CN101787080A - 一种抗甲型h1n1流感病毒特异性鸡卵黄抗体制备方法 - Google Patents

一种抗甲型h1n1流感病毒特异性鸡卵黄抗体制备方法 Download PDF

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赵肃清
刘端
苏娟
朱屋彪
张焜
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Guangdong University of Technology
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Guangdong University of Technology
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Abstract

本发明公开了一种抗甲型H1N1流感病毒特异性鸡卵黄抗体的制备及其分离方法，该抗体可由下述方法制备：1.通过基因表达甲型H1N1流感病毒的HA片段，获得针对甲型H1N1流感的抗原；2.用制得的甲型H1N1流感抗原对产蛋母鸡进行注射免疫，获得抗甲型H1N1流感免疫蛋：3.提取抗H1N1特异性卵黄抗体粗品，并对粗品进行纯化、过滤处理后，即制得抗H1N1流感病毒特异性鸡卵黄抗体(lmmunoglobulin of Egg Yolk，IgY)成品。所得的抗H1N1流感卵黄抗体成本低、产量高、具有高特异性，利用这些特异性IgY可以制成各种具有预防、治疗甲型H1N1流感功效的制剂。

Description

一种抗甲型H1N1流感病毒特异性鸡卵黄抗体制备方法
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，涉及一种抗甲型H1N1流感病毒特异性鸡卵黄抗体IgY的制备方法。
背景技术
2009年4月下旬，WHO宣布出现一种以前在人群中没有流行过的新流感病毒，即甲型H1N1流感病毒。甲型H1N1流感是由变异后的新型甲型H1N1流感病毒所引起的急性呼吸道传染病，从加利福尼亚州的一名患者分离出的病毒经过遗传分析，得知该病毒毒株包含有猪流感、离流感和人流感三种流感病毒的基因片断。[中华人民共和国卫生部.甲型H1N1流感诊疗方案(2009年试行版第一版)]。H1N1是Orthomyxoviridae系列的一种病毒，主要通过飞沫或气溶胶经呼吸道传播，也可通过口腔、鼻腔、眼睛等处黏膜直接或间接接触传播。接触患者的呼吸道分泌物、体液和被病毒污染的物品亦可造成传播。由于H1N1可直接感染人，导致人类患病或死亡，其公共卫生意义日渐显著。加强对H1N1的研究，在减少世界经济损失和提高人类卫生健康方面，都具有深远的意义。
目前对于H1N1的预防、治疗方法，世界各个国家普遍采用隔离疑似者或是感染者的方式，但是感染者通常在症状出现之前就已经在排毒，如果流行范围广的话，此方法的作用效果会降低；体温检测等方法也只是对于表现出症状的感染者具有一定效果，很难发现病毒携带者。试验证明神经氨酸酶抑制剂对A、B型流感均有抑制作用。目前已经上市的有奥司米韦和扎那米韦，两者都具有明显的抗病毒活性，当前流行的这种新型H1N1流感病毒对于神经氨酸酶抑制剂类的约物是敏感的，但是此类药物有明显的中枢神经系统副作用，在日本就曾经出现过奥司米韦用药者精神错乱的不良反应；而且可能导致突变压力进一步产生耐药性毒株。因此研发一种有效预防、治疗H1N1流感的新型药物成为世界医药卫生领域的一个新的课题和挑战。
目前深圳雅臣生物科技有限公司公开了一种抗甲型H1N1流感病毒特异性IgY的制备方法，专利申请号为200910107224.1，该专利是通过提取纯化H1N1流感疫苗，获得H1N1流感病毒复合抗原，而本发明是通过表达H1N1的HA基因片段得到该基因的相关蛋白质作为抗原，采用乙酸-乙酸钠缓冲液、聚乙二醇6000和硫酸铵溶液，三步法提取纯化制得抗甲型H1N1流感病毒特异性鸡卵黄抗体。
发明内容
本发明涉及一种抗甲型H1N1流感病毒特异性鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于：通过表达H1N1的HA基因片段得到该基因的相关蛋白质作为抗原；用该抗原注射免疫产蛋母鸡，获得抗甲型H1N1流感免疫蛋；提取抗H1N1特异性卵黄抗体粗品，并对粗品进行纯化处理后，制得抗甲型H1N1流感特异性IgY纯品：对所述抗甲型H1N1流感特异性IgY纯品进行过滤处理，以滤除各种细菌和病毒，得到抗甲型H1N1流感特异性IgY成品。
本发明所制备的鸡卵黄抗体，具有安全方便、简单易得、产量高、不与IgG发生交叉血清学反应；且耐热、耐酸，巴氏灭菌温度下不会失活且在pH值小于3时也能保持稳定活性，这些独特的优点使鸡卵黄抗体在临床和基础科学的应用中起着重要的作用。因此卵黄抗体在医学领域的应用越来越受到人类的关注，抗甲型H1N1流感病毒卵黄抗体的研制对H1N1流感的预防与治疗具有重要意义。
具体实施方式
下面的实施例进一步说明本发明。
实施方式一：抗甲型H1N1流感病毒特异性鸡卵黄抗体的制备
(1)甲型H1N1流感病毒抗原的制备
查得GenBank中H1N1的HA氨基酸序列为ACP41934，通过基因表达甲型H1N1流感病毒的HA片段，获得针对甲型H1N1流感的抗原。将冷冻干燥的抗原用0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS(pH＝7.2)稀释成1mg/ml，并且与福氏佐剂按照1∶1(V/V)充分乳化后制得免疫抗原。
(2)用甲型H1N1流感病毒抗原免疫母鸡
取20周龄产蛋母鸡10只，将乳化好的H1N1抗原经鸡双翼或胸肌多点注射；首次免疫采用福氏完全佐剂，其余采用福氏不完全佐剂；首次免疫前收集未免疫蛋作为阴性对照品，10天后免疫第二次，以后每隔9天免疫一次，每次免疫剂量为0.5ml/只：第二次免疫20天后收集鸡蛋，连续收集2个月(收集的鸡蛋编号)，存放于4℃。
(3)抗甲型H1N1流感特异性IgY的提纯
敲破获得的抗甲型H1N1流感免疫蛋，去除蛋清及蛋黄膜，留取蛋黄部分，测定所收集的蛋黄体积，边磁力搅拌边加入PH为5.0，0.05mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液，体积为蛋黄体积的9倍，充分搅拌后，4℃条件下静置过夜，6000r/min离心20min，取上清液，并用纱布过滤，测定滤液的体积；
在上述的滤液中稍慢速度搅拌下加入40％的聚乙二醇6000，(640g聚乙二醇6000溶于磷酸盐缓冲液中，定容1600ml)，体积为滤液体积的0.3倍，充分搅拌半个小时后，将此混合物分装于10ml离心管中，置于高速冷冻离心机中，在10℃下以9690r/min，离心30min，倾去上清液，沉淀部分即为抗甲型H1N1流感病毒特异性卵黄抗体IgY粗提物；
用0.8％磷酸盐缓冲液PBS济解沉淀至上清液初体积，再在缓慢搅拌下加入初体积一半的饱和度为33％的硫酸铵溶液，静置1h，再次离心，弃去上清液，将沉淀部分在-60℃下真空冷冻干燥12h，上粉成品即为制得抗甲型H1N1流感病毒特异性鸡卵黄抗体纯品；
将抗甲型H1N1流感特异性IgY纯品进行过滤处理，以滤除各种细菌和病毒，得到抗甲型H1N1流感特异性IgY成品，将所制得的IgY成品分装后于-20℃保存。
实施方式二：抗甲型H1N1流感病毒特异性IgY的检测
应用SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶)电泳测定法，对以上工艺所制取的抗甲型H1N1流感病毒特异性IgY的粗提物进行检测，使用5％浓缩胶，15％分离胶，结果含IgY 45-56％。IgY粗提物经过饱和度为33％的硫酸铵盐析纯化，经SDS-PAGE分析，纯度达到90-95％。
实施方式三：抗甲型H1N1流感病毒特异性IgY的效价检测
采用“ELISA法”(酶联免疫吸附试验)检测本发明工艺制取的抗甲型H1N1流感病毒特异性IgY的效价。检测结果表明，抗甲型H1N1流感病毒特异性IgY的效价达到了1∶2560。

Claims (3)

1.一种制备抗甲型H1N1流感病毒特异性IgY的方法，其特征在于，查得GenBank中H1N1的HA氨基酸序列为ACP41934，通过基因表达甲型H1N1流感病毒的HA片段，获得针对甲型H1N1流感的抗原。
2.将上述步骤(1)中所获得的抗原用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PhosphateBuffered Saline，PBS pH＝7.2)稀释，并且与福氏佐剂按照1∶1(V/V)充分乳化后制得免疫抗原。用乳化好的抗原双翼或胸肌多点注射免疫20周龄产蛋母鸡；首次免疫采用福氏完全佐剂，其余采用福氏不完全佐剂；首次免疫前收集未免疫蛋作为阴性对照品，10-12天后免疫第二次，以后每隔7-10天免疫一次，每次免疫剂量为0.4-0.6ml/只；第二次免疫20天后收集鸡蛋，连续收集2个月(收集的鸡蛋编号)，存放于4℃。
3.将获得的抗甲型H1N1流感免疫蛋，去除蛋清及蛋黄膜，留取蛋黄部分，通过乙酸-乙酸钠缓冲液法获得水溶性组分，并用40-50％聚乙二醇6000(polyethylene glycol 6000，PEG6000)提取获得卵黄抗体粗提物；上述粗提物用饱和度为30-33％的硫酸铵溶液或140g/L的硫酸钠溶液进行纯化后，得到抗甲型H1N1流感病毒特异性IgY成品，将所制得的IgY成品冻干分装后于-20℃保存。
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