CN102499983B - HepG2.2.15细胞自噬小体在制备HBV治疗性疫苗中的应用 - Google Patents
HepG2.2.15细胞自噬小体在制备HBV治疗性疫苗中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了HepG2.2.15细胞自噬小体HBV-DRibbles在制备HBV治疗性疫苗中的应用。本发明首次发现HBV-DRibbles作为一种新型交叉提呈的抗原载体，免疫小鼠能产生HBV特异性的细胞免疫应答，抑制HBV感染小鼠模型的HBV病毒复制，有效清除HBV感染的肝细胞，效果优于只有单纯保护作用的重组HBsAg疫苗。本发明首次以HBV-DRibbles疫苗诱导DC细胞的交叉递呈，更有效地激发针对HBV特异性的CD8+T细胞应答，清除HBV病毒感染的肝细胞。为乙型肝炎的治疗提供新的思路。
Description
技术领域
本发明属于乙肝疫苗研制技术领域，具体涉及为HepG2.2.15细胞自噬小体在制备HBV治疗性疫苗中的应用。
背景技术
乙型肝炎(Hepatitis B，HB)：是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)引起、危及人类健康的传染病。目前全球有超过3.5亿HBV感染的慢性乙肝患者或携带者，其中我国HBV病毒携带者约1.2亿。相当一部分会发展成为肝硬化、甚至肝癌。目前治疗慢性乙型肝炎药物主要有干扰素及核苷(酸)类似物。由于靶点的限制，药物不能有效清除病毒cccDNA，停药后存在HBV DNA和转氨酶水平的反弹；长期用药可致病毒变异，产生耐药性。
鉴于目前抗病毒治疗效果有限，旨在打破机体免疫耐受，有效诱导免疫应答，清除乙肝病毒的治疗性疫苗的研发为乙型肝炎治疗提供了新思路。目前国外治疗性疫苗研究主要有蛋白疫苗、核酸疫苗、T细胞表位肽疫苗等，多停留在实验室研究或I、II期临床试验研究阶段。国内主要包括蛋白疫苗和多肽T细胞疫苗等。其中复旦大学研发的治疗乙肝慢性感染以铝盐为佐剂的免疫复合物疫苗，目前已进入III期临床试验研究阶段；第三军医大学研发的多肽疫苗已完成II期临床。虽然治疗性疫苗能诱导针对HBV的免疫反应，但对HBV病毒抑制和血清学改变等总体疗效并不稳定，至今尚无治疗性疫苗批准上市。因此，新型治疗性乙肝疫苗的研制具有重要的意义。
由于缺乏HBV肝炎小鼠模型及有效的HBV抗原交叉提呈，治疗HBV慢性感染，阻断肝细胞内HBV的复制和表达、诱导有效的免疫应答仍是目前难题之一。Chen等构建的HBV DNA载体pAAV/HBV1.2x，采用尾静脉高压注射法在正常C57BL/6小鼠体内，成功建立了HBV肝炎小鼠模型，使得HBV复制及抗原表达长达一年，该新型小鼠模型为研究HBV慢性感染的病毒学和免疫学机制提供了首要条件。
发明内容
本发明所要解决的技术问题，是提供HepG2.2.15细胞自噬小体在制备HBV治疗性疫苗中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
HepG2.2.15细胞自噬小体HBV-DRibbles在制备HBV治疗性疫苗中的应用。
根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的HepG2.2.15细胞自噬小体按如下步骤制备得到：
(1)HepG2.2.15肝癌细胞的培养：
复苏冻存细胞，用含10％(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM培养基，在37℃、5％(v/v)CO2的恒温培养箱中培养，每1～2天换液一次，常规0.25％(g/mL)胰蛋白酶消化传代；
(2)HepG2.2.15肝癌细胞的处理：
待步骤(1)培养后的细胞贴壁良好，密度适中后(所述的密度适中是以细胞单层均匀铺满培养板底部约80-90％的面积确定)，加入雷帕霉素(Rapamycin)、万珂(Velcade)和氯化铵(NH4CL)，雷帕霉素、万珂和氯化铵的加入量分别为100nmol/L、200nmol/L和30mmol/L，干预HepG2.2.15细胞16小时，诱导自噬小体HBV-DRibbles；
(3)提取HBV-DRibbles：
将步骤(2)诱导后的细胞经离心得到沉淀，即为自噬小体HBV-DRibbles。
步骤(3)中，提取HBV-DRibbles具体包含如下步骤：
(3a)将细胞及培养液倒入普通50ml离心管中，低速离心1200rpm，10min；
(3b)将步骤(3a)离心后的上清倒入圆底超速50ml离心管，高速离心12000rpm，30min，4℃；
(3c)将步骤(3a)离心后的沉淀的细胞用PBS重悬，低速离心1200rpm，10min，将低速离心后的上清再次倒入另一圆底超速50ml离心管中，高速离心12000rpm，30min，4℃；
(3d)将步骤(3b)和(3c)两次高速离心后得到的沉淀用PBS重悬，合并，12000rpm高速离心30min，4℃；
(3e)弃步骤(3d)得到的上清，沉淀即为自噬小体HBV-DRibbles，将沉淀用1ml PBS重悬后分装，冻存于-20℃，备用。
肿瘤细胞来源的自噬小体(DRibbles)是交叉提呈肿瘤抗原的有效载体，能有效诱导抗肿瘤的细胞免疫应答。提取自药物处理的HepG2.2.15细胞(转HBV全序DNA的人肝癌细胞，不仅可以产生肿瘤抗原，也可以产生HBV抗原)的自噬小体，可募集更多的HBV抗原成分，即HBV-DRibbles；以HBV-DRibbles疫苗诱导DC细胞的交叉递呈，以期更有效地激发针对HBV特异性的CD8+T细胞应答，清除HBV病毒感染的肝细胞。
有益效果：本发明首次发现HBV-DRibbles作为一种新型交叉提呈的抗原载体，免疫小鼠能产生HBV特异性的细胞免疫应答，抑制HBV感染小鼠模型的HBV病毒复制，有效清除HBV感染的肝细胞，效果优于只有单纯保护作用的重组HBsAg疫苗。本发明首次以HBV-DRibbles疫苗诱导DC细胞的交叉递呈，更有效地激发针对HBV特异性的CD8+T细胞应答，清除HBV病毒感染的肝细胞。为乙型肝炎的治疗提供新的思路。
附图说明
图1为电镜观察DRibbles的形态×10000。
图2为DRibble中LC3含量的变化。其中，1.+DMEM；2.+Velcade；3.+Rapamycin，4.+Velcade+Rapamycin 5.+Velcade+Rapamycin+NH4Cl。
图3为不同药物单独处理HepG2.2.15细胞对HBV-DRibbles中HBV抗原含量的影响。
图4为万珂、雷帕霉素和氯化铵联合作用HepG2.2.15细胞对HBV-DRibbles中HBsAg、HBeAg含量的影响。
图5为HBV-HBV-DRibbles疫苗免疫小鼠诱导产生特异性体液免疫应答。
图6.HBV-DRibbles疫苗免疫小鼠诱导产生特异性细胞免疫应答。
图7.Q-PCR法检测疫苗免疫HBV感染模型小鼠血清中HBV-DNA拷贝数。
图8.免疫组织化学法检测疫苗免疫HBV感染模型小鼠的HBcAg阳性肝细胞。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：HepG2.2.15细胞自噬小体HBV-DRibbles的制备。
1.HepG2.2.15肝癌细胞的培养：
复苏冻存细胞，用含10％(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM培养基，在37℃、5％(v/v)CO2的恒温培养箱中培养，每1～2天换液一次，常规0.25％胰蛋白酶消化传代。
2.HepG2.2.15肝癌细胞的处理：
待细胞贴壁良好，密度适中后，加入雷帕霉素100nmol/L、万珂200nmol/L、氯化铵30mmol/L组合，干预HepG2.2.15细胞16小时，诱导自噬小体HBV-DRibbles。
3.提取HBV-DRibbles：
药物处理细胞16小时后，收获细胞，经离心提取上清中的DRibbles。具体步骤如下：
1)将细胞及培养液倒入普通50ml离心管中，低速离心1200rpm，10min；
2)将步骤1)离心后的上清倒入圆底超速50ml离心管，高速离心12000rpm，30min，4℃；
3)将步骤1)离心后的沉淀的细胞用PBS重悬，低速离心1200rpm，10min，将低速离心后的上清再次倒入另一圆底超速50ml离心管中，高速离心12000rpm，30min，4℃；
4)将步骤2)和步骤3)两次高速离心后得到的沉淀用PBS重悬，合并，12000rpm高速离心30min，4℃；
5)弃步骤4)得到的上清，沉淀主要成分即为自噬小体HBV-DRibbles。将沉淀用约1mlPBS重悬后分装，冻存于-20℃，备用(避免反复冻融)。
实施例2：透射电子显微镜鉴定HBV-DRibbles的形态。
将提取好的HBV-DRibbles高速离心使其压缩紧密，弃上清，沉淀用2.5％(v/v)戊二醛固定，送电镜室进行处理，上镜观察HBV-DRibbles的形态。如图1所示：电镜下可见含膜结构的小体，平均直径约为200-300nm(箭头所指)，证实有效募集了肝癌细胞的自噬小体。
实施例3：HBV-DRibbles总蛋白含量测定(Bradford法)。
1)完全溶解蛋白标准品，取25μl用PBS稀释至100μl；
2)将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl分别加到96孔板中，加PBS补足到20μl；
3)提前将待测DRibbles反复冻融，离心取上清，加适量体积样本到96孔板中，加PBS补足到20μl；
4)各孔加入200μl G250染色液，室温放置3-5分钟；
5)用酶标仪测定595nm，或560-610nm之间其它波长的吸光度；
6)用软件ElisaCalc绘制标准曲线，根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。
每次提取蛋白浓度不完全相同，大约为1-3μg/μl。
实施例4：Western blot检测HBV-DRibbles中自噬标记蛋白--LC3的表达。
1)制备分离胶和浓缩胶
A分离胶(15％)制备：
B浓缩胶(5％)的制备：
2)SDS-PAGE电泳
待浓缩胶凝固后，用去离子水冲洗梳孔。取反复冻融后离心所得的上清，根据蛋白定量结果调整上样量，细胞裂解物每孔约12μl，加入5×SDS样品加样缓冲液3μl混匀，100℃煮沸5min，12000rpm离心5分钟后弃沉渣取上清准备上样。并加入蛋白分子量标准，在上、下槽中加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，开始电泳，恒压80V，待样本进入分离胶后，加大电压至120V，待溴酚蓝移动至胶板底部时终止电泳。
3)转膜
转膜开始前约半小时，将转移装置浸泡于预冷的转移缓冲液中，待电泳结束后，取下胶板，根据目的蛋白分子量切下相应大小的胶，浸泡于转移缓冲液中，根据胶的大小剪出适当大小的PVDF膜，浸泡于甲醇溶液中，待膜浸透后移至转移缓冲液中继续浸泡20分钟，制备“三明治”。恒流250mA电转移60min。
4)封闭
用0.05％TBST浸泡洗涤PVDF膜5min后，置于含3％牛血清白蛋白TBST中室温慢摇封闭1小时
5)一抗孵育
TBST1∶1000稀释抗-HBsAg单克隆抗体，4℃过夜。次日TBST洗涤3次，每次洗涤10分钟，摇床振动幅度120转/分钟
6)二抗孵育及显影
TBST 1∶5000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，室温，摇床孵育1小时；TBST洗涤3次，每次洗涤10分钟，摇床振动幅度120转/分钟；以ECL超敏发光底物曝光显影。
如图2所示：5组HBV-DRibbles中均检测到自噬特征性标记物LC3-II的表达，第5组的LC3一II显著高于其他4组。提示：自噬诱导剂雷帕霉素虽促进了自噬小体的生成，但由于自噬小体与溶酶体融合的降解途径未被阻断，自噬小体的降解未受抑制，因而HBV-DRibbles中自噬小体的总量无明显增加；而采用NH4Cl处理细胞抑制了溶酶体的酸化，阻止了溶酶体对自噬小体的降解，因而从NH4Cl处理组募集到的HBV-DRibbles富含自噬小体。推测采用万珂、雷帕霉素及NH4Cl处理HepG2.2.15细胞可以更有效地募集自噬小体。
实施例5：HBV-DRibbles中HBsAg、HBeAg表达量的检测(相对定量)。
按“乙型肝炎HBsAg、HBeAg诊断试剂盒”说明书操作。
1)提前将待测HBV-DRibbles反复冻融，离心取上清；
2)酶标条每孔加入待测标本50μl，设阴、阳性对照各2孔，每孔加入阴性对照(或阳性对照)各50μl，并设空白对照1孔；
3)每孔加入酶结合物50μl(空白对照孔除外)，充分混匀，封板，置37℃孵育30分钟；手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复5次后拍干；
4)每孔加显色剂A液、B液各50μl，充分混匀，封板，置37℃孵育15分钟；每孔加入终止液50微升，混匀；
5)酶标仪波长450nm(参考波长630nm)测定各孔OD值。
结果：
A.图3显示不同药物单独处理HepG2.2.15细胞对HBV-DRibbles中HBV抗原含量的影响。
1)万珂对HBV-DRibbles中HBV抗原含量的影响：
对生长密度适中、贴壁良好的HepG2.2.15细胞加入万珂(浓度分别为60、200、600nM)处理24小时，提取培养上清中的HBV-DRibbles并采用ELISA法检测其中HBsAg和HBeAg含量。结果显示：200nM的万珂能显著提高HBV-DRibbles中的HBsAg含量(p＝0.0113)，同时显著提高HBV-DRibbles中的HBeAg含量(p＝0.0082)。提示：蛋白酶体抑制剂万珂能提高HBV-DRibbles中HBV抗原含量。
2)雷帕霉素对HBV-DRibbles中抗原含量的影响：
对生长密度适中，贴壁良好的HepG2.2.15细胞加入浓度分别为30nM、100nM、300nM的雷帕霉素诱导24小时后，提取培养上清中的HBV-DRibbles，ELISA法检测HBV-DRibbles中HBsAg和HBeAg含量。结果显示：100nM的雷帕霉素均明显增加HBV-DRibbles中HBsAg含量和HBeAg含量(p＝0.0452、p＝0.0134)。提示：自噬诱导剂雷帕霉素能够提高HBV-DRibbles中HBV抗原的含量。
3)氯化铵对HBV-DRibbles中抗原含量的影响：
对生长密度适中、贴壁良好的HepG2.2.15细胞加入浓度分别为3、10、30(mM)的氯化铵处理24小时后提取培养上清中的HBV-DRibbles，ELISA法检测HBV-DRibbles中HBsAg和HBeAg含量。结果显示：30mM的氯化铵对HBV-DRibbles中的HBsAg含量没有明显的影响，但增加了HBV-DRibbles中的HBeAg含量(p＝0.0028)。提示：氯化铵能够提高HBV-DRibbles中HBeAg的含量。
B.图4显示三种药物联合作用HepG2.2.15细胞对HBV-DRibbles中HBsAg、HBeAg含量的影响。
为进一步观察3种自噬相关药物万珂、雷帕霉素和氯化铵联合处理HepG2.2.15细胞对HBV-DRibbles内HBV抗原含量的影响，将3种药物按上述最佳作用浓度联合处理HepG2.2.15细胞24小时，ELISA检测HBV-DRibbles中的HBsAg和HBeAg。结果显示：与未处理的对照组相比，3种药物联合作用细胞可显著提高HBV-DRibbles中HBsAg和HBeAg含量(p＝0.0004、p＝0.0007)。提示：3种药物联合作用HepG2.2.15细胞，有效提高了HBV-DRibbles中HBV抗原含量。
实施例6：HBV-DRibbles中HBsAg含量测定(绝对定量)。
步骤同实施例5。
不同之处在于：
1)于加样同时加倍比稀释的HBsAg标准品，50μl/孔。
2)酶标仪检测后用软件ElisaCalc绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品中HBsAg浓度。
每次提取结果不完全相同，HBsAg含量约1-2mg/μl。
实施例7：HBV-DRibbles疫苗淋巴结免疫小鼠。
1)将小鼠置于小型动物麻醉机中，异氟烷全身吸入式麻醉；
2)待小鼠完全麻醉后，固定小鼠剪开腹部皮肤勿伤及腹膜，暴露两侧腹股沟位置的皮下淋巴结；
3)然后每侧分别注射40μg/20μl HBV-DRibbles；对照组每侧注射HBsAg重组疫苗40μg/20μl；
4)2周后分别皮下注射加强免疫HBsAg重组疫苗免疫(400μg/200μl/只)和HBV-DRibbles免疫(400μg/200μl/只)，2周后重复加强1次；
5)5周后小鼠眼眶采血300μl/只，室温放置2小时后，4℃过夜，6000rpm离心10分钟分离收获血清。
实施例8：ELISA检测血清中HBs-IgG抗体的产生。
按“乙型肝炎表面抗体诊断试剂盒”说明书操作
1)提前将待测HBV-DRibbles反复冻融，离心取上清；
2)酶标条每孔加入待测标本50μl，设阴、阳性对照各2孔，每孔加入阴性对照(或阳性对照)各50μl，并设空白对照1孔；
3)每孔加入酶结合物50μl(空白对照孔除外)，充分混匀，封板，置37℃孵育30分钟；手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复5次后拍干；
4)每孔加显色剂A液、B液各50μl，充分混匀，封板，置37℃孵育15分钟；每孔加入终止液50微升，混匀；
5)酶标仪波长450nm(参考波长630nm)测定各孔OD值。
图5结果显示：HBV-DRibbles免疫组的小鼠抗HBs IgG的A450nm值大约在0.42左右，HBsAg重组疫苗免疫组小鼠抗HBs IgG的A450nm值大约为0.18，HBV-DRibbles免疫诱导抗HBs IgG水平显著高于HBsAg重组疫苗(p＝0.03)。提示：HBV-DRibbles诱导的体液免疫效果优于重组HBsAg组。
实施例9：ELISA法检测HBV抗原再刺激HBsAg特异性脾细胞产生的IFN-γ含量：
按实施例7中DRibbles及HBsAg重组疫苗免疫小鼠，待小鼠血清中抗HBs抗体检测阳性时，处死小鼠，取脾脏及淋巴结细胞。步骤如下：
(1)每组处死3只小鼠，75％乙醇浸泡5min，在超净工作台内无菌取脾及淋巴结，放入冷Hanks液中漂洗2次；
(2)用无菌磨砂玻片将脾脏及淋巴结碾碎并滤过200目无菌不锈钢网，收集细胞悬液，置50ml离心管中离心1500rpm，离心10min；
(3)弃上清，加入红细胞裂解液温和混匀，静置5min，1500rpm，离心10min；
(4)弃上清，再用Hanks液漂洗1次，细胞计数，用含10％小牛血清的RPIM1640完全培养液调整细胞浓度至2×106/ml；
(5)设HBcAg、HBsAg刺激组(其中HBcAg设500ng/ml，50ng/ml，0ng/ml、HBsAg设100ng/ml，30ng/ml，0ng/ml三个浓度)，与淋巴细胞共同培养于24孔板中；
(6)收集72小时的培养上清，ELISA法检测上清中IFN-γ含量。
结果见实施例10。
实施例10：培养上清中IFN-γ含量检测。
按e-Bioscience ELISA试剂盒说明书操作。
1)包被捕获抗体
4度过夜；
2)弃去孔中液体，洗涤5次；
3)每孔加入稀释液
封闭，室温孵育1小时；
4)弃去孔中液体，洗涤5次；
5)每孔加入
倍比稀释的标准品，以绘制标准曲线。样本每孔加
封板，室温孵育2小时；
6)弃去孔中液体，洗涤5次；
7)每孔加入
检测抗体，封板，室温孵育1小时；
8)弃去孔中液体，洗涤5次；
9)每孔加入
HRP标记亲和素，封板，室温孵育半小时；
10)弃去孔中液体，洗涤7次；
11)每孔加入
显色液，室温孵育15分钟；
12)每孔加入50μl终止液；测定450nm波长处吸光数。
图6结果显示：重组HBsAg疫苗免疫小鼠可产生针对HBsAg的细胞应答，而与重组HBsAg疫苗相比，HBV-DRibbles免疫小鼠不仅产生了针对HBsAg的细胞与应答，还产生了高水平的针对HBcAg抗原的细胞应答，差异具有明显统计学意义(p＜0.001)。提示：富含抗原的HBV-DRibbles比重组HBsAg疫苗更能有效刺激效应T细胞γ干扰素的分泌，诱导产生更强的特异性细胞免疫应答。
实施例11：乙型肝炎小鼠模型的建立。
采用尾静脉高压注射法注射C57BL/6小鼠，10μg pAAV/HBV1.2质粒，于5-8s注射完成，注射剂量为小鼠体重8％。
实施例12：HBV-DRibbles疫苗治疗HBV感染小鼠模型。
HBV-DRibbles和重组HBsAg疫苗免疫C57BL/6小鼠(同步骤7)，待血清HBs-IgG抗体检测阳性后，尾静脉高压注射法注射10μg pAAV/HBV1.2质粒，于质粒注射后第1、2、4、6周，定期眼眶静脉采血，收集血清样本。同时设立重组HBsAg免疫小鼠对照组。ELISA法检测HBV抗原、荧光定量PCR法检测HBV-DNA拷贝数、末次采血时处死小鼠，取肝脏，4％甲醛固定，石蜡包埋，切片，免疫组织化学染色法检测HBcAg阳性肝细胞数。以探讨HBV-DRibbles疫苗对HBV感染的小鼠模型的治疗作用，并与重组HBsAg比较。
实施例13：Q-PCR检测小鼠血清中的HBV-DNA拷贝数。
按乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)试剂盒说明书操作。核酸提取：
1)吸取100μl样品处理液A于0.5ml离心管中。
2)加入100μl被测样本
3)盖上管盖，震荡混匀，13000rpm离心10分钟
4)吸弃上清
5)再加入25μl样品处理液B
6)震荡混匀，低速(2000rpm)离心数秒后100℃干浴或沸水浴10分钟。
7)13000rpm离心10分钟。取上清为PCR反应模板
PCR试剂准备：
PCR扩增检测：
1)将毛细反应管放入LightCyclery荧光PCR扩增仪进行扩增检测
2)循环参数设定见表1(荧光检测通道F1)。
表1
样品设置：在仪器软件的相应样品设置窗口内填写各样品的名称、类型及工作标准品参数。
结果分析：由仪器自动分析。
图7结果显示：与未免疫的野生型对照组小鼠相比，质粒攻击不同时间，HBV-DRibbles疫苗和重组HBsAg疫苗免疫均可明显降低小鼠血清中HBVDNA拷贝数；HBV-DRibbles疫苗和重组HBsAg疫苗之间未见明显统计学差异。提示：HBV-DRibbles免疫模型小鼠血清HBV-DNA拷贝数明显下降。
实施例14：免疫组织化学方法。
1)石蜡切片放37℃烤箱，过夜；
2)使用二甲苯-无水乙醇-95％乙醇-90％乙醇-80％乙醇-70％乙醇脱蜡；
3)抗原修复；
4)加3％H2O2去离子水孵育30分钟；
5)PBST洗涤，加一抗(兔抗HBcAg-IgG)，4℃孵育过夜；
6)PBST洗涤，加二抗(HRP标记羊抗兔多聚体)，37℃30分钟；
7)PBST洗涤，加DAB显色；
8)自来水冲洗，苏木素复染；
9)自来水冲洗，盐酸酒精分化；
10)自来水冲洗，烤干，95％乙醇-无水乙醇脱水；
11)二甲苯透明；
12)封片。
如图8结果所示：质粒攻击第6周，与为免疫野生型对照组小鼠(约10％)相比，HBV-DRibbles疫苗和重组HBsAg疫苗免疫小鼠，均可明显降低HBcAg阳性的肝细胞比率，其中HBV-DRibbles疫苗可完全清除HBV感染的肝细胞。推测：HBV-DRibbles疫苗产生的特异性免疫应答能更有效清除HBV感染的肝细胞，从而使模型小鼠血清中HBsAg和HBV-DNA拷贝数明显下降。
Claims (1)
1.HepG2.2.15细胞自噬小体HBV-DRibbles在制备HBV治疗性疫苗中的应用；
其中，所述的HepG2.2.15细胞自噬小体按如下步骤制备得到：
(1)HepG2.2.15肝癌细胞的培养：
复苏冻存细胞，用含10%(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM培养基，在37℃、5%(v/v)CO2的恒温培养箱中培养，每1～2天换液一次，常规0.25%胰蛋白酶消化传代；
(2)HepG2.2.15肝癌细胞的处理：
待步骤(1)培养后的细胞贴壁良好，密度适中后，加入雷帕霉素、万珂和氯化铵，雷帕霉素、万珂和氯化铵的加入量分别为100nmol/L、200nmol/L和30mmol/L，干预HepG2.2.15细胞16小时，诱导自噬小体HBV-DRibbles；
(3)提取HBV-DRibbles：
将步骤(2)诱导后的细胞经离心得到沉淀，即为自噬小体HBV-DRibbles；
步骤(3)中，提取HBV-DRibbles具体包含如下步骤：
(3a)将细胞及培养液倒入50ml离心管中，低速离心1200rpm，10min；
(3b)将步骤(3a)离心后的上清倒入圆底超速50ml离心管，高速离心12000rpm，30min，4℃；
(3c)将步骤(3a)离心后的沉淀的细胞用PBS重悬，低速离心1200rpm，10min，将低速离心后的上清再次倒入另一圆底超速50ml离心管中，高速离心12000rpm，30min，4℃；
(3d)将步骤(3b)和(3c)两次高速离心后得到的沉淀用PBS重悬，合并，12000rpm高速离心30min，4℃；
(3e)弃步骤(3d)得到的上清，沉淀即为自噬小体HBV-DRibbles，将沉淀用1ml PBS重悬后分装，冻存于-20℃，备用。
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