为体积分数35%的乙腈水溶液，检测波长286nm，紫外检测器在线监测，针对性收集目标化合物色谱峰段制备溶液； 

E. 产品回收：步骤D所得制备溶液减压回收乙腈，剩余水溶液-50℃冷冻成冰，然后-50℃冷冻干燥得紫草酸单体；

所得紫草酸单体重37g，经HPLC分析纯度为98.5%。