CN101375841B

CN101375841B - 胡萝卜烷型倍半萜及其制备方法和用途

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Publication number: CN101375841B
Application number: CN2007100453069A
Authority: CN
Inventors: 陈道峰; 马文辉; 周佩; 黄海
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2007-08-27
Filing date: 2007-08-27
Publication date: 2010-11-10
Anticipated expiration: 2027-08-27
Also published as: CN101375841A

Abstract

本发明属中药制药领域，涉及胡萝卜烷型倍半萜及其制备方法和在制备抗乙肝病毒药物中的新用途。本发明从五味子属Schisandra植物鹤庆五味子S.wilsoniana中提取胡萝卜烷型倍半萜并证实其抗HBV病毒活性。所述的化合物经与阳性对照拉米呋啶药理试验比较，结果证实具有显著的抗HBV作用，且有效浓度低，细胞毒性较小，本发明所述的胡萝卜烷型倍半萜化合物可作为活性成分制备治疗乙型肝炎的药物。

Description

胡萝卜烷型倍半萜及其制备方法和用途

技术领域

本发明属中药制药领域，涉及胡萝卜烷型倍半萜新化合物及其制备方法和在制备抗乙肝病毒药物中的用途。

背景技术

据有关统计显示，全世界大约有3亿多人为慢性乙肝病毒(HBV)携带者，我国约占半数。乙肝病毒感染已成为全球性的影响人类健康的主要疾病之一，由于HBV感染可以导致慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌，因此成为影响人类寿命的九大疾病之一。由于慢性HBV感染者较非携带者发生肝癌的相对危险率为217，因此在全世界每年大约有200万人死于乙肝引起的肝硬化和肝癌，而我国又是乙型肝炎的高发区，每年约有25万人死于与乙肝相关的慢性肝病(肝硬化与肝癌)。上述疾病给人民健康和国民经济带来巨大损失。因此，寻求高效低毒的抗HBV药物已成为刻不容缓的问题。

药物化学工作者在筛选抗HBV药物的过程中进行了不懈的努力，但到目前为止能治愈HBV感染的特效药还在寻找。临床上已获得FDA正式批准使用的α-干扰素和核苷类药物拉米呋啶只能在某种程度上获得治疗效果，对大多数病人还达不到治愈的目的，停止治疗后的“反跳”现象是医药工作者最感棘手的问题，所以开发研制高效、低毒、不“反跳”的抗HBV新药向药物化学工作者提出了挑战。在筛选抗HBV新药的过程中，越来越多的药物化学工作者把注意力转向了植物来源丰富，价廉易得，毒副作用小，分子结构复杂多样的天然化合物。

鹤庆五味子Schisandra wilsoniana为我国特有药用植物，属于五味子科(Schisandrance)五味子属(Schisandra)，分布于云南，其果实在民间一直作为五味子(Fructus Schisandra)的代用品，具有收敛固涩，益气养津，补肾宁心的功效，主治久咳虚喘，梦遗滑精、遗尿、尿频、自汗、盗汗、神经衰弱、肝炎等。目前有关五味子科植物抗HBV的研究主要集中在木脂素和三萜类成分上。

发明内容

本发明的目的是提供胡萝卜烷型倍半萜新化合物及其制备方法和在制备抗乙肝病毒药物中的用途。

本发明所述的胡萝卜烷型倍半萜新化合物优选鹤庆五味子烯甲、鹤庆五味子烯乙和鹤庆五味子烯丙。

本发明应用现代药理筛选方法，从五味子科五味子属(Schisandra)植物鹤庆五味子(S.wilsoniana)中提取得到胡萝卜烷型倍半萜新化合物：鹤庆五味子烯甲、鹤庆五味子烯乙和鹤庆五味子烯丙，并证实其抗HBV病毒活性。

本发明所述的活性胡萝卜烷型倍半萜化合物具有如下式I的化学结构：

其中各取代基及化合物1-3的情况如表1所示：

表1

本发明的化合物通过下述方法制备：

采用我国云南特有药用植物鹤庆五味子S.wilsoniana的干燥果实。取鹤庆五味子果实8kg，95％乙醇冷浸，提取物浓缩后用乙醚萃取，共得400克，取200克干法上样进行硅胶柱层析，以石油醚-丙酮梯度洗脱，所得流份以不同洗脱剂进行反复硅胶柱层析，分离得到鹤庆五味子烯甲(1)、鹤庆五味子烯乙(2)和鹤庆五味子烯丙(3)。

所述的化合物鹤庆五味烯甲schisanwilsonene A，无色方晶，熔点：165-168℃；分子式：C₁₅H₂₆O₂，分子量238；

IR(KBr)υ_max(cm^-1)：3315，2941，2915，2360，2341，1456，1377，1152，1057，1002，945，868，1668；¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)δppm：1.32(1H，m，H-1)，1.47(1H，m，H-1)，1.47(1H，m，H-2)，1.73(1H，m，H-2)，2.31(1H，m，H-3)，1.83(1H，m，H-4)，1.22(1H，m，H-6)，1.76(1H，m，H-6)，2.05(1H，m，H-7)，2.25(1H，m，H-7)，5.78(1H，d，J＝8.6Hz，H-9)，2.21(1H，m，H-10)，2.88(1H，m，H-10)，3.93(2H，s，H-11)，0.88(3H，s，Me(13))，1.23(3H，s，Me(14))，1.21(3H，s，Me(15))；¹³C-NMR(CDCl₃，100MHz)δppm：42.0(1)，27.4(2)，53.2(3)，50.3(4)，44.6(5)，41.1(6)，26.0(7)，140.7(8)，127.5(9)，26.5(10)，70.6(11)，74.4(12)，17.7(13)，27.1(14)，32.5(15)；ESI-MS m/z：203(100)，221(18)，405(3)，441(7)；HR-ESI-MS m/z：261.1829([M+Na]⁺，C₁₅H₂₆O₂Na⁺；calc.261.1825)。晶体数据：供试样品为无色透明块状结晶，实验用晶体大小为0.15×0.10×0.06mm，空间群为P2(1)2(1)2(1)。晶胞参数：a＝11.605(7)

，b＝12.335(7)

，c＝20.051(11)

，α＝90°，β＝90°，γ＝90°，晶胞体积晶胞内分子数Z＝8，计算密度Dχ＝1.103Mg/m³，MoKα射线(λ＝0.71073

)，F(000)＝1056，T＝293K。

所述的化合物鹤庆五味烯乙schisanwilsonene B，白色粉末，分子式：C₁₇H₂₈O₃，分子量280；

；IR(KBr)υ_max(cm^-1)：3446，2925，2853，2359，2340，1734，1717，1375，1233，1045；¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)δppm：1.32(1H，m，H-1)，1.45(1H，m，H-1)，1.42(1H，m，H-2)，1.71(1H，m，H-2)，2.31(1H，m，H-3)，1.86(1H，m，H-4)，1.26(1H，m，H-6)，1.74(1H，m，H-6)，1.98(1H，m，H-7)，2.22(1H，m，H-7)，5.83(1H，d，J＝8.6Hz，H-9)，2.20(1H，m，H-10)，2.89(1H，m，H-10)，4.40(2H，s，H-11)，0.89(3H，s，Me(13))，1.23(3H，s，Me(14))，1.21(3H，s，Me(15))，2.06(3H，s，OAc)；¹³C-NMR(CDCl₃，100MHz)δppm：42.0(1)，27.4(2)，53.2(3)，50.1(4)，44.5(5)，41.0(6)，26.3(7)，135.8(8)，131.0(9)，26.7(10)，72.0(11)，74.3(12)，17.7(13)，27.1(14)，32.5(15)，171.1，21.1(OAc)；EI-MS m/z：43(100)，159(84)，91(69)，59(67)，105(57)，41(43)，79(42)，119(41)；HR-EI-MSm/z：280.2043([M]⁺，C₁₇H₂₈O₃ ⁺；calc.280.2038)。

所述的化合物鹤庆五味烯丙schisanwilsonene C，白色粉末，分子式：C₁₅H₂₄O₂，分子量236；

(c＝0.02，MeOH)；IR(KBr)υ_max(cm^-1)：3441，2942，2853，2696，2369，1684，1635，1379，1134，950；¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)δppm：1.35(1H，m，H-1)，1.50(1H，m，H-1)，1.41(1H，m，H-2)，1.72(1H，m，H-2)，2.36(1H，m，H-3)，1.88(1H，m，H-4)，1.16(1H，m，H-6)，1.81(1H，m，H-6)，2.01(1H，m，H-7)，2.75(1H，m，H-7)，6.80(1H，d，J＝8.6Hz，H-9)，2.50(1H，m，H-10)，3.36(1H，m，H-10)，9.30(1H，s，H-11)，0.89(3H，s，Me(13))，1.26(3H，s，Me(14))，1.24(3H，s，Me(15))；¹³C-NMR(CDCl₃，100MHz)δppm：42.1(1)，27.2(2)，52.9(3)，49.3(4)，44.5(5)，41.9(6)，20.2(7)，144.7(8)，157.0(9)，28.3(10)，196.1(11)，74.3(12)，17.7(13)，26.9(14)，33.0(15)；ESI-MS m/z：219(100)，237(5)，495(13)，259(14)；HR-ESI-MS m/z：259.1667([M+Na]⁺，C₁₇H₂₈O₂Na⁺；calc.259.1669)。

本发明所述的胡萝卜烷型倍半萜经药理试验，结果证明具有显著的抗HBsAg作用，且有效浓度低，细胞毒性较小(表3)。鹤庆五味子烯甲在100μg/mL时对HBsAg的抑制率为54.7％，显著高于阳性对照拉米呋啶(200μg/mL时抑制率为28.6％)；鹤庆五味子烯乙在100μg/mL时对HBsAg表现出较强的抑制作用，抑制率为58.6％；鹤庆五味子烯丙在200μg/mL时对HBsAg的抑制率和阳性对照相当，抑制率为28.3％。

本发明首次从鹤庆五味子植物中分离到胡萝卜烷型倍半萜，并首次发现该类型的化合物具有较好的抗HBV活性。本发明所述的胡萝卜烷型倍半萜化合物可作为活性成分制备用于治疗乙型肝炎的药物。

附图说明：

图1是鹤庆五味子烯甲、鹤庆五味子烯乙和鹤庆五味子烯丙的提取分离工艺流程图。

其中：A：甲醇-水 B：石油醚-乙酸乙酯 C：石油醚-丙酮。

具体实施方式

实施例1制备鹤庆五味子烯甲-丙

鹤庆五味子果实8kg，95％乙醇浸泡，提取物浓缩后用乙醚萃取，共得400克(提取率5％)，取200克干法上样进行硅胶柱层析，以石油醚-丙酮梯度洗脱。石油醚-丙酮(20:1)的流份，经MCI柱(甲醇-水(4:1))除去色素，经石油醚-丙酮(20:1)反复硅胶柱洗脱，后经制备TLC方法(石油醚-乙酸乙酯(10:1))，得到鹤庆味子烯乙(2)；石油醚-丙酮(10:1)的流份，经MCI柱(甲醇-水(4:1))除去色素，经石油醚-丙酮(10:1)反复硅胶柱洗脱，后经制备TLC方法(石油醚-乙酸乙酯(6:1))，得到鹤庆味子烯丙(3)；石油醚-丙酮(3:1)的流份，经C18反相柱(甲醇-水(6:4))洗脱，得到粗晶，经石油醚-丙酮(6:1))溶剂中重结晶，得到鹤庆味子烯甲(1)。

实施例2体外抗HBV实验

应用Hep G2的2.2.15细胞株(教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海)，以每孔10×10⁵个细胞接种于24孔板，培养基为DMEM，生长液含10％胎牛血清，380μg/ml G418，0.03％谷胺酰胺，青霉素、链霉素各100μg/ml，在5％CO₂孵箱中37℃培养，48小时后，换成二甲基亚砜助溶的含药物的培养液，每种药物设3～5个浓度，每个浓度设4个平行孔，继续培养9天(每3天换液一次)，收集上清液用ELISA检测HBsAg及HBeAg含量。同样条件下以不含药物的培养液上清液作为对照组。同时用上述细胞株，用MTT法测定药物的细胞毒性。阳性对照为拉米呋啶(3TC)。结果证实本发明化合物具有显著的抗HBV作用，且有效浓度低，细胞毒性较小。

表3是鹤庆五味子烯甲、鹤庆五味子烯乙和鹤庆五味子烯丙对HepG22.2.15细胞的毒性情况及对HBsAg和HBeAg的抑制效果。

表3

-：“未见明显毒性”系指用MTT法检测细胞存活率≥75％；+：“显示毒性”指细胞存活率<75％；/：没有进行抑制率测试。

Claims

1.式I结构的胡萝卜烷型倍半萜在制备抗乙肝病毒药物中的用途，

其中各取代基及化合物1-3如下表所示：

2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的胡萝卜烷型倍半萜通过下述方法制备，

采用植物药鹤庆五味子S.wilsoniana的干燥果实，95％乙醇冷浸，提取物浓缩后用乙醚萃取，取200克干法上样进行硅胶柱层析，以石油醚-丙酮梯度洗脱，所得流份以不同洗脱剂进行反复硅胶柱层析，分离得到鹤庆五味子烯甲(1)、鹤庆五味子烯乙(2)和鹤庆五味子烯丙(3)。