CN104817640A - 一种三价病毒抗体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三价病毒抗体及其制备方法，所述三价病毒抗体为三价抗手足口病病毒的鸡卵黄抗体，所述三价手足口病病毒包括EV71、CoxA10、CoxA16。其制备方法包括以下步骤：（1）分别制备病毒免疫抗原；（2）将三种免疫抗原分别注入到不同的母鸡体内；（3）收集免疫母鸡下的免疫鸡蛋，并对免疫鸡蛋的蛋黄进行提取、纯化，分别获得三种单型抗体原液；（4）将获得三种单型抗体原液按照抗体效价检测配加稳定剂，获得鸡卵黄抗体。本发明中的三价病毒抗体可中和三型病毒抗原，保护范围覆盖更广；配置的三型抗体原液中的单型抗体可独立发挥抑杀抗原的作用；生物活性稳定，可长时间保存，效价高；该三价病毒抗体安全性好。
Description
技术领域
本发明涉及生物抗体免疫技术领域，具体是指一种三价病毒抗体及其制备方法。
背景技术
手足口病是一种儿童传染病，有多种肠道病毒可引起手足口病，最常见的是CoxA16型、EV71型及CoxA10型。其感染途径包括消化道，呼吸道及接触传播。多发生于5岁以下儿童，潜伏期多为2～10天，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。主要的传播方式是通过空气飞沫传播，重症患儿如果病情发展快，导致死亡。对于手足口病至今还没有预防性疫苗和特效治疗药物。
抗病毒药一般在发病24小时到48小时前使用才是最佳的。而往往我们确诊手足口病的时候，都已经过了最有效的治疗阶段，现在也不提倡用抗病毒的药物。目前无特效药物及疫苗可治疗或预防该病的发生。
目前广谱抗生素对手足口病原体不具有效果，可能破坏益生菌，长时间使用可能引起菌群失调，产生耐药菌；化学方法对手足口病原体具有破坏微生物结构的特性，但对皮肤黏膜具有刺激作用；物理方法对手足口病原体具有杀灭作用，但对人体皮肤黏膜有伤害。疫苗对特异性病原体具有抑灭和中和的作用，但起效慢。
现已有二价手足口病病毒卵黄抗体（CoxA16型、EV71型），但对部分地区流行的CoxA10型手足口病病毒无法产生阻断及预防性保护，且制备该抗体的抗原为复合免疫抗原（既为混合二价抗原后免疫母鸡），其产生单型抗体效价由母鸡机体差异而不同，单型抗体保护效果无法保证。
现有制备卵黄抗体的方法，尽管免疫鸡为经过挑选、检查和进行了某些疫病的预防接种的健康产蛋母鸡，仍存在一些鸡源性的细菌或/和病毒混存于鸡蛋从而进入卵黄抗体中的可能，如大肠杆菌、沙门氏菌、鸡减蛋综合征病毒、鸡禽白血病病毒等，从而影响抗体的安全性。目前，一些研究选用带有毒性的甲醛、二乙烯胺（BEI）及β-丙内酯（BPL）作灭活剂，对卵黄抗体中外源性病毒具有灭活效果，但对卵黄抗体的活性有影响从而影响效应的效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能三价抗手足口病病毒，且安全性能较好，使用人群更为广泛的三价病毒抗体。
本发明另一个目的在于提供能三价抗手足口病病毒的病毒抗体的制备方法。
本发明通过下述技术方案实现：一种三价病毒抗体，所述三价病毒抗体为三价抗手足口病病毒的鸡卵黄抗体，所述三价手足口病病毒包括EV71、CoxA10、CoxA16。
三价病毒抗体的制备方法，包括以下步骤：
（1）分别制备病毒EV71、CoxA10、CoxA16的免疫抗原；
（2）将步骤（1）中获得的三种免疫抗原分别注入到不同的母鸡体内；
（3）收集免疫母鸡下的免疫鸡蛋，并对免疫鸡蛋的蛋黄进行提取、纯化，从而分别获得三种单型抗体原液；
（4）将获得三种单型抗体原液按照抗体效价检测配加稳定剂，从而获得抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体。
为了更好地实现本发明中三价病毒抗体的制备，进一步地，所述步骤（1）中，制备相应病毒的免疫抗原具体过程为：分别将EV71、CoxA10及CoxA16手足口病毒株接种于Vero细胞中，并将接种有病毒株的Vero细胞置于33~36℃培养箱中，培养5~7天，待细胞出现病变时收获病毒液，根根据收货的病毒液确定CCID50具体数值，使用0.2~0.4%甲醛进行灭活，经离心、纯化后置于2~8℃的温度环境中备用；根据CCID50结果，将EV71、CoxA10及CoxA16分别用缓冲液稀释，分别与等量的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂配制成乳化免疫抗原。
为了更好地实现本发明中三价病毒抗体的制备，进一步地，所述步骤（2）中将三种免疫抗原分别注入到不同的母鸡体内的具体过程为：取健康适龄的产蛋母鸡，在产蛋母鸡的翅基部三角肌或胸肌等位置用乳化好的免疫抗原进行肌肉、皮下多点注射，以使产蛋母鸡产生更好的免疫反应；其中首次免疫采用弗氏完全佐剂，其余采用弗氏不完全佐剂；首次免疫28天后免疫第2次，以后每间隔28天免疫一次，每次免疫剂量为0.5~1ml/只。
为了更好地实现本发明中三价病毒抗体的制备，进一步地，所述步骤（3）中，分离、提纯的具体步骤如下：
（3.1）将免疫后收集的鸡蛋清洗干净、破壳，分离蛋清蛋黄，去除蛋清，收集蛋黄称取重量；
（3.2）将蛋黄按1:6~9比例加入纯化水稀释匀浆，用1mol/L盐酸溶液调pH4.8~5.5，并在2~8℃的温度条件下静置1~24小时；
（3.3）静置后的液体进行离心，从而去除沉淀物、取上层清液；
（3.4）将获取的上层清液中加入10%~35%硫酸铵盐析，使其充分混匀，之后过夜沉淀；
（3.5）沉淀完成后，进行离心脱盐，取得沉淀制得卵黄抗体粗提物，去除硫酸铵上层清液；
（3.6）获取的卵黄抗体粗提物用1/150~1/300体积弱酸性缓冲液复溶，调节pH为4.8~5.5，令其充分溶解，并在2~8℃的温度环境过夜，之后获取上层清液；
（3.7）将获取的上层清液用超滤膜进行超滤；
（3.8）将超滤后的溶液进行病毒灭活；
（3.9）进行灭活后的溶液，取其上层清液，剩余的悬浊液进行离心分离，除去沉淀，获得的上层清液进行合并，获得单型抗体原液。
为了更好地实现本发明中三价病毒抗体的制备，进一步地，所述病毒抗体的分离、提纯步骤中，进行离心的离心参数为4000~20000r/min。
为了更好地实现本发明中三价病毒抗体的制备，进一步地，所述步骤（3.7）中超滤使用的超滤膜的截留相对分子量为50~100kD。
为了更好地实现本发明中三价病毒抗体的制备，进一步地，所述步骤（3.8）中超滤后溶液的病毒灭活方法为：将需要病毒灭活的溶液放置在温度为54~60℃的环境中，保持8~20小时。
为了更好地实现本发明中三价病毒抗体的制备，进一步地，所述步骤（4）中，对获得三种单型抗体进行效价检测的方法为细胞法或ELISA法。
为了更好地实现本发明中三价病毒抗体的制备，进一步地，所述细胞法检测三种单型抗体的效价方法为：消化并分散RD细胞，调节细胞悬液浓度2×105/ml左右，待检样品从1:8开始进行倍比稀释至1:64；将EV71、CoxA16、CoxA10型病毒分别稀释为100TCID50备用，取稀释的病毒液，按照体积比1:1，分别与稀释的待检样品混匀，接种于96孔板中，置36℃中和2小时；加入浓度为2×105个/ml的RD细胞悬液0.1ml，置细胞培养箱中36℃孵育5-7天，显微镜下观察细胞病变；待检样品出现100%CPE判为阴性，50%以上细胞出现保护者为阳性；能抑制50%细胞病变的最高稀释度即为该待检样品的中和抗体效价。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
（1）本发明中的三价病毒抗体可中和三型病毒抗原，保护范围覆盖更广；
（2）本发明中所述方法通过获得的单型抗体为低级球蛋白，使配置的三型抗体原液中单型抗体可独立发挥抑杀抗原的作用，保证有效主动预防三型手足口病毒；
（3）本发明中三价病毒抗体制备的方法获得的三价病毒抗体，生物活性稳定，可较长时间保存，且获得的三价病毒抗体效价高，拥有更多的抗原结合位点；
（4）本发明所述的三价病毒抗体安全性好，不会产生血清交叉反应或过敏反应，不会产生菌群失调、耐药菌住的弊病，适合各类人群使用，包括幼儿和孕妇；
（5）本发明所述的三价病毒抗体对病毒灭活效果好，且对活体生物的表面和眼球均无刺激性，停留在喷涂部位的时间长。
附图说明
图1为本发明中方法的流程图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
实施例：
本实施例中的三价病毒抗体为三价抗手足口病病毒的鸡卵黄抗体，所述三价手足口病病毒包括EV71、CoxA10、CoxA16。
该三价病毒抗体的具体制备方法，如图1所示，包括如下步骤：
（1）分别将EV71、CoxA10及CoxA16手足口病毒株接种于Vero细胞中，并将接种有病毒株的Vero细胞置于33~36℃培养箱中，培养5~7天，待细胞出现病变时收获病毒液，根根据收货的病毒液确定CCID50具体数值，使用0.2~0.4%甲醛进行灭活，经离心、纯化后置于2~8℃的温度环境中备用；根据CCID50结果，将EV71、CoxA10及CoxA16分别用缓冲液稀释，分别与等量的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂配制成乳化免疫抗原。
（2）取健康适龄的产蛋母鸡，在产蛋母鸡的翅基部三角肌或胸肌等位置用步骤（1）中获取的免疫抗原进行肌肉、皮下多点注射，以使产蛋母鸡产生更好的免疫反应；其中首次免疫采用弗氏完全佐剂，其余采用弗氏不完全佐剂；首次免疫28天后免疫第2次，以后每间隔28天免疫一次，每次免疫剂量为0.5~1ml/只。
（3）收集免疫母鸡下的免疫鸡蛋，之后对免疫鸡蛋的蛋黄进行如下的提取、纯化步骤：
（3.1）将免疫后收集的鸡蛋清洗干净、破壳，分离蛋清蛋黄，去除蛋清，收集蛋黄称取重量；
（3.2）将蛋黄按1:6~9比例加入纯化水稀释匀浆，用1mol/L盐酸溶液调pH4.8~5.5，并在2~8℃的温度条件下静置1~24小时；
（3.3）静置后的液体进行4000~20000r/min的离心，从而去除沉淀物、取上层清液；
（3.4）将获取的上层清液中加入10%~35%硫酸铵盐析，使其充分混匀，之后过夜沉淀；
（3.5）沉淀完成后，进行4000~20000r/min的离心脱盐，取得沉淀制得卵黄抗体粗提物，去除硫酸铵上层清液；
（3.6）获取的卵黄抗体粗提物用1/150~1/300体积弱酸性缓冲液复溶，调节pH为4.8~5.5，令其充分溶解，并在2~8℃的温度环境过夜，之后获取上层清液；
（3.7）将获取的上层清液用截留相对分子量为50~100kD超滤膜进行超滤；
（3.8）将超滤后的溶液放置在温度为54~60℃的环境中，保持8~20小时，进行病毒灭活；
（3.9）进行灭活后的溶液，取其上层清液，剩余的悬浊液进行4000~20000r/min的离心分离，除去沉淀，获得的上层清液进行合并，获得单型抗体原液。
（4）将获得三种单型抗体原液按照抗体效价检测配加稳定剂，从而获得抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体。
其中，步骤（4）中，对三种单型抗体原液进行效价检测，具体方法包括细胞法和ELISA法。
使用细胞法对三种单型抗体原液进行效价检测的方法：所述细胞法检测三种单型抗体的效价方法为：消化并分散RD细胞，调节细胞悬液浓度2×105/ml左右，待检样品从1:8开始进行倍比稀释至1:64；将EV71、CoxA16、CoxA10型病毒分别稀释为100TCID50备用，取稀释的病毒液，按照体积比1:1，分别与稀释的待检样品混匀，接种于96孔板中，置36℃中和2小时；加入浓度为2×105个/ml的RD细胞悬液0.1ml，置细胞培养箱中36℃孵育5-7天，显微镜下观察细胞病变；待检样品出现100%CPE判为阴性，50%以上细胞出现保护者为阳性；能抑制50%细胞病变的最高稀释度即为该待检样品的中和抗体效价。
测得的抗体效价：EV71≥1:32，CoxA16≥1:32，CoxA10≥1:32。
实施例2：
本实施例在上述实施例的基础上，使用ELISA法三种单型抗体原液进行效价检测，测得抗体效价：EV71≥1:32，CoxA16≥1:32，CoxA10≥1:32。本实施例其他部分与上述实施例相同，这里不再赘述。
实施例3：
本实施例在上述实施例的基础上，为验证所述的三价病毒抗体的有效性，对获取的抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体进行了病毒灭活实验，具体过程如下：
用滴度为105~107的手足口病病毒EV71、CoxA16、CoxA10型悬液分别与3%牛血清白蛋白进行对倍稀释，取稀释后的手足口病病毒EV71、CoxA16、CoxA10型悬液0.2ml分别加入到无菌试管中，再加入0.8ml获取的抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体，混匀，然后放置在20℃±1℃水浴中作用5min、10min和20min。振荡混合后，取样检测残留手足口病病毒滴度。手足口病病毒EV71、CoxA16、CoxA10平均灭活对数值不低于1.0log。
本实施例的实验充分验证了所述三价病毒抗体的有效性，该三价病毒抗体对手足口病病毒EV71、CoxA16、CoxA10平均灭活对数值较高，实际使用中，具有较好的病毒免疫效果。本实施例其他部分与上述实施例相同，这里不再赘述。
实施例4：
本实施例在上述实施例的基础上，为验证所述的三价病毒抗体在生物活体表面的安全性，对获取的抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体进行了多次完整皮肤刺激试验。
具体试验过程如下：
试验前24h，将家兔背部脊柱两侧被毛剪掉，去毛范围左、右各约3cm×3cm。试验时将抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体原液0.5ml涂于一侧2.5cm×2.5cm皮肤上，另一侧皮肤作为空白对照。在涂抹后4h除去鸡卵黄抗体原液，每天涂抹一次，连续涂抹14d。在每次涂抹后24h观察结果，对家兔多次完整皮肤刺激试验结果为无刺激性。
本实施例的实验充分证明了，所述的三价病毒抗体对生物活体的皮肤表面没有刺激性，在实际使用中，涂抹在生物活体表面具有很好的安全性，本实施例其他部分与上述实施例相同，这里不再赘述。
实施例5：
本实施例在上述实施例的基础上，为验证所述的三价病毒抗体在活体生物眼球表面的安全性，对获取的抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体进行了急性眼刺激试验。
具体试验过程如下：
取抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体原液0.1ml滴入家兔右眼结膜囊内，被动闭合4s,30s后用足量、流速较快但又不会引起动物眼损伤的生理盐水冲洗30s，左眼为空白对照。记录滴眼后1h、24h、48h、72h、7d、14d和21d的局部反应。如果72h内未出现刺激反应，或第7d、第14d，眼睛刺激反应完全恢复，即可提前终止试验。试验结果表明，抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体原液对家兔急性眼刺激试验结果无刺激性。
本实施例的实验充分证明了所述的三价病毒抗体，在触及生物活体的眼球时，对眼球无刺激性，在实际使用中，不用担心因操作不适，导致该抗体溶液进入人眼，而引发人眼的不适，进一步体现该三价病毒抗体在活体应用方面的安全性，本实施例其他部分与上述实施例相同，这里不再赘述。
实施例6：
本实施例在上述实施例的基础上，为验证所述的三价病毒抗体的在活体生物不同部位的停留时间长，对获取的抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体进行了药物停留时间小动物成像实验。
具体试验过程如下：
调制pH至8.5-10.0，将少量荧光染料加入到抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体原液中，温度为4℃，垂直混合过夜。然后超滤离心来去除未反应的荧光分子，获得含有荧光分子的抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体原液。
试验方法：将含有荧光分子抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体原液制成口腔喷雾。分成三组实验组：a组：喷雾后禁水8小时，不禁食；b组：喷雾后禁食8小时，不禁水；c组：喷雾后禁水禁食8小时；皮肤喷涂：背部剔除部分皮毛后进行喷雾。
通过小动物成像采集喷雾部位荧光强度，通过荧光强度减弱情况，判断抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体原液在喷雾部位的停留时间，口腔喷雾后，不同组别的抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体原液的荧光随时间减弱，口腔喷雾后，不同试验组别在口腔的停留时间均能达到8.5小时，其中禁食禁水实验组效果比较好。含有荧光分子的抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体原液在皮肤处停留时间可长达70多小时。
本实施例的实验是为了验证该三价病毒抗体喷涂在活体动物表面或者口腔内，停留的时间均能达到8小时以上，具有较长的保护周期，在实际使用过程中，可以准确的预测该三价病毒抗体的喷涂时间。本实施例其他部分与上述实施例相同，这里不再赘述。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种三价病毒抗体，其特征在于：所述三价病毒抗体为三价抗手足口病病毒的鸡卵黄抗体，所述手足口病病毒包括EV71、CoxA10、CoxA16。
2.根据权利要求1所述三价病毒抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）分别制备病毒EV71、CoxA10、CoxA16的免疫抗原；
（2）将步骤（1）中获得的三种免疫抗原分别注入到不同的母鸡体内；
（3）收集免疫母鸡下的免疫鸡蛋，并对免疫鸡蛋的蛋黄进行提取、纯化，从而分别获得三种单型抗体原液；
（4）将获得三种单型抗体原液按照抗体效价检测配加稳定剂，从而获得抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体。
3.根据权利要求2所述的三价病毒抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，制备相应病毒的免疫抗原具体过程为：分别将EV71、CoxA10及CoxA16手足口病毒株接种于Vero细胞中，并将接种有病毒株的Vero细胞置于33~36℃培养箱中，培养5~7天，待细胞出现病变时收获病毒液，根根据收货的病毒液确定CCID50具体数值，使用0.2~0.4%甲醛进行灭活，经离心、纯化后置于2~8℃的温度环境中备用；根据CCID50结果，将EV71、CoxA10及CoxA16分别用缓冲液稀释，分别与等量的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂配制成乳化免疫抗原。
4.根据权利要求3所述的三价病毒抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中将三种免疫抗原分别注入到不同的母鸡体内的具体过程为：取健康适龄的产蛋母鸡，在产蛋母鸡的翅基部三角肌或胸肌等位置用乳化好的免疫抗原进行肌肉、皮下多点注射，以使产蛋母鸡产生更好的免疫反应；其中首次免疫采用弗氏完全佐剂，其余采用弗氏不完全佐剂；首次免疫28天后免疫第2次，以后每间隔28天免疫一次，每次免疫剂量为0.5~1ml/只。
5.根据权利要求2或3或4所述的三价病毒抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，分离、提纯的具体步骤如下：
（3.1）将免疫后收集的鸡蛋清洗干净、破壳，分离蛋清蛋黄，去除蛋清，收集蛋黄称取重量；
（3.2）将蛋黄按1:6~9比例加入纯化水稀释匀浆，用1mol/L盐酸溶液调pH4.8~5.5，并在2~8℃的温度条件下静置1~24小时；
（3.3）静置后的液体进行离心，从而去除沉淀物、取上层清液；
（3.4）将获取的上层清液中加入10%~35%硫酸铵盐析，使其充分混匀，之后过夜沉淀；
（3.5）沉淀完成后，进行离心脱盐，取得沉淀制得卵黄抗体粗提物，去除硫酸铵上层清液；
（3.6）获取的卵黄抗体粗提物用1/150~1/300体积弱酸性缓冲液复溶，调节pH为4.8~5.5，令其充分溶解，并在2~8℃的温度环境过夜，之后获取上层清液；
（3.7）将获取的上层清液用超滤膜进行超滤；
（3.8）将超滤后的溶液进行病毒灭活；
（3.9）进行灭活后的溶液，取其上层清液，剩余的悬浊液进行离心分离，除去沉淀，获得的上层清液进行合并，获得单型抗体原液。
6.根据权利要求5所述的三价病毒抗体的制备方法，其特征在于：所述病毒抗体的分离、提纯步骤中，进行离心的离心参数为4000~20000r/min。
7.根据权利要求5所述的三价病毒抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤（3.7）中超滤使用的超滤膜的截留相对分子量为50~100kD。
8.根据权利要求5所述的三价病毒抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤（3.8）中超滤后溶液的病毒灭活方法为：将需要病毒灭活的溶液放置在温度为54~60℃的环境中，保持8~20小时。
9.根据权利要求2或3或4所述的三价病毒抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中，对获得三种单型抗体进行效价检测的方法为细胞法或ELISA法。
10.根据权利要求9所述的三价病毒抗体的制备方法，其特征在于：所述细胞法检测三种单型抗体的效价方法为：消化并分散RD细胞，调节细胞悬液浓度2×105/ml左右，待检样品从1:8开始进行倍比稀释至1:64；将EV71、CoxA16、CoxA10型病毒分别稀释为100TCID50备用，取稀释的病毒液，按照体积比1:1，分别与稀释的待检样品混匀，接种于96孔板中，置36℃中和2小时；加入浓度为2×105个／ml的RD细胞悬液0.1ml，置细胞培养箱中36℃孵育5-7天，显微镜下观察细胞病变；待检样品出现100%CPE判为阴性，50%以上细胞出现保护者为阳性；能抑制50%细胞病变或能保护50%细胞不产生病变的最高稀释度即为该待检样品的中和抗体效价。
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