CN104497138A - 抗手足口病病毒鸡卵黄抗体的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗手足口病病毒鸡卵黄抗体，同时公开了其制备方法，通过制备手足口病病毒复合免疫抗原、免疫产蛋母鸡，获得免疫鸡蛋、从免疫鸡蛋蛋黄液提取抗手足口病病毒鸡卵黄抗体粗品，并对粗品进行超滤纯化、除菌过滤、超低温喷雾干燥处理后，制得抗手足口病病毒鸡卵黄抗体。该产品成本低、产量高、具有高特异性，可实现产业化。本发明还提供了所述的抗手足口病病毒鸡卵黄抗体在各种消毒喷雾剂、湿巾、免洗洗手液及免疫检测试剂中的应用。

Description

抗手足口病病毒鸡卵黄抗体的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物免疫学技术领域，具体涉及一种抗手足口病病毒鸡卵黄抗体的制备方法及应用。

背景技术

手足口病（Hand-foot-mouth disease, HFMD）又名发疹性水疱口腔炎，是由一组肠道病毒引起的常见传染病，临床表现以发热和手、足、口腔等部位的疱疹为主要临床特征的一种急性传染病。该病全年均可发病，多发于夏秋季，以粪口传播途径为主，也可通过接触或呼吸道传染。手足口病的易感人群基本是五岁以下儿童，并容易引起重症和死亡，严重威胁儿童健康。2008年我国首次将手足口病纳入法定传染病。自2008年安徽阜阳暴发手足口病疫情以来，手足口病已引起全国范围内的流行。

引起手足口病的病原主要是隶属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属的肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组（CA）的4、5、7、9、10、16型。其中，EV71和CA16是手足口病的主要致病病毒，历年全世界出现的手足口病大爆发都是EV71感染和CA16感染交替或合并引起。

研究发现手足口病病人可以通过呼吸道分泌物、疱疹液和粪便排泄病毒，而且经呼吸道和肠道排毒的最长时间分别达4周和6周，而且该病主要侵犯5岁以下的儿童，儿童个人卫生行为难以控制，隔离也比较困难，这给手足口病的预防带来了困难，所以研制预防用产品和疫苗是防控手足口病的重要手段。

体外用的特异性预防性产品应成为预防手足口病的首选，特别是手足口病主要通过呼吸道、接触和粪口途径传播，研制一种能够特异地在体外抑制EV71和CA16病毒活性和感染性的抗体产品将能有效阻断病毒的传播，对于防止和减少手足口病的发生具有重大意义，同时也具有广阔的市场前景。

鸡卵黄抗体具有安全方便、简单易得、产率高、成本低、特异性强、不与IgG 发生交叉血清学反应；且性能稳定，活性保持良好等优点，正成为医药领域的新热点，具有广阔的应用前景。因此抗手足口病病毒鸡卵黄抗体的研制对手足口病的预防具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对上述手足口病病毒感染难以预防和治疗的问题，提供一种安全、有效的主动性预防手足口病的抗手足口病病毒鸡卵黄抗体。

本发明的另一个目的是提供所述抗手足口病病毒鸡卵黄抗体的制备方法。

本发明还有一个目的是利用抗手足口病病毒鸡卵黄抗体，可以制成各种预防手足口病的制剂，包括各种消毒喷雾剂、湿巾、免洗洗手液等，以及在制备免疫检测试剂中的应用。

本发明采用如下技术方案：制备EV71和CA16病毒，确定其TCID50值，稀释后等比例混合、乳化制成手足口病病毒复合免疫抗原；用该抗原注射免疫产蛋母鸡，获得免疫鸡蛋；将获得的免疫鸡蛋消毒、去除蛋清及蛋黄膜，留取蛋黄部分，通过水稀释法提取、离心分离获得水溶性组分，并用聚乙二醇6000或硅藻土提取获得抗手足口病病毒鸡卵黄抗体粗品；将粗品用纯化水溶解后，进行超滤纯化，截留相对分子量30KD~150KD滤液；将超滤截留液进行除菌过滤，再经过超低温喷雾干燥，制得抗手足口病病毒鸡卵黄抗体成品，4℃保存。并进行纯度、活性检测。

具体实施方式

下面的实施实例进一步说明本发明。

实施方式一：抗手足口病病毒鸡卵黄抗体的制备。

（1）手足口病病毒的制备：分别将EV71和CA16 病毒株接种到生长至单层的横纹肌肉瘤细胞RD 细胞中，CO₂ 培养箱中培养至细胞出现细胞病变CPE++++ 时收获，﹣20 ℃ 冻融3次，离心分离，加入PBS 稀释纯化后病毒液，确定EV71和CA16的TCID50值，56℃高温灭活30min，4℃保存。

（2）手足口病病毒复合免疫抗原的制备：根据TCID50值，将上述EV71和CA16 病毒分别用0.01mol/L 磷酸盐缓冲液PBS（pH=7.2）进行稀释，取等量稀释好的EV71和CA16 病毒进行等比例混合，并与弗氏完全佐剂按照1:1(V/V) 充分乳化后制得免疫抗原。

（3）用手足口病病毒复合免疫抗原免疫产蛋母鸡：取健康适龄的产蛋母鸡，在鸡双翅轴骨头下的臂三角肌、背部等位置用乳化好的复合免疫抗原进行肌肉、皮下多点注射，以使蛋鸡产生更好的免疫反应；首次免疫采用弗氏完全佐剂，其余采用弗氏不完全佐剂；首次免疫前收集未免疫鸡蛋作为阴性对照品，21天后免疫第二次，以后每隔21天免疫一次，每次免疫剂量为0.2~1ml/只，共免疫4~6次；用ELISA 跟踪检测免疫鸡蛋中抗手足口病病毒鸡卵黄抗体的效价，收集高效价免疫鸡蛋（1:1024），将每日收集的免疫鸡蛋编号，4℃下保存。

（4）抗手足口病病毒鸡卵黄抗体的提取和纯化。

S1将获得的免疫鸡蛋用0.1%新洁尔灭消毒，纯化水冲洗干净，敲破，去除蛋清及蛋黄膜，留取蛋黄部分，测定所收集的蛋黄体积，水稀释法提取：按比例1：6~12比例加入纯化水，用1mol/L 盐酸溶液调节PH为5.2~5.6，4℃条件下静置过夜，6000~10000r/min离心，取上清液，测定所收集上清液的体积。

S2在S1步骤制得的上清液中稍慢速度搅拌下加入PEG6000或者硅藻土，充分搅拌后，置于高速冷冻离心机中，在10℃下以6000~10000r/min r/min，离心，倾去上清液，沉淀部分即为抗手足口病病毒鸡卵黄抗体粗品。

 S3用纯化水溶解S2步骤制得的粗品至上清液初体积，用超滤膜进行超滤浓缩，超滤截留相对分子量为30KD~150KD滤液，将超滤截留液进行除菌过滤，即可制得抗手足口病病毒鸡卵黄抗体纯品。

S4 抗手足口病病毒鸡卵黄抗体纯品进行超低温喷雾干燥，即制得抗手足口病病毒鸡卵黄抗体，4℃保存。

实施方式二：抗手足口病病毒鸡卵黄抗体的纯度检测。

采用醋酸纤维膜电泳分离并测定抗流感病毒鸡卵黄抗体纯度，醋酸纤维膜电泳是以醋酸纤维膜为支持物的电泳方法。醋酸纤维膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一泡沫样的结构，厚度仅120微米，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速，样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点，目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白、同工酶的分离和鉴定。检测结果表明：纯度≥40%。

实施方式三：抗手足口病病毒鸡卵黄抗体的ELISA效价活性检测。

采用“ELISA法”（酶联免疫吸附试验）检测本发明的工艺制取的抗流感病毒鸡卵黄抗体的ELISA效价。检测结果表明，效价达到了1:1280。

实施方式四：抗手足口病病毒鸡卵黄抗体的应用。

利用抗手足口病病毒鸡卵黄抗体，可以制成各种预防手足口病的制剂，包括各种消毒喷雾剂、湿巾、免洗洗手液等；在制备免疫检测试剂中的应用，具体包括：免疫电泳、ELISA、免疫沉淀、免疫印迹、抗体芯片、时间分辨荧光免疫分析和免疫细胞学等一系列免疫诊断技术，用以检测相应的手足口病抗原。

Claims (2)

1.一种抗手足口病病毒鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）手足口病病毒复合免疫抗原的制备：

制备出EV71和CA16 病毒，确定其TCID50值，进行病毒灭活；根据TCID50值，将EV71和CA16 病毒分别用0.01mol/L 磷酸盐缓冲液PBS（pH=7.2）进行稀释，取等量稀释好的EV71和CA16 病毒进行等比例混合，并与弗氏完全佐剂按照1:1(V/V) 充分乳化后制得免疫抗原；

（2）用制得的手足口病病毒复合免疫抗原对产蛋母鸡进行免疫，获得免疫鸡蛋：

取健康适龄的产蛋母鸡，在双翅轴骨头下的臂三角肌、背部等位置用乳化好的复合免疫抗原进行肌肉、皮下多点注射，以使蛋鸡产生更好的免疫反应；首次免疫采用弗氏完全佐剂，其余采用弗氏不完全佐剂；首次免疫前收集未免疫鸡蛋作为阴性对照品，21天后免疫第二次，以后每隔21天免疫一次，每次免疫剂量为0.2~1ml/只，共免疫4~6次；用ELISA 跟踪检测免疫鸡蛋中抗手足口病病毒鸡卵黄抗体的效价，收集高效价免疫鸡蛋（1:1024），将每日收集的免疫鸡蛋编号，4℃下保存；

（3）提取、纯化：将获得的免疫鸡蛋消毒、去除蛋清及蛋黄膜，留取蛋黄部分，通过水稀释法提取、离心分离获得水溶性组分，并用聚乙二醇6000或硅藻土提取获得抗手足口病病毒鸡卵黄抗体粗品；将粗品用纯化水溶解后，进行超滤纯化，截留相对分子量30KD~150KD滤液；将超滤截留液进行除菌过滤，再经过超低温喷雾干燥，制得抗手足口病病毒鸡卵黄抗体成品，4℃保存。

2.根据权利要求1所述的方法制备得到的抗手足口病病毒鸡卵黄抗体的应用，其特征在于应用于制备成各种预防手足口病的制剂，包括各种消毒喷雾剂、湿巾、免洗洗手液等，以及在制备免疫检测试剂中的应用。