CN105983095A - 一种呼吸道合胞体病毒疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents
一种呼吸道合胞体病毒疫苗及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105983095A CN105983095A CN201510082407.8A CN201510082407A CN105983095A CN 105983095 A CN105983095 A CN 105983095A CN 201510082407 A CN201510082407 A CN 201510082407A CN 105983095 A CN105983095 A CN 105983095A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- respiratory syncytial
- syncytial virus
- protein
- group
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种呼吸道合胞体病毒疫苗及其制备方法与应用。本发明的呼吸道合胞体病毒疫苗的活性成分为呼吸道合胞病毒G蛋白和免疫抑制剂；所述呼吸道合胞病毒G蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示；所述免疫抑制剂为环孢菌素A。通过试验证明：本发明的呼吸道合胞体病毒疫苗不但能增强免疫动物后中和病毒抗体水平的体液免疫反应，同时还能抑制过强的细胞免疫反应，有效和特异性的抑制炎症相关病理反应，而且技术成熟，成本低，无副作用，易于推广。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种呼吸道合胞体病毒疫苗及其制备方法与应用。
背景技术
呼吸道合胞体病毒RSV(Respiratory Syncytial Virus)，为副黏病毒科单链负义RNA病毒，主要引发新生儿与老年人下呼吸道疾病，也是导致1岁以下婴儿肺炎的主要原因之一。流行病学数据显示，大约60％的新生儿在RVS流行季受该病毒感染，5岁以下儿童约有18％感染过RSV病毒，其中重症病例约为18％，住院病例比例约为20％，门诊病例15％。感染者中，全球每年约有3万婴幼儿死于RSV感染。每年约1/13五岁以下儿童因RSV就医，其中60％RSV门诊病例为2-5岁儿童。在中国，就重庆市一个地区，因RSV感染导致的儿科病毒性肺炎住院病例约为40％，基本与流感病例比例相同。
尽管RSV作为一种严重危害婴幼儿健康的疾病，经过近50年的研究，全球仍没有一种被批准的有效、安全的疫苗问世。进入临床研究的RSV疫苗有许多种类：(1)研制的是灭活疫苗，可以产生抗病毒蛋白的抗体，但是中和抗体水平低并且在服苗者肺部产生了由Th2和粒细胞介导的严重的炎性细胞浸润，导致接种者在接触病毒后产生严重疾病，甚至引起死亡；(2)亚单位疫苗，RSV病毒外壳蛋白F和G是主要具有中和表位的蛋白，在动物模型上发现选择用纯化后的F和G蛋白作为疫苗可以有效的产生中和抗体抑制病毒复制，并且抑制Th2细胞的激活，但是在人免疫后出现了病毒感染加重的病例，安全性不能保证，仅基于RSV F蛋白的亚单位疫苗，具有很好的抑制病理性免疫反应作用但是免疫原性不佳；(3)通过滴鼻给药能够刺激局部和系统免疫应答的减毒活疫苗，大部分的减毒疫苗包括应用最多的“cpts248/404”对大于6个月的婴儿有很好效果，但是对6个月以下婴儿肺部会产生中度炎性反应，同样安全性不能保证。除此之外，还有很多临床研究的RSV疫苗，但至今为止全球仍没有一种被批准的有效、安全的RSV疫苗问世。针对RSV疫苗开发过程中所面对两个主要障碍：1)获得高滴度中和抗体水平；2)降低炎性细胞在肺部产生炎症损伤。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种呼吸道合胞病毒疫苗。
本发明提供的呼吸道合胞病毒疫苗的活性成分为呼吸道合胞病毒G蛋白和免疫抑制剂。
上述呼吸道合胞病毒疫苗中，所述呼吸道合胞病毒G蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
上述呼吸道合胞病毒疫苗中，所述免疫抑制剂为环孢菌素A、地塞米松、雷帕霉素或环磷酰胺；所述免疫抑制剂具体为环孢菌素A。
上述呼吸道合胞病毒疫苗中，所述呼吸道合胞病毒G蛋白和所述环孢菌素A的质量比为1:100-100:1。
上述呼吸道合胞病毒疫苗中，所述呼吸道合胞病毒G蛋白和所述环孢菌素A的质量比为1:1、2:10、4:10、6:10或8:10。
上述呼吸道合胞病毒疫苗中，所述呼吸道合胞病毒G蛋白和所述环孢菌素A的质量比进一步具体为1:1。
本发明的另一个目的是提供一种制备呼吸道合胞病毒疫苗的方法。
本发明提供的制备呼吸道合胞病毒疫苗的方法包括如下步骤：
将环孢素A溶液与呼吸道合胞病毒G蛋白混匀，得到呼吸道合胞病毒疫苗。
上述方法中，所述呼吸道合胞病毒G蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
上述方法中，所述环孢素A溶液中的环孢素A与所述呼吸道合胞病毒G蛋白质量比为1:100-100:1。
上述方法中，所述环孢素A溶液中的环孢素A与呼吸道合胞病毒G蛋白的质量比具体为1:1、2:10、4:10、6:10或8:10。
上述方法中，所述环孢素A溶液的制备方法：将环孢素A溶于丙二醇中，得到混合液；将所述混合液与PBS溶液等体积混匀，得到所述环孢素A溶液。
上述方法中，所述环孢素A在所述丙二醇中的浓度为0.2mg/ml。
上述方法中，所述PBS溶液由溶质和溶剂组成，溶剂为水；溶质及其在PBS溶液中的浓度为：135mM NaCl、2.7mM KCl、1.5mM NaH2PO4、8mM NaHPO4；所述PBS溶液的pH为7.4。
上述呼吸道合胞病毒G蛋白在制备呼吸道合胞病毒的疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。
上述呼吸道合胞病毒G蛋白和免疫抑制剂在制备呼吸道合胞病毒的疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述呼吸道合胞病毒G蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
上述应用中，所述免疫抑制剂为环孢菌素A。
上述呼吸道合胞病毒疫苗在如下(1)-(12)中至少一种中的应用也属于本发明的保护范围：
(1)制备提高哺乳动物的呼吸道合胞病毒特异性IgG抗体水平的产品；
(2)制备提高哺乳动物的呼吸道合胞病毒特异性中和抗体水的产品；
(3)制备抑制哺乳动物的呼吸道合胞病毒特异性T淋巴细胞增殖的产品；
(4)制备抑制哺乳动物的呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特异性T淋巴细胞增殖的产品；
(5)制备诱导哺乳动物的呼吸道合胞病毒特异性调节性T细胞的产生的产品；
(6)制备诱导哺乳动物的呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特异性调节性T细胞的产生的产品；
(7)制备促进哺乳动物的呼吸道合胞病毒特异性调节性T细胞分泌IL10、IL21和/或CD40L的产品；
(8)制备促进哺乳动物的呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特异性调节性T细胞分泌IL10、IL21和/或CD40L的产品；
(9)制备降低哺乳动物的呼吸道合胞病毒的病毒载量的产品；
(10)制备抑制哺乳动物的肺部炎性细胞的增殖的产品；
(11)制备降低呼吸道合胞病毒对哺乳动物肺部组织的损伤的产品；
(12)制备抑制哺乳动物的炎症反应的产品。
上述应用中，所述抑制哺乳动物的炎症反应是通过降低肺指数实现的。
本发明将呼吸道合胞病毒G蛋白和免疫抑制剂(CSA)一起免疫动物，免疫后可以诱导出一群抗原特异性Treg细胞，从而开发出诱发高水平的中和抗体和无病理性损伤的呼吸道合胞病毒疫苗。通过试验证明：本发明的呼吸道合胞病毒疫苗不但能增强免疫动物后中和病毒抗体水平的体液免疫反应，同时还能抑制过强的细胞免疫反应，有效和特异性的抑制炎症相关病理反应，而且技术成熟，成本低，无副作用，易于推广。
附图说明
图1为琼脂糖凝胶电泳检测pET28a-NOG质粒。其中1为DL15000 DNAMarker；2为DL2000 DNA Marker；3为pET28a-noG质粒；4为限制性内切酶Nco I/Xho I消化后的pET28a-noG质粒。
图2为SDS-PAGE电泳检测重组蛋白(G蛋白)在大肠杆菌中的表达。其中，1为蛋白质标准分子量；2为E.coli BL21 pET28a-noG未经IPTG诱导破膜后上清；3为E.coli BL21 pET28a-noG未经IPTG诱导破膜后包涵体；4为E.coli BL21 pET28a-noG经0.5mM IPTG诱导破膜后上清；5为E.coli BL21pET28a-noG经0.5mM IPTG诱导破膜后包涵体；6为E.coli BL21 pET28a-noG经1mM IPTG诱导破膜后上清；7为E.coli BL21 pET28a-noG经1mM IPTG诱导破膜后包涵体；8为E.coli BL21 pET28a-noG经2mM IPTG诱导破膜后上清；9为E.coli BL21 pET28a-noG经2mM IPTG诱导破膜后包涵体；10为E.coli BL21pET28a-noG经3mM IPTG诱导破膜后上清；
11为E.coli BL21 pET28a经3mM IPTG诱导破膜后包涵体；12为E.coli BL21pET28a经5mM IPTG诱导破膜后上清；13为E.coli BL21 pET28a经5mM IPTG诱导破膜后包涵体。
图3为Western Blot验证原核表达NOG蛋白。图3a为羊抗RSV抗体的验证结果；其中1为E.coli BL21 pET28a-noG经2mM IPTG诱导破膜后上清；2为E.coli BL21 pET28a-noG经2mM IPTG诱导破膜后包涵体；3为His-Tag G蛋白对照。图3b为小鼠抗His Tag抗体的验证结果；其中，1为E.coli BL21 pET28a-noG经2mM IPTG诱导破膜后上清；2为E.coli BL21 pET28a-noG经2mM IPTG诱导破膜后包涵体；3为His-Tag G蛋白对照；4为His-Tag IL-17蛋白对照。
图4为不同免疫剂量免疫后小鼠的中和抗体水平和T细胞增殖水平。
图5为肺部病毒载量检测免疫后小鼠的肺部病毒载量。
图6为称量肺重量检测联合免疫小鼠攻毒后肺指数。
图7为肺部病理切片检测免疫后小鼠的肺部病理变化。
图8为ELISA检测免疫后兔子的IgG抗体水平检测结果和T细胞增殖实验检测免疫后兔子的T细胞增殖水平检测结果。图8a为ELISA检测免疫后兔子的IgG抗体水平检测结果；图8b为T细胞增殖实验检测免疫后兔子的T细胞增殖水平检测结果。
图9为流式检测免疫攻毒后小鼠肺部灌洗液中Treg细胞绝对数量。
图10为流式检测免疫攻毒后小鼠脾脏Treg细胞分泌IL-10水平、IL-21水平、CD40L水平。图10a为流式检测免疫攻毒后小鼠脾脏Treg细胞分泌IL-10水平；图10b为流式检测免疫攻毒后小鼠脾脏Treg细胞分泌IL-21水平；图10c为流式检测免疫攻毒后小鼠脾脏Treg细胞分泌CD40L水平。
图11为流式检测免疫攻毒后小鼠肺门淋巴结Treg细胞分泌IL-10水平和CD40L水平。图11a为流式检测免疫攻毒后小鼠肺门淋巴结Treg细胞分泌IL-10水平；图11b为流式检测免疫攻毒后小鼠肺门淋巴结Treg细胞分泌CD40L水平。
图12为ELISA方法检测RSV疫苗在兔子上免疫后的不同时间点的IgG抗体水平和流式检测第123天血液中T细胞的增殖情况。图12a为ELISA方法检测RSV疫苗在兔子上免疫后的不同时间点的IgG抗体水平；图12b为流式检测第123天血液中T细胞的增殖情况。
图13为流式检测T细胞增殖结果。
图14为ELISA检测RSV疫苗与HBV疫苗免疫后小鼠的IgG抗体水平检测。图14a为实验分组及各组的免疫情况；图14b为ELISA检测RSV疫苗与HBV疫苗免疫后小鼠的IgG抗体水平检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
ECL试剂是瑞典GE Healthcare Eurpoe公司的产品。
灭活疫苗FI-RSV的制备方法：107TCID50RSV病毒(美国ATCC，catalog no.VR-26TM)经甲醛72h，37℃反应后，利用50000g高速离心1h纯化后制得。
环孢素A(CSA)是台上市化学制药有限公司公司的产品，产品目录号国药准字H10940111。
载体pET28a(+)是Novagen公司的产品，产品目录号69864-3。
大肠杆菌BL21(DE3)是天根生化科技(北京)有限公司的产品，产品目录号CB105-02。
1640培养基是迈晨科技有限公司的产品，货号CM10040。
山羊抗RSV多克隆抗血清是美国Meridian公司产品，产品目录号B656860G。
HBV疫苗是华大制药有限公司的产品。
实施例1、呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗的制备
一、G蛋白的获得
1、G蛋白的编码基因的获得
本发明的呼吸道合胞病毒G蛋白的编码基因序列如序列表中序列1所示，呼吸道合胞病毒G蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
2、表达载体pET28a-noG的构建
通过全基因合成的方法合成步骤1的呼吸道合胞病毒G蛋白的编码基因序列，用限制性内切酶NcoI与XhoI对呼吸道合胞病毒G蛋白的编码基因序列和载体pET28a(+)进行双酶切，连接，得到重组载体，将重组载体命名为pET28a-noG。对pET28a-noG载体进行酶切鉴定的结果如图1所示。
对pET28a-noG载体进行测序验证，结果表明：pET28a-noG载体为将载体pET28a(+)的NcoI与XhoI酶切位点间的DNA替换为序列表中序列1所示的呼吸道合胞病毒G蛋白的编码基因，保持载体pET-28a(+)的其他序列不变得到的重组载体，表达糖蛋白G。
3、重组菌的获得
将步骤2中的pET28a-noG载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，转化后的菌株命名为BL21(DE3)/pET28a-noG，同时设置转化pET-28a(+)空载体的BL21(DE3)作为对照，转化后的菌株命名为BL21(DE3)/pET-28a(+)。
4、重组菌的诱导表达
用不同浓度的异丙基巯基半乳糖苷(IPTG)诱导G蛋白的表达，具体步骤如下：挑取过夜生长的BL21(DE3)/pET28a-noG的单菌落，接种于LB培养基中，37℃震荡培养至对数生长期(OD600＝0.5)，加入终浓度分别为0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、5mmol/L的IPTG，于37℃诱导4小时。
诱导结束后收集菌体，使用PBS溶液反复清洗3次菌体后，将菌体超声破碎，12000rpm离心，将上清液与重悬后的沉淀(包涵体)分别进行SDS-PAGE电泳，验证蛋白表达，结果如图2所示。从图2可以看出：转化了重组质粒pET-28a-G的大肠杆菌BL21(DE3)在37℃、0.5mM IPTG诱导4h可以得到大量原核表达的呼吸道合胞病毒G蛋白(约35kDa)。
二、G蛋白抗原性的验证
将步骤一中的得到的G蛋白在12％的SDS-PAGE胶上分离，然后使用Bio-Rad转膜系统将G蛋白转移至PVDF膜上。
将膜浸泡在5％的脱脂奶粉(PBST)中，于37℃条件下封闭2h，PBST洗膜3次。将膜浸泡在用3％的脱脂奶粉(PBST)稀释2000倍的山羊抗RSV多克隆抗血清(美国Meridian公司产品)或稀释6000倍小鼠抗His-Tag(Abmart公司)中，于37℃条件下孵育1小时，PBST洗膜3次。
将膜浸泡在用3％脱脂奶粉(PBST)稀释1000倍的HRP牛抗山羊IgG或HRP羊抗小鼠IgG(美国Santa Cruz公司产品)中，于37℃条件下孵育1小时，PBST洗膜3次。参照使用说明，利用电化学发光(ECL)法检测免疫复合物。诱导表达的目的蛋白经过羊抗RSV抗体和小鼠抗His Tag抗体进行Western Blot杂交验证。
羊抗RSV抗体的验证结果如图3a所示，小鼠抗His Tag抗体的验证结果如图3b所示。结果表明：表达的目的蛋白确实为不含有His Tag的RSV G蛋白，重组G蛋白具有良好抗原性，可以被抗RSV抗体识别。
三、G蛋白的提取和纯化
1、一级种子液的获得
挑取BL21(DE3)/pET28a-noG的单菌落于50ml加了适量抗生素的LB培养基中，37℃，220转振荡8-10小时，得到一级种子液。
2、二级种子液的获得
将步骤1得到的一级种子液以5％的接种量接入500ml的LB培养基(含抗生素)中，37℃，220转振荡8-10小时，得到二级种子液。
3、G蛋白的获得
将步骤2得到的一级种子液以5％-10％的接种量接入发酵罐中，当OD＝3时，以1.2ml/min加入补料；当OD＝24时，开始加入1M IPTG 20ml，2h加入1M IPTG10ml，4h后加入1M IPTG 10ml。诱导结束后收集菌液，所述菌液中含有呼吸道合胞病毒G蛋白。
4、G蛋白的提取及纯化
(1)将步骤3得到的含有G蛋白的菌液用100k超滤器(温度：室温；压力：不超过kg/cm2)进行清洗、浓缩，浓缩后用2-3倍体积PBS再清洗；
(2)经高压均质机破碎两次，压力850-900kg/cm2，收集均浆物，将均浆物重悬于PBS中，每1g均浆物(湿重，16000rpm，15min测定)溶于10ml的PBS，标记、用50ml锥形离心管分装后，-20℃保存。
(3)将解冻后的均浆物16000rpm，15min离心收集沉淀即为包涵体，将收集到的包涵体按照湿菌重的1:20，用含有1％TritonX-100的BufferA(BufferA配方：50mM Tris–HCl、5mM EDTA、100mM Nacl、PH8.5)重悬清洗。
(4)16000rpm，15min离心弃上清液，收集沉淀，上清液、沉淀分别留样检测SDS，沉淀按照湿菌重的1:20用含有1％TritonX-100的BufferA重悬清洗。
(5)16000rpm，15min离心弃上清液，收集沉淀，上清液、沉淀分别留样检测SDS；沉淀按照湿菌重1:20用PBS重悬清洗。
(6)16000rpm，15min离心弃上清液，收集沉淀，上清液、沉淀分别留样检测SDS。
(7)将2.5g经过(6)收集的沉淀(包涵体)重悬于BufferB中(BufferB配方：8M尿素、20mM Tris–HCl、5mM EDTA、100mM Nacl、10mM DTT、PH8.5)，待包涵体溶解于BufferB后，得到变性的蛋白溶液；在低速搅拌下，以5ml/min的速度将50ml变性的蛋白溶液加入到950ml的BufferC(Buffer C配方：700mM尿素、20mM Tris–HCl、500mM精氨酸、1mM胱胺二盐酸盐、5mM半胱胺酸、15％甘油、PH9.0)中，低温(4℃)搅拌(≤100rmp)40h。
(8)取经过上述(7)处理后的蛋白溶液，16000rpm/min，4℃离心收上清液，转移至(MW8000-14000)透析袋中进行透析，复性液：透析液(V:V)＝1:10，低温(4℃)透析24h，每12h更换1次透析液。
(9)16000rpm，10min，4℃离心，收集透析袋中的复性溶液上清液，SDS-PAGE检测，可见明显目的蛋白(35kDa)。
(10)取上述(9)处理后的复性溶液上清液，转移至(MW8000-14000)透析袋，放入30％PEG8000溶液中，4℃浓缩，5-8h，透析液体积浓缩至原体积1/3～1/5，12000rpm，10min，4℃离心，收集上清液，加入2％甘露醇，3％葡萄糖，5mmol精氨酸(W/V)，溶解后，经0.22um滤膜过滤，10ml西林瓶分装，5.0ml/瓶，-80℃冷冻，低温真空干燥后密封保存(含水量≤1.0％)，得到纯化后的G蛋白，即所述抗原。按冻干程序操作将G蛋白冻存，冻干程序结束后干燥、压盖、铝盖封装，得到G蛋白冻干品。
四、呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗的制备
将环孢素A(CSA)溶于丙二醇(环孢素A的浓度为0.2mg/ml)中，加入等体积PBS溶液(135mM NaCl、2.7mM KCl、1.5mM NaH2PO4、8mM NaHPO4；pH 7.4)，混匀，得到疫苗溶剂；将步骤三制备得到的G蛋白冻干品溶于疫苗溶剂中，得到呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗，其中，环孢素A与G蛋白的质量比为1：100-100：1；在下面的实施例中采用环孢素A与G蛋白的质量比为1:1、2:10、4:10、6:10、8:10的呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗进行试验。
实施例2、呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗免疫小鼠后抗体水平检测
一、各组疫苗免疫小鼠
实验材料：6-8周龄雌性BALB/c小鼠，购自复旦大学实验动物部，为清洁级，分9组，每组5只。实验期间使用无菌水及食物喂养，光照周期为12小时。
实验用疫苗分成实施例1的四制备的呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗组(G+CSA)、亚单位疫苗组(G)、PBS组(阴性对照)、FI-RSV组(阳性对照)。呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗组中根据CSA和G蛋白质量不同又分成(1ugCSA+1ug G蛋白)组、(2ug CSA+10ug G蛋白)组、(4ug CSA+10ug G蛋白)组、(6ug CSA+10ug G蛋白)组、(8ug CSA+10ug G蛋白)组、(10ug CSA+10ugG蛋白)组，如表1所示。
表1、各组疫苗中G蛋白与CSA的质量
将上述各组疫苗分别于第0天、14天对6-8周龄雌性BALB/c小鼠进行背部皮下免疫。PBS组中PBS溶液的剂量100μl、FI-RSV组中FI-RSV灭活疫苗的剂量50μl 5×107TCID病毒量。
二、各组疫苗免疫小鼠后抗体水平检测
分别于免疫0、14、28天后采血检测血清中抗体水平。具体操作如下：
(1)血清分离
将采集到的血液置于37℃温箱放置2小时，待凝集后，置于离心机中，3000rpm离心10分钟，彻底分离血清后，将血清小心吸出，置于-80℃保存。
(2)病毒中和检测
A、将血清置于56℃水浴放置30分钟，使补体充分失活；用含2％的胎牛血清的MEM培养基，按2倍梯度稀释血清，将稀释后的血清加入96孔细胞培养板，每孔75μl。
B、分别加入25μl 104TCID50的RSV病毒悬液，混合均匀，4℃孵育2小时；加入100μl含1.5×104个细胞的Hep-2细胞悬液(MEM+5％胎牛血清)，将细胞置于无菌培养箱中，在37℃、5％CO2条件下培养72h。
C、将孔内的液体小心吸出，PBST洗板3次；加入80％丙酮-PBS溶液，置于4℃孵育15min；将孔内的液体吸出，室温干燥。
D、加入5％脱脂奶粉(PBST)，37℃放置1h，PBST洗板3次。
E、使用3％脱脂奶粉(PBST)，将山羊抗RSV多克隆抗血清稀释5000倍，加入96孔细胞培养板，每孔100μl，37℃放置1小时，PBST洗板3次。
F、每孔加入100μl用3％脱脂奶粉(PBST)稀释2000倍的HRP牛抗山羊IgG，37℃放置1小时，PBST洗板3次。
G、每孔加入100μl的TMB显色液，于37℃避光显色15分钟。
H、每孔加入50μl的0.2mol/L硫酸终止反应。
I、测定出每孔的光密度值(OD450nm/620nm)。中和抗体滴度的判定以至少低于50％阳性对照的光密度值为依据。
结果如图4所示：PBS组小鼠血清中的IgG水平最低，表明基本上不具备免疫效果；FI-RSV组产生了较高的IgG水平；G组以及(10ug G蛋白+10ug CSA)组均产生一定水平的IgG，并且不同比例的呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗产生的IgG水平具有一定差异性。(10ug G蛋白+10ug CSA)组混合免疫小鼠可产生较为理想的高中和抗体滴度。
上述结果表明呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗组能够诱导机体产生很高的体液免疫反应，并且提高哺乳动物的呼吸道合胞病毒特异性IgG抗体水平和哺乳动物的呼吸道合胞病毒特异性中和抗体水平。
实施例3、呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗免疫小鼠后T淋巴细胞扩增的检测
一、各组疫苗免疫小鼠
实验材料：6-8周龄雌性BALB/c小鼠，购自复旦大学实验动物部，为清洁级，分9组，每组5只。实验期间使用无菌水及食物喂养，光照周期为12小时。
实验用疫苗分组及剂量同实施例2中的步骤一。
将上述各组疫苗分别于第0天、14天对6-8周龄雌性BALB/c小鼠进行背部皮下免疫。
二、T淋巴细胞扩增的检测
在上述步骤一末次免疫后的第7天处死小鼠，在无菌条件下，取小鼠脾脏，研碎，用红细胞裂解液除去红细胞，并过尼龙柱除去B细胞制成单细胞悬液(T淋巴细胞)，PBS液洗3次，离心并进行细胞计数，用1640培养基调整细胞浓度到1×106个/ml，每组细胞悬液分3份加入96孔培养板中，每孔细胞总数为4×105个。其中一份加实施例1制备的G抗原(呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G)至终浓度为5mg/ml(实验组)，一份加终浓度为0.1mg/ml PMA(佛波酯)和1mg/mlIon(离子霉素)(阳性对照)，一份加BSA至终浓度为2mg/ml(阴性对照)，培养48h后，每孔加入MTT(四甲基偶氮唑盐)，培养4h后，2000rpm离心5分钟，弃细胞上清，添加100mL DMSO(二甲基亚砜)，37℃温箱放置15min后，酶标仪读取490nm处的OD值，计算刺激指数(stimulated index，SI)，SI＝(实验组OD-培养基OD)/(细胞OD-培养基OD)。其中，实验组OD是指G抗原刺激的细胞读取的OD值；培养基OD是指培养基读取的OD值；细胞OD是指未经G抗原刺激的细胞(阴性对照)读取的OD值。
结果如图4所示：各组为5只实验组内小鼠的平均值±标准差；PBS组基本上刺激T细胞的效应很低，表明如果不联合抗原，几乎不能对T细胞产生明显的刺激；G组和FI-RSV组均产生高水平的刺激T细胞的效应，这表明没有CSA组分都具有较强的细胞免疫效果。另外，呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗中不同比例的CSA和G蛋白具有不同的刺激T细胞的效应作用：(6ug CSA+10ug G蛋白)组和(8ug CSA+10ug G蛋白)组刺激T细胞响应最强，(1ug CSA+1ug G蛋白)组、(2ug CSA+10ug G蛋白)组、(4ug CSA+10ug G蛋白)组都表现出一定的刺激T细胞的效应，(10ug CSA+10ug G蛋白)组刺激T细胞的响应最弱，说明这一配比抑制效应不完全。
以上结果说明可以有效抑制抗原特异性的细胞免疫反应，且能达到中和抗体水平较高的组是呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗中(10ug CSA+10ug G蛋白)组。(10ug CSA+10ug G蛋白)组疫苗可以抑制哺乳动物的呼吸道合胞病毒特异性T淋巴细胞增殖；可以抑制哺乳动物的呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特异性T淋巴细胞增殖。
实施例4、被RSV病毒攻击后的免疫小鼠的肺病毒载量检测
一、各组疫苗免疫小鼠
实验材料：6-8周龄雌性BALB/c小鼠，购自复旦大学实验动物部，为清洁级，分9组，每组5只。实验期间使用无菌水及食物喂养，光照周期为12小时。
实验用疫苗分成呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗组(G+CSA)、CSA组、亚单位疫苗组(G)、PBS组(阴性对照)、FI-RSV组(阳性对照)。呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗组中CSA和G蛋白质量均为10ug，如表2所示，同时以未感染病毒的小鼠(Non-infection)作对照。
表2、各组疫苗中G蛋白与CSA的质量
将上述各组疫苗分别于第0天、14天对6-8周龄雌性BALB/c小鼠进行背部皮下免疫。PBS组中PBS溶液的剂量为100μl、FI-RSV组中FI-RSV灭活疫苗的剂量为50μl 5×107TCID病毒量。
二、被RSV病毒攻击后的免疫小鼠的肺病毒载量
在上述步骤一末次免疫后第7天，通过滴鼻使小鼠感染RSV病毒，RSV病毒量按照6×105TCID50/每只小鼠，5天之后将小鼠处死，取肺组织，匀浆后，使用TCID50滴定法检测小鼠肺部病毒载量。
具体操作如下：在离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1到10-10；将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100μl；在每孔加入细胞悬液100μl，使细胞量达到2×105～3×105个/ml，设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排，即100μl生长液+100μl细胞悬液。逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天；按Karber法计算结果。
小鼠肺部病毒载量如图5所示：PBS组和CSA组小鼠肺部病毒载量最高，说明在没有先前注射疫苗抗原的情况下，小鼠出现了比较严重的病毒感染；FI-RSV组和G组病毒载量有所降低，说明起到了一定抑制病毒复制作用；(G+CSA)组病毒载量最低，与PBS组有显著性差异。
以上结果表明疫苗诱发机体产生的中和抗体水平的强弱直接与病毒感染后的病毒清除相关，疫苗可以降低哺乳动物的呼吸道合胞病毒的病毒载量。
实施例5、被RSV病毒攻击后的免疫小鼠的肺指数检测
一、各组疫苗免疫小鼠
实验材料：6-8周龄雌性BALB/c小鼠，购自复旦大学实验动物部，为清洁级，分9组，每组5只。实验期间使用无菌水及食物喂养，光照周期为12小时。
实验用疫苗分成呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗组(G+CSA)、CSA组、亚单位疫苗组(G)、PBS组(阴性对照)、FI-RSV组(阳性对照)。呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗组中G蛋白和CSA质量均为10ug，如表2所示，同时以未感染病毒的小鼠(Non-infection)作对照。
将上述各组疫苗分别于第0天、14天对6-8周龄雌性BALB/c小鼠进行背部皮下免疫。PBS组中PBS溶液的剂量为100μl、FI-RSV组中FI-RSV灭活疫苗的剂量为50μl 5×107TCID病毒量。
二、被RSV病毒攻击后的免疫小鼠的肺指数检测
在上述步骤一末次免疫后第7天，通过滴鼻使小鼠感染RSV病毒，RSV病毒量按照6×105TCID50/每只小鼠，5天之后将小鼠处死，称量小鼠体重，而后去肺组织称量重量。肺指数计算公式＝肺组织质量/小鼠体重。
结果如图6所示：Non-infection组小鼠肺指数最低，说明肺部没有明显的炎症反应；PBS组和FI-RSV组最高，CSA组和G组相对较低，(G+CSA)组小鼠肺指数与Non-infection组相比没有显著差异，说明发明的RSV疫苗可以有效抑制免疫疫苗引起的炎症相关反应的发生。
三、RSV病毒攻击免疫后小鼠组织切片
在上述步骤一末次免疫后第7天，通过滴鼻使小鼠感染RSV病毒，RSV病毒量按照6×105TCID50/每只小鼠，5天之后将小鼠处死，取肺组织切片，苏木精-伊红染色(H&E)后，观察小鼠肺部组织的病变情况(同时以没有攻毒的小鼠作为对照)。具体操作如下：将小鼠处死后，取肺组织，置于10％福尔马林中固定3-7天，经过脱水，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色，封片几步后，在显微镜下观察。另外，对小鼠肺部病理进行打分，打分标准为：(1)细支气管周围和支气管浸润(2)细支气管和细支气管腔渗出液；(3)血管周围浸润；(4)单核细胞数量；(5)薄壁组织肺炎。以上5种情况又各分为严重(4分)，较重(3分)，一般(2分)，轻微(1分)，具体参见文献“Respiratory Syncytial VirusInduces Pneumonia,Cytokine Response,Airway Obstruction,and ChronicInflammatory Infiltrates Associated with Long-Term Airway Hyperresponsiveness inMice”。
结果如图7所示：Non-infection组小鼠肺部在血管周围和支气管周围没有明显的淋巴细胞浸润，支气管腔未见明显渗出液残留，未见薄壁组织肺炎，说明肺部没有病变的发生；PBS组、FI-RSV组、CSA组和G组小鼠肺部均出现不同程度的病变。特别是FI-RSV组和G组的病变情况最严重；说明注射这类疫苗后，当机体再次遇到病毒感染，肺部会出现较严重的病理反应；与其他组相比，(G+CSA)组小鼠肺部没有出现明显的病理反应。
以上结果说明呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗组对小鼠产生了较好的保护效果，可以抑制哺乳动物的肺部炎性细胞的增殖和侵润，降低呼吸道合胞病毒对哺乳动物肺部组织的损伤。
实施例6、被RSV病毒攻击后的免疫小鼠的脾脏，淋巴结，肺部灌洗液中的iTreg百分率检测
一、各组疫苗免疫小鼠
实验材料：6-8周龄雌性BALB/c小鼠，购自复旦大学实验动物部，为清洁级，分9组，每组5只。实验期间使用无菌水及食物喂养，光照周期为12小时。
实验用疫苗分成呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗组(G+CSA)、CSA组、亚单位疫苗组(G)、PBS组(阴性对照)、FI-RSV组(阳性对照)。呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗组中G蛋白和CSA质量均为10ug，如表2所示，同时以未感染病毒的小鼠(Non-infection)作对照。
将上述各组疫苗分别于第0天、14天对6-8周龄雌性BALB/c小鼠进行背部皮下免疫。PBS组中PBS溶液的剂量为100μl、FI-RSV组中FI-RSV灭活疫苗的剂量为50μl 5×107TCID病毒量。
二、脾脏、淋巴结及肺部灌洗液中的iTreg百分率的检测
在上述步骤一末次免疫后第7天，通过滴鼻使小鼠感染RSV病毒，RSV病毒量按照6×105TCID50/每只小鼠，对病毒感染4天后小鼠以60μg/kg的计量，腹腔注射1％戊巴比妥钠将小鼠麻醉。小心切开气管，用注射器将1ml含0.2％胎牛血清的PBS溶液灌入肺内，反复轻柔推送冲洗，离心收集细胞；分离小鼠肺门淋巴结与脾脏，研磨后制成单细胞悬液；按照Foxp3/Transcription FactorStaining Buffer Set使用说明对单细胞悬液进行染色，通过流式细胞仪检测。
1、小鼠脾脏的结果如图8a所示：Non-infection组、PBS组、CSA组、G组以及FI-RSV组的Treg百分率较低，而(G+CSA)组iTreg的百分率较高。说明呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗组可以增加Treg在脾脏中的比例。
2、小鼠肺门淋巴结结果如图8b所示：Non-infection、PBS组、CSA组、G组、FI-RSV组和(G+CSA)组均没有显著性差异。
3、肺部灌洗液中的结果如图9所示：Non-infection组、PBS组、CSA组、G组以及FI-RSV组Treg百分率较低，而(G+CSA)组iTreg的百分率较高。此结果与脾脏结果一致，说明呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗组可以增加Treg在肺部灌洗液中的比例。
实施例7、被RSV病毒攻击后的免疫小鼠的脾脏和肺门淋巴结Treg细胞分泌IL-10、IL-21以及CD40L情况的检测
一、各组疫苗免疫小鼠
实验材料：6-8周龄雌性BALB/c小鼠，购自复旦大学实验动物部，为清洁级，分9组，每组5只。实验期间使用无菌水及食物喂养，光照周期为12小时。
实验用疫苗分成呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗组(G+CSA)、CSA组、亚单位疫苗组(G)、PBS组(阴性对照)、FI-RSV组(阳性对照)。呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗组中G蛋白和CSA质量均为10ug，如表2所示，同时以未感染病毒的小鼠(Non-infection)作对照。
将上述各组疫苗分别于第0天、14天对6-8周龄雌性BALB/c小鼠进行背部皮下免疫。PBS组中PBS溶液的剂量为100μl、FI-RSV组中FI-RSV灭活疫苗的剂量为50μl 5×107TCID病毒量。
二、流式检测免疫攻毒小鼠后脾脏和肺门淋巴结Treg细胞分泌IL-10、IL-21以及CD40L
在上述步骤一末次免疫后第7天，通过滴鼻使小鼠感染RSV病毒，RSV病毒量按照6×105TCID50/每只小鼠，对病毒感染4天后小鼠以60μg/kg的计量，腹腔注射1％戊巴比妥钠将小鼠麻醉。小心切开气管，用注射器将1ml含0.2％胎牛血清的PBS溶液灌入肺内，反复轻柔推送冲洗，离心收集细胞；分离小鼠肺门淋巴结与脾脏，研磨后制成单细胞悬液；按照Foxp3/Transcription FactorStaining Buffer Set使用说明对单细胞悬液进行染色，流式细胞仪检测。
在脾脏中iTreg细胞分泌IL-10，IL-21，CD40L的结果如图10所示：Non-infection组、PBS组、CSA组、G组以及FI-RSV组Treg分泌IL-10较少，而仅有(G+CSA)组Treg的较多。此外(G+CSA)组Treg细胞分泌IL-21，CD40L均比其他组高，并且具有显著性差异。
在肺门淋巴结中Treg细胞分泌IL-10，CD40L的结果如图11所示：Non-infection组、PBS组、CSA组、G组Treg分泌IL-10较少，FI-RSV组分泌较多IL-10，(G+CSA)组分泌IL-10最多。CD40L与IL-10结果一致。
以上结果说明呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗组能够分泌更多负调控因子抑制攻毒后的细胞因子风暴。诱导哺乳动物的呼吸道合胞病毒特异性调节性T细胞的产生；诱导哺乳动物的呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特异性调节性T细胞的产生。
实施例8、呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗在中型动物中免疫效果评价
一、呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗免疫兔子实验
实验材料：3-4kg兔子，购自复旦大学实验动物部，为清洁级，分9组，每组5只。实验期间使用无菌水及食物喂养，光照周期为12小时。
免疫用疫苗及对照如下表所示，分别在第0天和第14天皮下免疫，在第28天通过耳缘静脉采血。免疫分组及剂量见表3，其中PBS组中PBS溶液的剂量为100μl、FI-RSV组中FI-RSV灭活疫苗的剂量为50μl 5×107TCID病毒量。
表3、RSV疫苗在中型动物中免疫效果评价动物免疫分组
二、ELISA检测抗体水平
方法同实施例2的二。
抗体结果如图12a所示：在第28天亚单位疫苗组，(G+CSA)组和(G+CSA)10X组抗体水平均有升高；在第64天(G+CSA)组IgG抗体滴度比其他对照组明显升高；在第110天各组均回到较低抗体滴度值，经过攻毒后仅有(G+CSA)组和(G+CSA)10X组抗体水平有所回升，其他组没有回升情况。
三、T细胞增殖实验检测T细胞增殖情况。
方法同实施例3的二。
T细胞增殖情况如图12b所示：CSA组和(G+CSA)组T细胞增殖比例最低，PBS组、FI-RSV组和(G+CSA)10x组增殖比例相对增高，G组增殖比例最显著。FI-RSV组和(G+CSA)组间有显著性差异。
以上结果证明呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗组是抗体水平相对较高，T细胞增殖比例最低的一组，是最佳疫苗选择。同时也说明呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗组可以提高哺乳动物的呼吸道合胞病毒特异性IgG抗体水平；抑制哺乳动物的呼吸道合胞病毒特异性T淋巴细胞增殖。
实施例9、呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗在灵长动物中免疫效果评价
一、呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗免疫恒河猴实验
实验材料：成年恒河猴，用无菌水及食物喂养，光照周期为12小时。
免疫用疫苗如下表4所示，分别在第0天和第14天皮下免疫，在第28天通过静脉采血。免疫分组见表。FI-RSV组中FI-RSV灭活疫苗的剂量为50μl 5×107TCID病毒量。
表4、RSV疫苗在灵长动物中免疫效果评价动物免疫分组
二、T细胞增殖实验检测T细胞增殖情况
方法同实施例3的二。
T细胞增殖情况如图13所示：(G+CSA)组T细胞增殖水平相比较于G组与FI-RSV组明显较低。说明(G+CSA)组是T细胞增殖比例最低的一组，是最佳疫苗。
实施例10、不同种疫苗间相互干扰模拟实验
一、呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗免疫小鼠的实验
实验材料：6-8周龄雌性BALB/c小鼠，购自复旦大学实验动物部，为清洁级，分9组，每组5只。实验期间使用无菌水及食物喂养，光照周期为12小时。
免疫用疫苗及对照：PBS组、HBV疫苗(HBV)、呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗和HBV疫苗同时免疫组(HBV+RSV)、呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗和HBV疫苗分别免疫组(HBV(-7)+RSV)。实验分组及各组的免疫情况如图14a所示。PBS组中PBS溶液的剂量为100μl；HBV疫苗的剂量为1ug；呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗组中G蛋白和CSA质量均为10ug。
二、通过ELISA方法检测两种疫苗间的相互干扰作用
将混合有经高温灭活处理的RSV的抗原或G蛋白(2ug/ml)包被液，按照每孔100μl加入96孔ELISA板，置于37℃温箱中放置2小时。PBST洗板3次。加入5％脱脂奶粉(PBST)，37℃放置1小时，PBST洗板3次。使用2％脱脂奶粉(PBST)，将免疫后小鼠或兔血清按2倍梯度稀释，加入96孔ELISA板，每孔100μl，37℃放置1小时，PBST洗板3次。每孔加入100μl用2％脱脂奶粉(PBST)稀释3000倍的HRP标记山羊抗小鼠IgG，37℃放置1小时，PBST洗板3次。每孔加入100μl TMB显色液，于37℃避光显色10分钟。每孔加入50μl 0.2mol/L硫酸终止反应。于OD450nm/620nm测定出每孔的光密度值。抗体滴度的判定以至少大于2倍阴性血清的光密度值为依据。
结果如图14b所示：PBS组抗HBsAg IgG抗体水平几乎为零，因为没有免疫疫苗所以不产生抗体，此组作为阴性对照；HBV组、(HBV+RSV)组及(HBV(-7)+RSV)组都具有抗HBsAg IgG抗体，特别是(HBV+RSV)组抗体水平相对较高，但是这三组之间没有显著性差异。
以上结果说明RSV疫苗对HBV疫苗产生抗体没有负影响。
Claims (10)
1.一种呼吸道合胞病毒疫苗，其活性成分为呼吸道合胞病毒G蛋白和免疫抑制剂；
所述呼吸道合胞病毒G蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
2.根据权利要求1所述的呼吸道合胞病毒疫苗，其特征在于：所述免疫抑制剂为环孢菌素A、地塞米松、雷帕霉素或环磷酰胺；所述免疫抑制剂具体为环孢菌素A；
所述呼吸道合胞病毒G蛋白和所述环孢菌素A的质量比为1:100-100:1。
3.根据权利要求1或2所述的呼吸道合胞病毒疫苗，其特征在于：所述呼吸道合胞病毒G蛋白和所述环孢菌素A的质量比为1:1、2:10、4:10、6:10、8:10。
4.根据权利要求1-3中任一所述的呼吸道合胞病毒疫苗，其特征在于：所述呼吸道合胞病毒G蛋白和所述环孢菌素A的质量比进一步具体为1:1。
5.一种制备呼吸道合胞病毒疫苗的方法，包括如下步骤：
将环孢素A溶液与呼吸道合胞病毒G蛋白混匀，得到呼吸道合胞病毒疫苗；
所述呼吸道合胞病毒G蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述环孢素A溶液中的环孢素A与所述呼吸道合胞病毒G蛋白质量比为1:100-100:1。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述环孢素A溶液中的环孢素A与呼吸道合胞病毒G蛋白的质量比具体为1:1、2:10、4:10、6:10、8:10。
8.根据权利要求5-7中任一所述方法，其特征在于：所述环孢素A溶液的制备方法：将环孢素A溶于丙二醇中，得到混合液；将所述混合液与PBS溶液等体积混匀，得到所述环孢素A溶液；
所述环孢素A溶液中环孢素A的浓度为0.2mg/ml。
9.呼吸道合胞病毒G蛋白在制备呼吸道合胞病毒的疫苗中的应用；
或呼吸道合胞病毒G蛋白和免疫抑制剂在制备呼吸道合胞病毒的疫苗中的应用；
所述呼吸道合胞病毒G蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示；
所述免疫抑制剂为环孢菌素A。
10.权利要求1-4中任一所述的呼吸道合胞体病毒疫苗在如下(1)-(12)中至少一种中的应用：
(1)制备提高哺乳动物的呼吸道合胞病毒特异性IgG抗体水平的产品；
(2)制备提高哺乳动物的呼吸道合胞病毒特异性中和抗体水的产品；
(3)制备抑制哺乳动物的呼吸道合胞病毒特异性T淋巴细胞增殖的产品；
(4)制备抑制哺乳动物的呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特异性T淋巴细胞增殖的产品；
(5)制备诱导哺乳动物的呼吸道合胞病毒特异性调节性T细胞的产生的产品；
(6)制备诱导哺乳动物的呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特异性调节性T细胞的产生的产品；
(7)制备促进哺乳动物的呼吸道合胞病毒特异性调节性T细胞分泌IL10、IL21和/或CD40L的产品；
(8)制备促进哺乳动物的呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特异性调节性T细胞分泌IL10、IL21和/或CD40L的产品；
(9)制备降低哺乳动物的呼吸道合胞病毒的病毒载量的产品；
(10)制备抑制哺乳动物的肺部炎性细胞的增殖的产品；
(11)制备降低呼吸道合胞病毒对哺乳动物肺部组织的损伤的产品；
(12)制备抑制哺乳动物的炎症反应的产品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510082407.8A CN105983095B (zh) | 2015-02-15 | 2015-02-15 | 一种呼吸道合胞体病毒疫苗及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510082407.8A CN105983095B (zh) | 2015-02-15 | 2015-02-15 | 一种呼吸道合胞体病毒疫苗及其制备方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105983095A true CN105983095A (zh) | 2016-10-05 |
| CN105983095B CN105983095B (zh) | 2019-09-13 |
Family
ID=57042397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510082407.8A Active CN105983095B (zh) | 2015-02-15 | 2015-02-15 | 一种呼吸道合胞体病毒疫苗及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105983095B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111494620A (zh) * | 2020-05-05 | 2020-08-07 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 曲美替尼在制备疫苗中的应用 |
| CN113694177A (zh) * | 2020-04-15 | 2021-11-26 | 睿诺医疗科技（上海）有限公司 | 器官损伤的预防和治疗 |
| US11666650B2 (en) * | 2019-08-12 | 2023-06-06 | Advaccine (Suzhou) Biopharmaceuticals Co. Ltd. | Immune composition comprising respiratory syncytial virus (RSV) G polypeptide |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101264323A (zh) * | 2007-12-19 | 2008-09-17 | 昆明理工大学 | 呼吸道合胞病毒亚单位疫苗、制备方法和应用 |
| CN103239734A (zh) * | 2012-02-10 | 2013-08-14 | 北京艾棣维欣生物技术有限公司 | 用于预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的疫苗 |
| CN104870007A (zh) * | 2012-10-19 | 2015-08-26 | 西尼克斯公司 | 新的抗病毒大环化合物 |
-
2015
- 2015-02-15 CN CN201510082407.8A patent/CN105983095B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101264323A (zh) * | 2007-12-19 | 2008-09-17 | 昆明理工大学 | 呼吸道合胞病毒亚单位疫苗、制备方法和应用 |
| CN103239734A (zh) * | 2012-02-10 | 2013-08-14 | 北京艾棣维欣生物技术有限公司 | 用于预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的疫苗 |
| CN104870007A (zh) * | 2012-10-19 | 2015-08-26 | 西尼克斯公司 | 新的抗病毒大环化合物 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11666650B2 (en) * | 2019-08-12 | 2023-06-06 | Advaccine (Suzhou) Biopharmaceuticals Co. Ltd. | Immune composition comprising respiratory syncytial virus (RSV) G polypeptide |
| CN113694177A (zh) * | 2020-04-15 | 2021-11-26 | 睿诺医疗科技（上海）有限公司 | 器官损伤的预防和治疗 |
| CN111494620A (zh) * | 2020-05-05 | 2020-08-07 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 曲美替尼在制备疫苗中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105983095B (zh) | 2019-09-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Focosi et al. | Mucosal vaccines, sterilizing immunity, and the future of SARS-CoV-2 virulence | |
| CN104293741A (zh) | 一种呼吸道合胞病毒病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用 | |
| McLean | Developing a vaccine for human rhinoviruses | |
| WO2007068154A1 (en) | A method for preparing specific igy against mutant avian influenza virus and the preparation tηereof | |
| Pérez de la Lastra et al. | Can immunization of hens provide oral-based therapeutics against COVID-19? | |
| CN101787080A (zh) | 一种抗甲型h1n1流感病毒特异性鸡卵黄抗体制备方法 | |
| CN105983095A (zh) | 一种呼吸道合胞体病毒疫苗及其制备方法与应用 | |
| CN109207417A (zh) | 鸡白痢-j亚群禽白血病双重平板凝集抗原及其制备方法 | |
| da Silva et al. | Exploring the potential usefulness of IgY for antiviral therapy: A current review | |
| CN105198989A (zh) | 抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体及其制备方法 | |
| Zahmanova et al. | The Re-Emergence of Hepatitis E Virus in Europe and Vaccine Development | |
| CN104725503B (zh) | 一种红鳍东方鲀神经坏死病毒衣壳蛋白卵黄抗体及其应用 | |
| Bidokhti et al. | Immunogenicity and efficacy evaluation of subunit astrovirus vaccines | |
| CN103468647B (zh) | 猪流感h1n1和h3n2亚型的二价灭活疫苗 | |
| Zhang et al. | Comparison of protection against H5N1 influenza virus in mouse offspring provided by maternal vaccination with HA DNA and inactivated vaccine | |
| CN102735807B (zh) | 一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的效力检验方法 | |
| CN102058881A (zh) | 预防肠道病毒71型感染的基因重组疫苗及其制备方法 | |
| Gao et al. | Enterovirus type 71‑immunized chicken egg yolk immunoglobulin has cross antiviral activity against coxsackievirus A16 in vitro | |
| CN103789272B (zh) | H9亚型禽流感病毒分离株以及由其制得的疫苗组合物 | |
| US20210113683A1 (en) | Immune composition comprising respiratory syncytial virus (rsv) g polypeptide | |
| CN102850454B (zh) | 抗呼吸道合胞病毒的人单克隆抗体 | |
| CN106397546A (zh) | 一种o型口蹄疫病毒人工重组抗原及其制备与应用 | |
| CN104402995A (zh) | 抗流感病毒鸡卵黄抗体的制备方法及应用 | |
| CN104402996A (zh) | 一种抗甲型h3n2流感病毒特异性鸡卵黄抗体的制备方法 | |
| CN105259347A (zh) | 一种肠道病毒71的检测方法及其试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20190805 Address after: 215000 Bio-nano Park Bl Building 512, 218 Xinghu Street, Suzhou Industrial Park, Jiangsu Province Applicant after: Aidi Weixin (Suzhou) Biopharmaceutical Co., Ltd. Address before: Room 1013Z05, 10th floor, 26 Shangdi Information Road, Haidian District, Beijing, 100085 Applicant before: Beijing Aidi Weixin Biological Technology Co., Ltd. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210624 Address after: 512, B1 / F, bio nano Park, 218 Xinghu street, Suzhou Industrial Park, 215000, Jiangsu Province Patentee after: ADVACCINE (SUZHOU) BIOPHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Patentee after: FUDAN University Address before: 512, BL building, bio nano Park, 218 Xinghu street, Suzhou Industrial Park, 215000, Jiangsu Province Patentee before: ADVACCINE (SUZHOU) BIOPHARMACEUTICAL Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |