CN102552285B - 甘五酸在制备防治肝炎病毒药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了甘五酸在制备防治肝炎病毒药物中的应用，所述的甘五酸为四环三萜类化合物。本发明还提供甘五酸在制备保肝的食品和保健品中的应用。本发明优点在于：本发明为四环三萜类化合物甘五酸提供一种制备抗乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）药物的用途，试验结果发现，该化合物具有显著的抗HBV和抗HCV活性，尤其能抑制HCV入侵靶细胞，可用于制备抗乙肝病毒和抗丙肝病毒的药物。本发明为寻找抗乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒药物提供了新的来源。

Description

甘五酸在制备防治肝炎病毒药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种化合物的用途，具体地说，是甘五酸在制备防治肝炎病毒药物中的应用。

背景技术

甘五酸的化学结构如下：

。

甘五酸（schizandronic acid, ganwuweizic acid）是华中五味子( Schisandra sphenanthera Rehd.et. )和北五味子（Schisandra chinensis）等果实中分离得到的四环三萜类化合物（详见：都姣娇，穆淑珍。华中五味子化学成分研究，首都医药，2011；18（18）：52-54；Li, L. N. and Xue, H., Planta Med., 1986；52，492－493；王丽薇，周长新，Bernd，等。北五味子化学成分研究，中国现代应用药学2006；23（5）：363-365）。

中国专利公开号CN1327859C公开了一种五味子提取物和制备方法及其用途，涉及一种含至少50%总木脂素的五味子提取物，其制备方法，以及该提取物在制备治疗肝炎、神经衰弱、抗衰老等药物中的应用。中国专利公开号CN101057887A公开了一种北五味子藤茎或藤茎皮提取物及其制备方法，以及该提取物在制备治疗神经衰弱、胃肠炎或溃疡、肝炎，或抗衰老等药物中的应用，其特征在于，该提取物至少含30%五味子藤茎总木脂素。但是关于华中五味子和北五味子等果实中分离得到的四环三萜类化合物甘五酸具有抗乙型肝炎和丙型肝炎的病毒作用目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供甘五酸在制备防治肝炎病毒药物中的应用。

本发明的再一的目的是，提供甘五酸在制备保肝的食品和保健品中的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：甘五酸在制备防治肝炎病毒药物中的应用，所述的甘五酸为四环三萜类化合物，化学结构式如下：

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所述的甘五酸在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用。

所述的甘五酸在制备抗丙型肝炎病毒药物中的应用。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：甘五酸在制备保肝的食品和保健品中的应用。

本发明优点在于：

本发明为四环三萜类化合物甘五酸提供一种制备抗乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）药物的用途，试验结果发现，该化合物具有显著的抗HBV和抗HCV活性，尤其能抑制HCV入侵靶细胞，可用于制备抗乙肝病毒和抗丙肝病毒的药物。本发明为寻找抗乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒药物提供了新的来源。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1  甘五酸抗乙肝病毒试验：

一、实验药物、试剂及材料

1. 化合物：甘五酸。

2. 立可读HBsAg诊断试剂盒（上海科华生物技术有限公司）。

3. 立可读HBeAg诊断试剂盒（上海科华生物技术有限公司）。

4. 细胞培养液，配制，其含10%胎牛血清，0.03%谷氨酰胺，G418 390μg/ml，卡那霉素50U/ml，调pH至7.2。

5. 细胞消化液，配制，其含0.25%胰蛋白酶，用磷酸缓冲液配制。

6. 细胞系HepG 2.2.15，为 HBV-DNA克隆转染人肝癌细胞的2.2.15细胞系。

二、实验方法：按试剂盒的说明书操作

取处于对数生长期的HepG 2.2.15细胞，调整细胞浓度为2×10⁵个/ml，取100μl种96孔板；药物不同浓度稀释培养24小时后加药，8天后取上清测表面抗原（HBsAg）和核心抗原（HBeAg）。

（1）每孔加入待测标本50μl，设阴、阳性对照各2孔，每孔加入阴性对照（或阳性对照）各一滴，并设空白对照一孔；

（2）每孔加入酶结合物1滴（空白对照孔除外），充分混匀，封板，置37 C孵育30分钟；

（3）弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复五次后拍干；

（4）每孔加显色剂A液、B液各1滴，充分混匀，封板，置37 C孵育15分钟；

（5）每孔加入终止液1滴，混匀；

（6）用酶标仪读数，取波长450nm，参考波长630nm，读取各孔读数。

三、实验结果

结果见表1、表2。

表1 甘五酸对乙肝核心抗原（HBsAg）抑制活性(%)

HBsAg	10μg/ml	20μg/ml	50μg/ml
				甘五酸	41.2	45.6	-

注：“-”表示该浓度下细胞死亡。

由表1可见，甘五酸具有显著抑制乙肝表面抗原作用，说明甘五酸具有抗肝炎病毒和保肝作用。

表2 甘五酸对乙肝核心抗原（HBeAg）抑制活性(%)

HBeAg	10μg/ml	20μg/ml	50μg/ml
				甘五酸	17.2	35.2	-

注：“-”表示该浓度下细胞死亡。

由表2可见，甘五酸具有显著抑制乙肝核心抗原作用，说明甘五酸具有抗乙型肝炎病毒和保肝作用。

实施例2  甘五酸抗丙型肝病毒试验：

一、实验药物、试剂及材料

1. 化合物： 甘五酸。

2. 细胞系Huh7，人肝癌细胞株（详见：Yimin Tong, Yongzhe Zhu, Xueshan Xia, Yuan Liu, et al. Tupaia CD81, SR-BI, Claudin-1, and Occludin Support Hepatitis C Virus Infection, JOURNAL OF VIROLOGY, 2011; 85( 6): 2793–2802; Jin Zhong, Pablo Gastaminza, Guofeng Cheng, et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro，PNAS, 2005;102(26):9294-9299）。

3. 细胞系293T，人胚肾细胞系（详见：Yimin Tong, Yongzhe Zhu, Xueshan Xia, Yuan Liu, et al. Tupaia CD81, SR-BI, Claudin-1, and Occludin Support Hepatitis C Virus Infection, JOURNAL OF VIROLOGY.  2011; 85( 6): 2793–2802 ; Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C. & Nairn, R. J. Gen. Virol 1977;36:59–74）。

4. 细胞培养液，配制，其含10%胎牛血清、0.03%谷氨酰胺、非必需氨基酸、氨苄青霉素和链霉素100U/ml，调pH至7.4。

5. 细胞消化液，配制，其含0.25%胰蛋白酶，用磷酸缓冲液配制。

6. HCVcc：细胞培养的感染性丙型肝炎病毒（Yimin Tong, Yongzhe Zhu, Xueshan Xia, Yuan Liu, et al. Tupaia CD81, SR-BI, Claudin-1, and Occludin Support Hepatitis C Virus Infection, JOURNAL OF VIROLOGY, Mar. 2011; 85( 6): 2793–2802; Jin Zhong, Pablo Gastaminza, Guofeng Cheng, et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro，PNAS, 2005;102(26):9294-9299）。

7. HCVpp：HCV假病毒（Yimin Tong, Yongzhe Zhu, Xueshan Xia, Yuan Liu, et al. Tupaia CD81, SR-BI, Claudin-1, and Occludin Support Hepatitis C Virus Infection, JOURNAL OF VIROLOGY, 2011; 85( 6): 2793–2802; Jin Zhong, Pablo Gastaminza, Guofeng Cheng, et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro，PNAS, 2005;102(26):9294-9299）。

二、实验方法

（一）HCVcc的制备

1. 病毒扩增：

J6、JFH-1嵌合HCVcc(10⁵ffu/ml)，取50μl感染接种于24孔板的Huh 7.5细胞，次日换液，随后根据细胞生长密度传代培养，观察细胞生长状态，待病毒快速增殖导致的细胞病变效应(CPE)出现后，收集第7~20天的培养上清，取适量用于病毒滴度测定，其余8,000rpm离心5min弃细胞碎片后分装保存于-70℃备用。

2. 病毒滴定

以空白Huh 7.5(1′10⁴cells/孔)，12h后，弃培养上清，每孔加入100μl经10倍梯度稀释的HCVcc上清液，共孵育5h，换新鲜DMEM全培养液继续培养72h，行免疫荧光法检测HCV阳性细胞，一抗用1:100稀释的HCV抗体阳性病人血清，二抗为1:100稀释的FITC标记羊抗人IgG。在荧光显微镜下观察发光细胞，并记录最后一个可观察到绿色荧光阳性细胞的孔内绿色荧光阳性细胞数及相应的稀释梯度，计算出focus forming unit/ml(ffu/ml)数值，以此代表HCVcc滴度。

（二）HCVcc感染性的检测

取处于对数生长期的Huh7细胞, 调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，取100μl种96孔板；培养24h后加入化合物及HCVcc，化合物按0、0.1、1、10、20、50ug/ml浓度稀释，37度培养4小时后去除化合物及HCVcc混液，换培养基继续培养；48h后进行免疫荧光检测，在荧光显微镜下读取各孔HCVcc阳性克隆数。

（三）结果（见表3）

表3 甘五酸对细胞培养丙肝病毒（HCVcc）的抑制活性（%）

化合物	0.1μg/ml	1μg/ml	10μg/ml	20μg/ml	50μg/ml
						甘五酸	17.3%	28.6%	35.3%	48.9%	78.9%

由表3可见，甘五酸具有显著抑制丙肝病毒（HCVcc）作用，说明该化合物具有抗丙型肝炎病毒作用。

（四）HCVpp的制备及感染实验

1. 将处于对数生长期的HEK293T细胞传代接种于24孔板内，置于37℃ 5%CO₂孵箱内培养过夜。

2. 观察细胞生长状况，待细胞50~70%汇合时，进行质粒转染。将脂质体2μl以及小鼠白血病病毒gag质粒、报告基因—荧光素本科或绿色荧光蛋白表达质粒及HCV全长包膜蛋白表达质粒置于50μl opti-MEM培养液中，混匀，室温放置20min。

3. 吸除HEK 293T细胞培养上清，加入3000μl opti-MEM培养液，再加入脂质体－质粒混合液，将细胞培养板置于孵箱内培养。

4. 6h后吸除细胞培养上清，加入500μl含10%胎牛血清DMEM培养液，置于孵箱内培养48h，收集细胞培养上清，高速离心去除残余细胞。

5. 将Huh 7.5细胞接种于96孔板内，贴壁后每孔加入50μl含HCVpp的培养上清，6h后换新鲜含10%胎牛血清DMEM培养液，继续培养72h，裂解细胞检测荧光素酶活性或于荧光显微镜下计数绿色荧光阳性细胞个数。

（五）HCVpp感染性的检测

取处于对数生长期的Huh7细胞, 调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，取100μl种96孔板；培养24h后加入化合物及HCVpp，化合物按0、0.1、1、10、20、50ug/ml浓度稀释，培养4小时去除化合物及HCVpp混液，换培养基继续培养；72h后在荧光显微镜下读取各孔绿色荧光阳性细胞数。

（六）结果（见表4）

表4 甘五酸对丙肝假病毒（HCVpp）的抑制活性（%）

化合物	0.1μg/ml	1μg/ml	10μg/ml	20μg/ml	50μg/ml
						甘五酸	2.8%	5.6%	49.1%	60.6%	87.0%

由表4可见，甘五酸具有显著抑制丙肝假病毒（HCVcc）作用，说明甘五酸具有抗丙型肝炎病毒作用。

上述实验结果表明，甘五酸具有显著的抗乙型肝炎病毒和抗丙型肝炎病毒活性，因此，可用于制备抗乙型肝炎病毒和抗丙型肝炎病毒的药物和保肝的药物。

本发明采用乙肝表面抗原（HBsAg）诊断试剂盒和乙肝核心抗原（HBeAg）诊断试剂盒对化合物甘五酸进行了抗乙肝表面抗原和乙肝核心抗原试验，结果发现，甘五酸具有显著的抗乙肝病毒活性。

通过体外建立的细胞培养来源的丙型肝炎病毒（HCVcc）及单周期的假病毒颗粒（HCVpp）模型，利用HCV易感细胞人肝癌Huh7细胞系，对四环三萜类化合物甘五酸的抗HCV活性进行了体外实验。结果发现，它具有显著的抗HCV活性，尤其能抑制HCV入侵靶细胞。因此，该化合物甘五酸可用于制备抗乙肝病毒（HBV）和抗丙肝病毒（HCV）的药物。

本发明为寻找抗抗乙肝炎病毒和丙型肝炎病毒药物提供了新的来源。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.甘五酸在制备抗丙型肝炎病毒药物中的应用，所述的甘五酸为四环三萜类化合物，化学结构式如下：

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