CN113943332B - 一种利用动态轴向压缩色谱制备高纯度芍药内酯苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于天然产物提取及深加工领域，具体涉及一种利用动态轴向压缩色谱制备高纯度芍药内酯苷的方法。将通过SPE柱富集获得芍药内酯苷粗品经浓度为1wt％‑99wt％的有机溶液溶解并配制成固含量1mg/mL‑1g/mL的溶液，使用动态轴向压缩色谱制备系统，在有机溶液条件下分离纯化、浓缩，得到99％以上的高纯度芍药内酯苷。与传统工艺相比，动态轴向压缩色谱系统操作简单，生产周期短，过程可监测，重复性好，使用流动相均可回收使用，大大减少了传统提取方法过程中产生的工业废水，降低了后期废水处理成本，避免了传统提取后期重结晶纯化的需要，工艺绿色环保无毒无害。本方法可以制备得到纯度大于98％的芍药内酯苷，可用于工业化生产。

Description

一种利用动态轴向压缩色谱制备高纯度芍药内酯苷的方法

技术领域

本发明属于天然产物提取及深加工领域，具体涉及一种利用动态轴向压缩色谱制备高纯度芍药内酯苷的方法。

背景技术

芍药内酯苷(Albiflorin)，分子式C23H28O11，分子量480.46，白色无定型粉末，易吸湿。白芍中含有的主要药用成分为单萜及其苷类化合物，称为白芍总苷(TGP)，包括芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药苷元酮等数十种成分，其中又以芍药苷、苯甲酰芍药苷和芍药内酯苷为主要有效成分，芍药内酯苷的结构如下所示，

芍药内酯苷药理作用广泛：(1)具有镇痛、抗惊厥作用；(2)对机体免疫系统具有双向调节作用，可促进巨噬细胞的吞噬功能；(3)对平滑肌收缩有抑制作用，对支气管和子宫平滑肌收缩也有一定的解痉作用；(4)一定的抗炎作用；(5)抗菌作用较强，并具有较广的抗菌范围，对多种细菌都表现出不同程度的抑制作用；(6)护肝解毒作用。

白芍的应用比较广泛，中药中多以药物对方式应用，例如柴胡-白芍对、黄芩-白芍对、白术-白芍对、桂枝-白芍对、枳实-白芍对、当归-白芍对等，具有多种的药理作用。白芍历史悠久，是国内需求量较大的中药材之一，每年国内市场约需要1万吨左右白芍，其中饮片年需求大约4000吨。从市场情况分析可见，白芍具有巨大的市场空间，但白芍的应用还处在中药材的最初级阶段，即使目前大规模工业生产提取的白芍粗粉，不仅其中的有效成分低，使用的提取工艺路线也多以水提取技术为主，在提取有效成分过程中，还会提取出大量的其他物质，所以产品的经济价值较低。因此开发一种适合工业化生产高纯度白芍提取物单体芍药内酯苷的方法意义重大。

专利CN101062128B公开了一种从中药白芍或赤芍中提取得到的芍药总苷提取物及其制备方法。采用大孔吸附树脂法制得的芍药总苷提取物，该提取物主要包括芍药苷、芍药内酯苷、芍药新苷、芍药内酯A、B、C、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷及其衍生物等。专利CN102492005B公开了一种芍药苷和白芍苷的制备方法。采用乙醇提取药材，上大孔树脂吸附洗脱，所得物质上硅胶柱，得到纯度大于90％的芍药苷和白芍苷样品。专利CN105273015B公开了一种高纯度芍药苷和白芍苷的制备方法。采用大孔吸附树脂法制得的粗提物，在使用高速逆流色谱分离得到芍药苷和白芍苷。

目前大孔树脂分离技术在天然产物的提取分离中应用广泛，大孔树脂比较传统普通硅胶分离方法实现了可重复利用，大大减少了废固的产生。但使用大孔树脂不能有效分离芍药苷和芍药内酯苷，如专利CN101062128B所述，只能得到白芍总苷；并且大孔树脂在使用一段时间后由于本身分离的性质，需要定期进行活化从而保证其正常使用，而活化过程需要使用大量的强酸、强碱溶液进行反复浸泡洗脱，制造了大量的废酸、废碱，最后还需要使用大量的清水将树脂洗至中性，浪费了大量的水资源，存在比较严重的环保问题。同时，制备色谱根据技术难度分为常压、中低压、高压制备色谱三种，中压色谱一般压力在1-2MPa，缺点是中低压色谱柱理论塔板数通常较低，对难分离的物质，无法实现高纯度的分离效果，这也是为什么目前检测技术通常使用高效液相色谱。而且中低压色谱柱最大直径在100mm左右，在工业生产制备中无法解决大直径色谱柱装柱不均匀，柱壁密度高于中心密度，容易发生柱体塌陷，影响样品分离效果，无法稳定重现的问题。

而且目前，芍药内酯苷产品使用传统分离方法最高只能得到纯度在80％左右的产品，急需一种可以工业化的成熟技术替代传统工艺路线，提高芍药内酯苷产品品质。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用动态轴向压缩色谱制备高纯度芍药内酯苷的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种利用动态轴向压缩色谱制备高纯度芍药内酯苷的方法，将通过SPE柱富集获得芍药内酯苷粗品经浓度为1wt％-99wt％的有机溶液溶解并配制成固含量1mg/mL-1g/mL的溶液，使用动态轴向压缩色谱制备系统，在有机溶液条件下分离纯化、浓缩，得到99％以上的高纯度芍药内酯苷。

所述动态轴向压缩色谱制备系统中色谱填料为C18反相硅胶填料，色谱柱内径10-1200mm，流速1-3000ml/min，流动相为有机溶液，其中，有机溶液的浓度为10wt％-90wt％。

所述通过SPE柱富集获得芍药内酯苷粗品为将白芍提取物经有机溶液配置成固含量为1mg/mL-1g/mL的溶液作为溶解样品，所得溶液经SPE柱富集，收集洗脱液经浓缩、干燥得到芍药内酯苷粗品。

所述SPE柱中填料为粒度范围为5μm-100μm的HLB。

所述SPE柱经其5-20倍体积的溶剂活化平衡，平衡后，将溶解样品上至SPE柱，使用柱子5-20倍体积的溶剂淋洗；淋洗后经洗脱液进行洗脱收集洗脱液即为粗品。

所述溶解白芍提取物的有机溶液、SPE柱中的活化平衡溶剂、并配置为溶解样品的溶剂和淋洗溶剂和动态轴向压缩中流动相可相同或不同的选自浓度为10％-100％的乙腈水溶液、浓度为10％-100％的乙醇水溶液、浓度为10％-100％的甲醇水溶液或纯净水。

所述SPE柱中的活化平衡溶剂、淋洗溶剂为10％-100％的乙腈水溶液、10％-100％的乙醇水溶液或10％-100％的甲醇水溶液。

所述动态轴向压缩中流动相经回收套用。

本发明的有益效果：

(1)本发明将动态轴向压缩技术应用至提取芍药内酯苷中，将经过提取富集后芍药内酯苷浸膏样品经过筛选后的SPE柱，快速分离出含量在70％以上的芍药内酯苷粗品，再经过动态轴向压缩色谱柱分离，进而获得纯度可达99％的芍药内酯苷产品，有效提高产品的纯度。

(2)本发明不仅在填料方面可反复重复使用，节省了填料活化的步骤，去除工业废酸、废碱水的后期处理，而且使用的流动相溶剂还可以通过蒸馏回收套用，降低了分离工艺的成本。

(3)使用本技术分离得到的产品无需传统工艺反复结晶纯化，即可得到高纯度产品，节省了工艺时间。

(4)本发明采用的动态轴向压缩色谱柱最大柱直径可以到达1200mm，远远超过中低压色谱可以到达的色谱柱规格(常用中压色谱柱直径最大在100mm左右)，可以实现吨级样品的高效分离，可以实现高效液相色谱制备在工业生产上的应用，且分离工艺绿色环保，生产周期短，分离稳定性好，利于实现产品生产工业化。

(5)本发明通过筛选后的SPE柱富集芍药内酯苷样品，可以快速分离出纯度相对较高的芍药内酯苷粗品，单次分离时间在30分钟到几小时即可完成，大大缩短了传统工艺从浸膏到粗产品的工艺用时，其是动态轴向压缩柱分离的最有效前处理方式，将两种方式结合获得纯度可达99％的芍药内酯苷产品，有效提高产品的纯度。

附图说明

图1为本发明是实例1提供的采用本发明方法提取获得高纯度芍药内酯苷的提取HPLC检测图谱。

图2为本发明是实例1提供的采用本发明方法提取获得芍药内酯苷产品HPLC-MS阳离子图谱.

图3为本发明是实例1提供的采用本发明方法提取获得芍药内酯苷产品HPLC-MS阴离子图谱。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，这些实施例是本发明的阐释和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。

本发明方法可用于工业化生产的制备高纯度芍药内酯苷，与传统工艺相比，动态轴向压缩色谱系统操作简单，生产周期短，过程可监测，重复性好，使用流动相均可回收使用，大大减少了传统提取方法过程中产生的工业废水，降低了后期废水处理成本，避免了传统提取后期重结晶纯化的需要，工艺绿色环保无毒无害，所制备得到纯度大于99％的芍药内酯苷。

下述各实施例中白芍提取物的获得具体方式如下：

取芍药干燥根切片20kg，加入50L提取罐中，加入20L乙醇水溶液，回流提取1小时。过滤除去药渣，得到的白芍提取液经过减压蒸馏回收大部分乙醇溶剂，喷雾干燥器干燥成粉。得到白芍提取物样品，经过HPLC检测，样品中芍药总苷含量约40％。回收乙醇溶剂可以继续套用与下次提取。

实施例1

高纯度芍药内酯苷的提取：

(1)取100克芍药总苷含量40％的白芍提取物，加入40wt％甲醇溶液溶解，并利用40wt％甲醇溶液配制成含白芍提取物浓度为0.1g/mL的溶液。使用柱子10倍体积40wt％甲醇溶液活化平衡SPE柱，SPE柱中填料为HLB，填料粒度为40μm。平衡后，将溶解好的样品上至SPE柱，使用柱子5倍体积40wt％甲醇溶液淋洗；

(2)使用55％的甲醇溶液作为流动相对其进行洗脱，收集所有洗脱组份，收集到的洗脱组分经减压蒸馏、干燥，得到芍药内酯苷粗品，称重约35.7g；

(3)步骤(2)中得到的芍药内酯苷粗品用体积浓度35％的甲醇水溶液溶解并配制成固含量0.01g/mL的溶液，使用动态轴向压缩色谱制备系统，在甲醇-水条件下分离纯化。采用的制备条件为：C18反相填料，动态轴向压缩制备柱内径200mm，上样体积3500ml,流动相45％甲醇水溶液，流速800ml/min，柱温25-30℃。样品经过浓缩后，得到芍药内酯苷，HPLC检测含量99.91％(参见图1和2)。

由图1、图2、图3可见，产品HPLC检测含量为99.91％，HPLC-MS阴、阳离子谱图分子量与芍药内酯苷分子量一致，结构确认。

实施例2

高纯度芍药内酯苷的提取：

(1)取100克芍药总苷含量40％的白芍提取物，加入50v％乙腈溶液溶解，并利用50v％乙腈溶液配制成含白芍提取物浓度为0.1g/mL的溶液。使用柱子10倍体积50v％乙腈溶液活化平衡SPE柱，SPE柱中填料为HLB，填料粒度为40μm。平衡后，将溶解好的样品上至SPE柱，使用柱子10倍体积50v％乙腈溶液淋洗；

(2)使用60％的乙腈溶液作为流动相对其进行洗脱，收集所有洗脱组份，收集到的洗脱组分经减压蒸馏、干燥，得到芍药内酯苷粗品，称重约32.3g；

(3)步骤(2)中得到的芍药内酯苷粗品用体积浓度35％的乙腈水溶液溶解并配制成固含量0.01g/mL的溶液，使用动态轴向压缩色谱制备系统，在乙腈-水条件下分离纯化。采用的制备条件为：C18反相填料，动态轴向压缩制备柱内径200mm，上样体积3500ml,流动相45％乙腈水溶液，流速800ml/min，柱温25-30℃。样品经过浓缩后，得到芍药内酯苷，HPLC检测含量99.74％。

实施例3

高纯度芍药内酯苷提取方法：

(1)取200克芍药总苷含量40％的白芍提取物，加入50％乙醇溶液溶解，并配制成0.1g/mL的溶液。使用10倍体积50％乙醇溶液活化平衡SPE柱，SPE柱中填料为HLB，填料粒度为20μm。平衡后，将溶解好的样品上至SPE柱，使用10倍体积50％乙醇溶液淋洗；

(2)使用60％的乙醇溶液作为流动相对其进行洗脱，收集洗脱组份，收集到的层析液经减压蒸馏、干燥，得到芍药内酯苷粗品，称重约70.35g；

(3)步骤(2)中得到的芍药内酯苷粗品用体积浓度35％的乙醇水溶液溶解并配制成固含量0.01g/mL的溶液，使用动态轴向压缩色谱制备系统，在乙醇-水条件下分离纯化。采用的制备条件为：C18反相填料，动态轴向压缩制备柱内径300mm，上样体积7000ml,流动相45％乙醇溶液，流速800ml/min，柱温25-30℃。样品经过浓缩后，得到芍药内酯苷，HPLC检测含量99.83％。

实施例4

放大平行实验数据

使用经过SPE处理得到的芍药内酯苷粗品为原料，设备动态轴向压缩制备柱内直径800mm，填料为C18反相填料，单次上样粗品质量分别为578.21g、567.78g、571.53g，平行试验分离条件为参照实施例3。

分离样品HPLC检测结果参见下表：

	上样质量	产品HPLC检测结果
			放大平行实验一	578.21g	99.78％
放大平行实验二	567.78g	99.81％
			放大平行实验三	571.53g	99.74％

实施例5

对上述实施例1-3动态轴向压缩中采用的流动相进行溶剂回收：

	共沸点	比例	压力
				乙醇回收	78摄氏度	94.5％	101.325kPa
甲醇回收	——	>90％	101.325kPa
				乙腈回收	76摄氏度	85.8％	101.325kPa

备注：回收溶剂可以重新配置后继续使用。

对比例

取上述获得40克芍药总苷含量40％的白芍提取物，用体积浓度35％的甲醇水溶液溶解并配制成固含量0.01g/mL的溶液，过0.44μm滤膜后，使用动态轴向压缩色谱制备系统，在甲醇-水条件下分离纯化。采用的制备条件为：C18反相填料，动态轴向压缩制备柱内径200mm，上样体积3500ml,流动相45％甲醇水溶液，流速800ml/min，柱温25-30℃。样品经过浓缩后，得到黄色芍药内酯苷样品。HPLC检测含量63.17％。其他杂质较多无法一一分辨。

Claims (3)

1.一种利用动态轴向压缩色谱制备高纯度芍药内酯苷的方法，其特征在于：通过SPE柱富集获得芍药内酯苷粗品，经浓度为1wt%-99wt%的有机溶液溶解并配制成固含量1mg/mL-1g/mL的溶液，使用动态轴向压缩色谱制备系统，在有机溶液条件下分离纯化、浓缩，得到99%以上的高纯度芍药内酯苷；

所述动态轴向压缩色谱制备系统中色谱填料为C18反相硅胶填料，色谱柱内径10-1200mm，流速1-3000ml/min，流动相为有机溶液，其中，有机溶液的浓度为10wt%-90 wt %；

所述通过SPE柱富集获得芍药内酯苷粗品为将白芍提取物经有机溶液配置成固含量为1mg/mL-1g/mL的溶液作为溶解样品，所得溶液经SPE柱富集，收集洗脱液经浓缩、干燥得到芍药内酯苷粗品；

所述SPE柱中填料为粒度范围为5μm-100μm的HLB；

所述SPE柱经其5-20倍体积的溶剂活化平衡，平衡后，将溶解样品上至SPE柱，使用柱子5-20倍体积的溶剂淋洗；淋洗后经洗脱液进行洗脱收集洗脱液即为粗品；

所述溶解白芍提取物的有机溶液、SPE柱中的活化平衡溶剂、并配置为溶解样品的溶剂和淋洗溶剂和动态轴向压缩中流动相可相同或不同的选自浓度为10%-100%的乙腈水溶液、浓度为10%-100%的乙醇水溶液、浓度为10%-100%的甲醇水溶液或纯净水。

2.按权利要求1所述的利用动态轴向压缩色谱制备高纯度芍药内酯苷的方法，其特征在于：所述SPE柱中的活化平衡溶剂、淋洗溶剂为10%-100%的乙腈水溶液、10%-100%的乙醇水溶液或10%-100%的甲醇水溶液。

3.按权利要求2所述的利用动态轴向压缩色谱制备高纯度芍药内酯苷的方法，其特征在于：所述动态轴向压缩中流动相经回收套用。