CN107375911A

CN107375911A - 一种胆固醇羟化酶ch25h及其用途

Info

Publication number: CN107375911A
Application number: CN201710570706.5A
Authority: CN
Inventors: 王健伟; 雷晓波; 肖霞; 张珍珍
Original assignee: Institute of Pathogen Biology of CAMS
Current assignee: Institute of Pathogen Biology of CAMS
Priority date: 2017-07-13
Filing date: 2017-07-13
Publication date: 2017-11-24
Anticipated expiration: 2037-07-13
Also published as: CN107375911B

Abstract

本发明提供了胆固醇‑25‑羟化酶、编码胆固醇‑25‑羟化酶的核酸序列或诱导胆固醇‑25‑羟化酶表达的物质在制备预防和/或治疗肠道病毒感染所致疾病和/或症状的药物中的用途，以及适于所述药物的给药途径、剂型，所述药物可包含的其他活性成分以及所述药物与其他药物的联合用药等；还提供了用胆固醇‑25‑羟化酶表达载体抑制体外细胞中的肠道病毒的非治疗目的的方法；以及用胆固醇‑25‑羟化酶、编码胆固醇‑25‑羟化酶的核酸序列及诱导胆固醇‑25‑羟化酶表达的物质中的至少一种抑制体外细胞中的肠道病毒的非治疗目的的用途。

Description

一种胆固醇羟化酶CH25H及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域和化学领域，具体地，本发明涉及胆固醇-25-羟化酶、编码胆固醇-25-羟化酶的核酸序列及诱导胆固醇-25-羟化酶表达的物质用于制备抗肠道病毒的药物的用途。

背景技术

肠道病毒属(Enterovirus)归类于小核糖核酸(RNA)病毒科(Picornaviridae)，是一类生物学性状相似的单股正链RNA病毒，无包膜，基因组长约7.2-8.4kb。肠道病毒以上呼吸道、咽喉和肠道为侵入门户，先在局部粘膜和咽、扁桃体等淋巴组织和肠道集合淋巴结中初步增殖，然后释放入血，形成第一次病毒血症，扩散至带有受体的靶组织，再次增殖后，引起第二次病毒血症和临床症状。多数肠道病毒的受体在组织和细胞中广泛分布，包括神经系统、心脏、肺脏、胰腺、粘膜、皮肤和其它系统，因此，其疾病范围广泛。

人肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、埃可病毒(ECHO virus)和新肠道病毒，至少有72个血清型。

人肠道病毒71型(Enterovirus A71，EV71)的基因组编码一个长链多肽，可划分为结构蛋白区P1和非结构蛋白区P2及P3。P3编码的病毒蛋白酶3CD对P1进行加工、切割，产生结构蛋白VP0、VP1和VP3，VP0可进一步裂解为VP2和VP4，这些结构蛋白在体内共同组装形成病毒衣壳。EV71病毒是手足口病的主要病原体之一。手足口病主要发病人群为5岁以下婴幼儿，临床表现为发热，咽喉疼痛，手、足、口腔等部位皮肤和粘膜出现红斑、水疱乃至溃疡等损害，重症EV71感染患者通常会出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻等消化系统症状，并伴有中枢神经系统并发症，包括急性迟缓性脑瘫、脑炎、脑膜炎、脑干脑炎、脑脊髓炎、脊髓灰质炎样综合征、无菌性脑膜炎等多种神经性疾病和神经源性肺水肿、肺出血、呼吸道感染、心血管损伤、心肌炎等并发症，少数EV71感染患者还可发生中枢神经系统失调造成的肠道出血，与自主神经紊乱、炎症反应有关的轻微的肝功能异常，以及多器官功能衰竭。

EV71对人类的健康，尤其是对婴幼儿的健康构成了极大的威胁。时至今日，EV71的致病机制并不完全清楚，有效的防控手段依旧有限。日前，全球首个EV71灭活疫苗(人二倍体细胞)获国家食品药品监督管理总局批准生产，该疫苗由中国医学科学院医学生物学研究所自主研发(请参见中国专利CN 101402944B)。临床试验结果显示，这种疫苗对EV71引起的手足口病的保护率可达97.3％，对于有效降低我国儿童手足口病的发病率，尤其是减少该病的重症及死亡病例，保护儿童生命健康具有重要意义。然而，接下来的问题是，仅仅依靠疫苗是否能实现手足口病的控制。以脊髓灰质炎的防控历史为例，2000年之前，全球范围通过大规模的疫苗接种实现了脊髓灰质炎的根除，但是近几年，脊髓灰质炎仍然在多个国家和地区流行。因此，实现肠道病毒的控制不仅仅需要有效的疫苗，抗病毒药物的辅助也是至关重要的。目前临床上常使用广谱的抗病毒药物以及具有清热解毒作用的中草药、中成药来治疗手足口病，仍然缺乏对肠道病毒尤其是EV71病毒更具有针对性的药物。

人肠道病毒68型(Enterovirus D68，EV68)的基因组编码1个前体多聚蛋白，然后不断被自身蛋白酶水解切割成结构蛋白VP1-VP4和非结构蛋白2A、2B、2C和3A、3B、3C、3D。EV68病毒感染的常见症状有：流鼻涕，打喷嚏，咳嗽，肌肉痛，哮喘，呼吸困难，发热，咽喉疼痛，手、足和/或口腔等部位皮肤和/或粘膜出现红斑、水疱和/或溃疡，及其他严重症状等。临床并发症有：上呼吸道感染、毛细支气管炎、支气管炎及肺炎、手足口病、疱疹性咽喉炎、胸膜痛、无菌性脑膜炎、松弛性瘫痪、新生儿败血症及一些严重的慢性病。EV68病毒与重症呼吸系统疾病有关，可以加剧哮喘和肺炎，引发高热昏厥和致死性神经系统感染，个别病例感染后可出现心肺功能衰竭和中枢神经系统并发症，甚至引发死亡。同时，美国疾病预防控制中心报道了一种以脊髓灰质异常和肌肉无力为特征的神经系统疾病，部分患者EV68检测结果呈阳性。

EV68近年来在全球多地暴发，并诱发严重的呼吸系统及中枢神经系统疾病，引起严重的感染症状。目前尚不完全清楚EV68的病毒学特征和致病机制。Liu等人发现抗病毒药物普来可那立(Pleconaril)可在细胞内阻断EV68感染，可能成为治疗EV68感染的候选药物(Liu Y,Sheng J,et al.Structure and inhibition of EV-D68,a virus that causesrespiratory illness in children[J].Science,2015,347(6217):71-74)。目前为止没有特异性针对EV68的疫苗，也没有获批的安全抗病毒疗法可以在临床治疗中应用，迫切需要研发特异有效的预防及治疗药物来遏制病毒的危害。

胆固醇-25-羟化酶(Cholesterol-25-hydroxylase，CH25H)，也叫胆固醇25-单加氧酶，在细胞中广泛存在，能够催化胆固醇生成25-羟基胆甾醇(25HC)，在细胞内脂类的代谢过程中起重要作用。目前，已发现胆固醇-25-羟化酶是干扰素诱导基因(ISG)，由多种toll样受体(TLR)配体和IFN分子在体内的多种组织(包括肝脏、心脏、脑、肌肉、肾脏和肺)中快速诱导产生(参见Park,K.&Scott,A.L.Cholesterol25-hydroxylase production bydendritic cells and macrophages is regulated by type Iinterferons.J.Leukoc.Biol.88,1081-1087(2010))。

据报道，胆固醇-25-羟化酶通过催化胆固醇生成25-羟基胆甾醇来抑制病毒-细胞膜融合从而阻止某些具有包膜的病毒进入宿主细胞，例如已见报道的病毒有水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)、生殖器单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus，HSV)、人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)、埃博拉病毒(EbolaVirus，EBOV)、尼帕病毒(Nipah Virus)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)等(例如参见Liu,S.Y.et al.,Interferon-inducible cholesterol-25-hydroxylase broadlyinhibits viral entry by production of25-hydroxycholesterol.Immunity,38,92-105(2013)；Yongzhi Chen et al.,Cholesterol-25-Hydroxylase Inhibits Hepatitis CVirus Replication via Distinct Mechanisms,SCIENTIFIC REPORTS,4:7242,1-8(2014))。但目前尚无胆固醇-25-羟化酶抗肠道病毒特别是EV71的报道。

发明内容

本发明人发现，用EV71病毒感染细胞引起细胞内胆固醇-25-羟化酶的表达，而上调的胆固醇-25-羟化酶又能抑制EV71病毒的复制。发明人还发现，胆固醇-25-羟化酶对同属于肠道病毒属的EV68病毒也具有抑制作用。本发明揭示，胆固醇-25-羟化酶有望用于制备新型的抗肠道病毒药物或成为抗肠道病毒药物设计的新靶点。

基于上述发现，本发明主要提供了五个方面的内容：

本发明的第一个方面提供了胆固醇-25-羟化酶在制备预防和/或治疗肠道病毒感染所致疾病和/或症状的药物中的用途。

本发明的第二个方面提供了编码胆固醇-25-羟化酶的核酸序列在制备预防和/或治疗肠道病毒感染所致疾病和/或症状的药物中的用途。

本发明的第三个方面提供了诱导胆固醇-25-羟化酶表达的物质在制备预防和/或治疗肠道病毒感染所致疾病和/或症状的药物中的用途。

另外，本发明还提供了适于所述药物的给药途径、剂型，所述药物可包含的其他活性成分以及所述药物与其他药物的联合用药等。

本发明的第四个方面提供了用胆固醇-25-羟化酶表达载体抑制体外细胞中的肠道病毒的非治疗目的的方法。

本发明的第五个方面提供了用胆固醇-25-羟化酶、编码胆固醇-25-羟化酶的核酸序列及诱导胆固醇-25-羟化酶表达的物质中的至少一种抑制体外细胞中的肠道病毒的非治疗目的的用途。

此外，本发明还提供了筛选用于预防和/或治疗肠道病毒感染所致疾病和/或症状的治疗剂的方法。

附图说明

图1显示EV71病毒感染后CH25H的转录增加。用EV71病毒感染RD细胞(人横纹肌肉瘤细胞)，分别在感染后4h、8h、24h收获细胞并提取细胞总RNA，进行荧光定量PCR检测CH25H的mRNA转录水平。

图2显示CH25H可以抑制EV71病毒的复制。RD细胞中过表达不同剂量的CH25H后，感染EV71病毒，24h后收获细胞并提取细胞总RNA，进行荧光定量PCR检测EV71的mRNA转录水平。

图3显示CH25H可以抑制EV71病毒的复制。RD细胞中过表达不同剂量的CH25H后，感染EV71病毒，24h后裂解细胞并收获总蛋白，进行蛋白质印迹法(western blot)检测EV71结构蛋白的表达情况。

图4显示CH25H可以抑制EV68病毒的复制。RD细胞中过表达不同剂量的CH25H后，感染EV68病毒，24h后收获细胞并提取细胞总RNA，进行荧光定量PCR检测EV68的mRNA转录水平。

图5显示CH25H可以抑制EV68病毒的复制。RD细胞中过表达不同剂量的CH25H后，感染EV68病毒，24h后裂解细胞并收获总蛋白，进行蛋白质印迹法检测EV68结构蛋白的表达情况。

序列表说明

SEQ ID NO:1示出了CH25H的核酸序列。

SEQ ID NO:2示出了CH25H的蛋白质序列。

SEQ ID NO:3示出了用于检测CH25H的正向引物。

SEQ ID NO:4示出了用于检测CH25H的反向引物。

SEQ ID NO:5示出了用于检测GAPDH的正向引物。

SEQ ID NO:6示出了用于检测GAPDH的反向引物。

SEQ ID NO:7示出了用于检测EV71或EV68的正向引物。

SEQ ID NO:8示出了用于检测EV71或EV68的反向引物。

具体实施方式

在一个具体的实施方案中，所述胆固醇-25-羟化酶来源于哺乳动物或人，优选来源于人、牛、羊或鼠，更优选来源于人。

在一个具体的实施方案中，所述胆固醇-25-羟化酶是重组胆固醇-25-羟化酶，优选重组人、牛、羊、鼠胆固醇-25-羟化酶，更优选重组人胆固醇-25-羟化酶。

本领域已知天然的人胆固醇-25-羟化酶的核酸序列(GenBank登录号NM_003956)，如SEQ ID NO:1所示。天然的人胆固醇-25-羟化酶的蛋白质序列(GenBank登录号NP_003947)如SEQ ID NO:2所示。

在一个具体的实施方案中，所述胆固醇-25-羟化酶是包含序列SEQ ID NO:2的重组人胆固醇-25-羟化酶。

可使用本领域已知的方法制备重组胆固醇-25-羟化酶，例如可参见MolecularCloning,A Laboratory Manual(Sambrook,et al.,Cold Spring Harbor Laboratory),Current Protocols in Molecular Biology(Eds.Ausubel,et al.Greene Publ.Assoc.,Wiley-Interscience,NY)。

为了将胆固醇-25-羟化酶作为药物活性成分给药，可用本领域已知的方法对胆固醇-25-羟化酶进行修饰或改造，以增强其稳定性或延长其半衰期等，修饰或改造的方法例如可参见中国专利CN 101680039B、美国专利US 6613332、美国专利申请US 20080311214、美国专利申请US20080317726等。

在一个具体的实施方案中，所述药物包含编码胆固醇-25-羟化酶的核酸序列及递送所述核酸序列的载体。

在一个优选的实施方案中，所述核酸序列编码蛋白质序列SEQ ID NO:2。

在一个优选的实施方案中，所述核酸序列包含SEQ ID NO:1或其互补序列或其变体。

在本文中，“变体”包括，例如，由于个体之间的等位基因差异而天然存在的变体(例如，多态性)、可变剪接形式等。术语“变体”还包括来自其它来源或生物体的编码胆固醇-25-羟化酶的核酸序列。优选的变体基本上与SEQ ID NO:1同源，即通常表现出与SEQ IDNO:1至少约75％，优选至少约85％，更优选至少约90％，更优选至少约95％的核苷酸序列同一性。

在一个具体的实施方案中，所述载体是非病毒载体，例如递送编码胆固醇-25-羟化酶的核酸序列的质粒；优选地，所述载体是pCMV6、pcDNA3.1、pEGFP；更优选地，所述载体是pCMV6-XL5。

在一个具体的实施方案中，所述载体是病毒载体。病毒载体的实例包括腺病毒，逆转录病毒，疱疹病毒和腺相关病毒载体。

在本文中，术语“递送”是指将外源基因导入宿主细胞。这种“递送”可导致非整合转移的DNA的瞬时表达、染色体外复制及转移的复制子(例如，附加体)的表达、或转移的遗传物质整合到宿主细胞的基因组DNA中。

在本文中，术语“目的基因”是指含有至少一个能够在转录或翻译后编码胆固醇-25-羟化酶的开放阅读框(ORF)的多核苷酸。

可通过本领域已知的分子生物学方法构建递送目的基因的表达载体。

所有本领域中已知的能够在转录或翻译后编码胆固醇-25-羟化酶的核酸序列、及能够递送这样的核酸序列的载体、以及本领域中已经构建的所有胆固醇-25-羟化酶表达载体均可用于制备本发明所述的药物。例如，在一个具体的实施方案中，所述药物包含美国Origene公司的胆固醇-25-羟化酶表达载体pCMV6-CH25H-C-Flag。

本发明第三个方面提供了诱导胆固醇-25-羟化酶表达的物质在制备用于预防和/或治疗肠道病毒感染所致疾病和/或症状的药物中的用途。

本领域中已知一些诱导胆固醇-25-羟化酶表达的物质，例如根据Kiwon Park andAlan L.Scott,Cholesterol 25-hydroxylase production by dendritic cells andmacrophages is regulated by type I interferons,Journal of Leukocyte Biology,2010(88):1081-1087的记载，TLR4(Toll样受体4)激动剂可诱导胆固醇-25-羟化酶表达。

在一个具体的实施方案中，所述诱导胆固醇-25-羟化酶表达的物质是TLR4激动剂。所述TLR4激动剂包括但不限于脂多糖(LPS)、类脂A及它们的衍生物。

本发明的第四个方面提供了用胆固醇-25-羟化酶表达载体抑制体外细胞中的肠道病毒的非治疗目的的方法，所述方法包括：在肠道病毒与细胞接触之前和/或接触同时和/或接触之后，用胆固醇-25-羟化酶表达载体转染细胞；优选地，所述胆固醇-25-羟化酶表达载体是美国Origene公司的胆固醇-25-羟化酶表达载体pCMV6-CH25H-C-Flag。

根据本发明的第一至第三个方面，在一个具体的实施方案中，所述药物用于哺乳动物、人或禽类；优选地，所述药物用于人、牛或猪；更优选地，所述药物用于人；特别优选地，所述药物用于16岁以下的儿童，或者所述药物用于5岁以下的婴幼儿。

在本文中，术语“肠道病毒”是指属于小RNA病毒科的肠道病毒属的病毒。

根据本发明的第一至第五个方面，在一个具体的实施方案中，所述肠道病毒包括柯萨奇病毒A组16、4、5、7、9、10型，B组2、5、13型，埃可病毒和肠道病毒68、71型；优选地，所述肠道病毒包括肠道病毒68型(EV 68)、肠道病毒71型(EV 71)；更优选地，所述肠道病毒是肠道病毒71型。

在本文中，“预防”是指减少受试者患上疾病的风险或者延迟受试者患病或延迟症状出现时间的预防性干预。

在本文中，“治疗”是指改善受试者的疾病或症状的发展状态的治疗性干预，包括使受试者的疾病或症状消退，减缓受试者疾病或症状的进程，减轻受试者疾病或症状的严重程度，或减少导致疾病或症状的细胞、生理或生物化学病因或机理。

根据本发明的第一至第三个方面，在一个具体的实施方案中，所述疾病包括肠道病毒71型感染所致疾病，这些疾病包括但不限于手足口病、急性迟缓性脑瘫、脑炎、脑膜炎、脑干脑炎、脑脊髓炎、脊髓灰质炎样综合征、无菌性脑膜炎，优选所述疾病是手足口病。

根据本发明的第一至第三个方面，在一个具体的实施方案中，所述症状包括肠道病毒71型感染所致症状，这些症状包括但不限于发热，咽喉疼痛，手、足和/或口腔等部位皮肤和/或粘膜出现红斑、水疱和/或溃疡等损害，恶心、呕吐、腹痛、腹泻等消化系统症状，以及神经源性肺水肿、肺出血、呼吸道感染、心血管损伤、心肌炎、肠道出血、肝功能异常以及多器官功能衰竭；优选所述症状包括发热，咽喉疼痛，手、足和/或口腔等部位皮肤和/或粘膜出现红斑、水疱和/或溃疡。

根据本发明的第一至第三个方面，在一个具体的实施方案中，所述疾病包括肠道病毒68型感染所致疾病，这些疾病包括但不限于上呼吸道感染、毛细支气管炎、支气管炎、肺炎、手足口病、疱疹性咽喉炎、胸膜痛、无菌性脑膜炎、松弛性瘫痪、新生儿败血症。

根据本发明的第一至第三个方面，在一个具体的实施方案中，所述症状包括肠道病毒68型感染所致症状，这些症状包括但不限于：流鼻涕，打喷嚏，咳嗽，肌肉痛，哮喘，呼吸困难，发热，咽喉疼痛，手、足和/或口腔等部位皮肤和/或粘膜出现红斑、水疱和/或溃疡。

根据本发明的第一至第三个方面，本发明所述的药物可包含的活性成分包括但不限于蛋白质、多肽、核酸分子、脂类、糖类。

根据本发明的第一至第三个方面，在一个具体的实施方案中，所述药物还包含药学上可接受的辅料。

在本文中，“药学上可接受的辅料”意指包括所有适于在制药中应用的溶剂、分散剂、杀细菌剂和杀真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药学上可接受的辅料是本领域已知的。

根据本发明的第一至第三个方面，在一个具体的实施方案中，所述药物还包含其他活性成分；优选地，所述其他活性成分选自以下的一种或多种：抗病毒剂、抗菌剂、止痛剂、退热剂、抗炎剂、麻醉剂等。

根据本发明的第一至第三个方面，在一个具体的实施方案中，所述药物还包含稳定剂，稳定剂可在任何无菌的生物相容的药学辅料中提供，所述辅料包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。

根据所期望的给药途径，将本发明所述的药物根据本领域已知的方法配制为合适的剂型。适于本发明药物的给药途径的实例包括肠胃外，例如静脉内，皮内，皮下，口服(例如吸入)，透皮(局部)，经粘膜和直肠给药。对于本发明药物的剂型，例如，适于肠胃外、皮内或皮下给药的剂型包括溶液剂和混悬剂；适于注射用的药物剂型包括无菌水溶液、分散剂、以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末；适于口服给药的剂型包括片剂，丸剂、锭剂及胶囊剂；适于局部给药的剂型包括软膏剂、凝胶、透皮贴剂、吸入剂、鼻喷雾剂及栓剂。还可以将本发明的药物制备为控制释放的剂型，其包含植入物和微胶囊化递送系统，通过添加生物可降解的聚合物辅料(例如聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸)以保护活性成分免于在体内快速消除。

适于本发明所述的药物的给药途径、剂型不限于本文所述的这些，本领域技术人员可以根据已知的方法制备合适的剂型、选择合适的剂量、设计合适的包装等，例如可参见中国发明专利申请CN104245931A、PCT国际申请WO 2004/055201A2以及美国专利申请US2013/0209410 A1、US2011/0034540A1等。

根据本发明的第一至第三个方面，在一个具体的实施方案中，所述药物与其他药物联合给药。

所述联合不引起不可接受的副作用。

在一个优选的实施方案中，所述其他药物包括其他能够预防和/或治疗肠道病毒感染所致疾病或症状的药物。

在一个优选的实施方案中，所述其他药物包括但不限于抗病毒药物、免疫调节剂、抗感染药、解热镇痛药、疫苗、中草药、中成药、益生菌、维生素、微量元素、降胆固醇药物。

在一个更优选的实施方案中，所述其他药物包括但不限于EV71灭活疫苗、EV71减毒疫苗、丙球蛋白、重组人干扰素、重组人白介素-2、阿昔洛韦、更昔洛韦、利巴韦林、金霉素软膏、盐酸吗啉胍、阿莫西林、对乙酰氨基酚、蒙脱石散、西地碘含片、鱼肝油、板蓝根、冰硼散、注射用双黄连、西瓜霜喷剂、清开灵、蒲地蓝、维生素B2、维生素C。

在一个优选的实施方案中，所述联合给药可以同时给药或相继给药。

本发明所述药物单独给药或与其他药物联合给药时所需的给药剂量、给药顺序和给药次数可以由本领域技术人员通过常规的治疗试验来确定。

根据本发明的第四至第五个方面，在一个具体的实施方案中，所述抑制包括抑制肠道病毒的复制或肠道病毒引起的细胞病变。

根据本发明的第四至第五个方面，在一个具体的实施方案中，所述细胞是人的细胞；更优选地，所述细胞是人横纹肌肉瘤细胞。

此外，基于本发明的发现，本发明还提供了一种用于在哺乳动物细胞中筛选治疗剂的方法，所述治疗剂用于预防和/或治疗肠道病毒感染引起的疾病和/或症状，所述方法包括以下步骤：

a)在存在测试化合物的情况下，测定胆固醇-25-羟化酶的转录水平或表达水平；

b)在不存在所述测试化合物的情况下，测定胆固醇-25-羟化酶的转录水平或表达水平；

其中，选择这样的测试化合物作为潜在的治疗剂：步骤a)中测得的胆固醇-25-羟化酶的转录水平和/或表达水平比步骤b)中测得的胆固醇-25-羟化酶的转录水平和/或表达水平高。

可根据本文实施例1-3中所记载的方法测定胆固醇-25-羟化酶的转录水平或表达水平。

本领域技术人员能够理解，根据本发明的方法筛选出的治疗剂应能够实现所期望的治疗反应而且在受试者体内不会引起实质的细胞毒作用。

应理解，上文所描述的各组实施方案之间可以任意组合。

下面，通过实施例并结合附图来示例性的描述本发明的实施方式，以下实施例是用于解释、而不是以任何方式限制本发明。如未特别说明，实施例中所用的试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的检测方法均为本领域技术人员已知的检测方法。下列实施例中未注明详细实验方法的，按照常规条件和方法，如分子克隆实验室手册(Sambrook,et al.NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述方法或试剂制造商提供的方法。

实施例

实施例1.病毒感染后CH25H转录水平的变化

用1MOI(multiplicity of infection，感染复数)EV71病毒(北京株BJ/CHN/2008)感染RD细胞(人横纹肌肉瘤细胞，购自美国ATCC)，分别在感染后的4h、8h、24h收获细胞，提取细胞总RNA，经逆转录后进行荧光定量PCR，检测CH25H的mRNA转录水平。实验设3次重复，实验结果取平均值。

具体方法如下：

1.1EV71病毒的扩增

取EV71病毒30μl与10％FBS(胎牛血清，购自美国Hyclone公司，货号30396)的DMEM培养基(购自美国Gibco公司，货号C11965500)混合接种于在T75(生长面积75cm²)培养瓶中的80％-90％丰度(单位面积内细胞分数，即细胞在培养板中的伸展密度达到总培养板底面积的80-90％)的RD细胞中，37℃下5％CO₂孵育，每天通过倒置显微镜(型号：7S100，购自日本尼康公司)观察细胞病变(cytopathic effect，CPE，表现为细胞间隙变大、细胞变大变圆)。直至80％-90％的RD细胞病变后，收集病变细胞沉淀及上清，于-80℃反复冻融3次，12000rpm离心10min去除细胞碎片，将含有病毒的上清分装，并保存于-80℃中备用。

1.2用EV71病毒感染RD细胞

取EV71病毒(1MOI)与10％FBS的DMEM混合接种于T75培养瓶中的80％-90％丰度的RD细胞，37℃下5％CO₂孵育。实验分3组，每组均设不加EV71病毒的对照，分别在感染后的4h、8h、24h弃掉培养瓶中的培养基，收获细胞。

1.3荧光定量PCR检测CH25H的转录

(1)细胞总RNA提取

在上述步骤得到的各组中，分别加入1ml Trizol(总RNA抽提试剂，购自美国Invitrogen公司)，室温放置10min；加入200μl氯仿，剧烈振荡15s后室温放置3min，使其自然分相；4℃下12,000g离心15min，将500μl上清小心转移至新的Eppendorf管(无RNAase(RNA酶))中，加入等体积的异丙醇，混匀后冰上放置10min；4℃下12,000g离心10min，小心弃上清；向RNA沉淀中加入1ml 75％乙醇(用不含RNA酶的水配制，不含RNA酶的水购自美国Amresco公司，货号E476)，温和悬浮沉淀；4℃下7,500g离心5min，小心弃上清，室温干燥沉淀；向沉淀中加入50μl不含RNA酶的水，室温放置10min，以充分溶解RNA，测得浓度为200-300ng/μl(用美国NanoDrop分光光度计测定，型号ND-1000)，分装于-80℃保存备用。

(2)逆转录反应(RT)

取2μg的RNA与0.5μg的oligo(dT)₁₈(购自日本Takara公司，货号RR52A)混匀，使之总体积为15μl，70℃下5min。冰上放置1min。按照美国promega公司的M-MLV反转录酶说明书中提供的逆转录体系进行逆转录反应：

将上述两个体系混匀，42℃下60min。

(3)荧光定量PCR

以GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作内参，通过荧光定量PCR检测CH25H的转录水平。

以下引物用于检测CH25H：

正向引物：5'-TCCTGTTCTGCCTGCTACTCTTC-3'，序列如SEQ ID NO:3所示，

反向引物：5'-GGTACAGCCAGGGCACCTT-3'，序列如SEQ ID NO:4所示；

以下引物用于检测GAPDH：

正向引物：5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-3'，序列如SEQ ID NO:5所示，

反向引物：5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'，序列如SEQ ID NO:6所示。

按照日本Takara公司的2×SYBR Premix ExTaq(PCR预混液)说明书配置PCR反应体系：

使用荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司CFX^TM Optics Module)进行PCR扩增程序：95℃3min；95℃5s，55℃15s，60℃30s+读板，共45个循环；95℃，10s；熔解曲线65℃-95℃，5s递增+读板。

(4)数据处理

扩增过程及荧光信号检测、数据的存储和分析均由所述PCR仪及自带软件完成。每个样品定量PCR的Ct值减去相应样品GAPDH的Ct，样品扩增的倍数变化的计算采用2^{^ΔCt}法。

结果如图1所示。结果表明，EV71病毒感染后，CH25H的mRNA转录水平上调。

实施例2.CH25H过表达对EV71病毒复制的影响

RD细胞转入不同剂量的CH25H表达载体，转染24h后，加入1MOI的EV71病毒，继续培养24h收获细胞，提取细胞总RNA，经逆转录后进行荧光定量PCR，检测EV71的mRNA转录水平。实验设3次重复，实验结果取平均值。

2.1EV71病毒的扩增

同实施例1.1。

2.2用CH25H表达载体转染RD细胞

将RD细胞按每孔1.5×10⁶个细胞接种于24孔板中，次日细胞长至60％-70％丰度(细胞在培养板中的伸展密度达到培养板底面积的60-70％)时即可转染，转染前换为无血清和无抗生素的培养基(Gibco DMEM basic，货号：C11965500)。室温放置20min，弃掉原来24孔板中的液体，用转染液覆盖培养细胞，实验分5组，表达载体的剂量分别是0、50、100、200、500ng/孔。37℃下5％CO₂孵育4-6h；加入含10％FBS的DMEM培养基，37℃下5％CO₂继续培养24h。其中，转染液的配制方法为：

(1)配制A液：在无血清无抗生素的150μl Opti-MEM培养基(购自美国Invitrogen公司)中分别加入0、50、100、200、500ng表达载体(pCMV6-CH25H-C-Flag，购自美国Origene公司，CH25H基因位于载体pCMV6-XL5上，表达载体的C端加入Flag标签，标签序列5'-GACTACAAAGACGATGACGACAAG-3')，混匀，

(2)配制B液：在无血清无抗生素的150μl Opti-MEM培养基中加入1μl的lipofectemine2000(购自美国Invitrogen公司)，混匀，

(3)将混匀的A液与B液分别在室温下放置5min，

(4)将A液和B液混合均匀即得到分别包含0、50、100、200、500ng表达载体的转染液。

2.3用EV71病毒感染经转染的RD细胞

在上述步骤得到的各组中，分别加入1MOI EV71病毒，37℃下5％CO₂孵育，在感染后24h收获细胞。

2.4荧光定量PCR检测EV71的转录

检测方法如实施例1.3所述。

用于检测EV71的引物如下：

正向引物：5'-ACATGGTGTGAAGAGyCTAyTGAGCT-3'，其中y指简并碱基，代表C或T，序列如SEQ ID NO:7所示；

反向引物：5'-ACACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTCCGC-3'，序列如SEQ ID NO:8所示。

结果如图2所示。结果表明，CH25H的表达抑制EV71病毒的复制，随CH25H表达量的增加，抑制EV71病毒的效果增加。

实施例3.CH25H抑制EV71病毒的复制

RD细胞转入不同剂量的CH25H表达载体，转染24h后，加入1MOI的EV71病毒，继续培养24h收获细胞，经蛋白质印迹法检测EV71病毒结构蛋白。实验设3次重复，实验结果取平均值。

具体方法如下：

3.1EV71病毒的扩增

同实施例1.1。

3.2用CH25H表达载体转染RD细胞

同实施例2.2。

3.3用EV71病毒感染经转染的RD细胞

同实施例2.3。

3.4蛋白质印迹法检测EV71病毒结构蛋白

以β-肌动蛋白(β-actin)作内参，进行蛋白质印迹法检测：

(1)对上述步骤的各组中收获的细胞分别进行如下处理：每1.5×10⁶个细胞加入100μl 1×被动裂解液(passive lysis buffer，由购自美国Promega公司的5×被动裂解液配制：1倍体积的5×被动裂解液加4倍体积的水，混匀后使用)，轻轻混匀，室温裂解30min；4℃下12000g离心10min，收集上清，用BCA蛋白定量方法定量(使用购自美国Thermo公司的BCA蛋白定量试剂盒(23225)，具体方法参见说明书)细胞裂解液中的蛋白浓度，将各样品的蛋白浓度调到一致(2μg/μl)，加入10μl的6×上样缓冲液(300mM Tris-HCl(pH 6.8)，600mM二硫苏糖醇，12％(W/V)SDS，0.6％(W/V)溴酚蓝，60％(V/V)甘油)制备成蛋白样品，100℃加热变性5min后置于-20℃保存；

(2)将各蛋白样品用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，然后经400mA恒流将蛋白质转移到硝酸纤维素(NC)膜上；

(3)转膜完成后，将NC膜经5％脱脂牛奶/PBST(PBS 0.1％Tween20)室温封闭2h，加一抗稀释液(用5％脱脂牛奶按1:1000稀释)4℃过夜，然后用1‰Tween PBST洗涤三次，每次5min，加入二抗稀释液(用5％脱脂牛奶按1:10000稀释)，室温避光孵育30min；1‰TweenPBST洗涤三次，每次10min；之后用Odyssey(美国Li-COR公司的双色红外激光成像系统)进行扫描鉴定。其中，针对EV71结构蛋白、β-肌动蛋白和CH25H，分别使用的一抗是小鼠抗EV71结构蛋白(MAB979，购自美国Millipore公司)、小鼠抗-β-肌动蛋白单克隆抗体(A5441，购自美国Sigma公司)、标签抗体Flag(F3165，购自美国Sigma公司)；针对EV71结构蛋白和β-肌动蛋白使用的二抗是抗鼠IgG Dy800二抗(购自美国Li-COR公司，货号：926-32212)，针对CH25H使用的二抗是抗鼠IgG Dy680二抗(购自美国Li-COR公司，货号：926-68070)。

结果如图3所示。结果表明，随着CH25H表达量的增加，EV71结构蛋白VP0和VP2的量逐渐减少。

实施例4.CH25H过表达对EV68病毒复制的影响

RD细胞转入不同剂量的CH25H表达载体，转染24h后，加入1MOI的EV68病毒(GeneBank号：KF726085.1)，继续培养24h收获细胞，提取细胞总RNA，经逆转录后进行荧光定量PCR，检测EV68的mRNA转录水平。实验设3次重复，实验结果取平均值。

4.1EV68病毒的扩增

EV68病毒的扩增方法与EV71的相同，具体扩增方法如实施例1.1所述。

4.2用CH25H表达载体转染RD细胞

同实施例2.2。

4.3用EV68病毒感染经转染的RD细胞

在上述步骤得到的各组中，分别加入1MOI EV68病毒，37℃下5％CO₂孵育，在感染后24h收获细胞。

4.4荧光定量PCR检测EV68的转录

检测方法如实施例1.3所述。

用于检测EV68的引物与用于检测EV71的引物相同，序列如SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8所示。

结果如图4所示。结果表明，CH25H的表达抑制EV68病毒的复制，随CH25H表达量的增加，抑制EV68病毒的效果增加。

实施例5.CH25H抑制EV68病毒的复制

RD细胞转入不同剂量的CH25H表达载体，转染24h后，加入1MOI的EV68病毒，继续培养24h收获细胞，经蛋白质印迹法检测EV68病毒结构蛋白。实验设3次重复，实验结果取平均值。

具体方法如下：

5.1EV68病毒的扩增

5.2用CH25H表达载体转染RD细胞

同实施例2.2。

5.3用EV68病毒感染经转染的RD细胞

同实施例4.3。

5.4蛋白质印迹法检测EV68病毒结构蛋白

检测方法如实施例3.4所述。

在检测中，针对EV68结构蛋白使用的一抗是利用EV68的VP1蛋白免疫小鼠(SPF级6周龄15-20克的雌性BALB/c小鼠，购自北京华阜康生物科技有限公司)后获得的小鼠血清(制备一抗的具体方法为：对小鼠皮下注射EV68的VP1蛋白，首次注射量为100μg，之后注射量为50μg，注射3次，每次注射的间隔时间为2周，注射第3次后，过两周眼球取血后收获血清，加等体积50％的甘油保存)，针对EV68结构蛋白使用的二抗是抗鼠IgG Dy800二抗(购自美国Li-COR公司，货号：926-32212)。

结果如图5所示。结果表明，随着CH25H表达量的增加，EV68结构蛋白VP1的量逐渐减少。

以上实施例为示例性实施例，不应理解为对本发明的限制。本领域技术人员能够认识到，在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的范围之内。此外，除非另有定义，本文中应用的全部技术和科学术语均具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的意义。如果出现矛盾，将以本说明书包括的定义为准。本文中所有的出版物、专利申请、专利和文献的全部内容及它们引用的所有出版物、专利申请、专利和文献均以引用的方式纳入本文中。

序列表

<110> 中国医学科学院病原生物学研究所

<120> 一种胆固醇羟化酶CH25H及其用途

<130> CP1170199/CB

<160> 8

<170> PatentIn版本3.3

<210> 1

<211> 1378

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

agctgccttg cacagcctcg caatgagctg ccacaactgc tccgaccccc aggtcctttg 60

cagctccggg cagctgttcc tgcagcccct ctgggaccac ctgaggagct gggaggccct 120

cctacagtcg cccttcttcc cggtcatctt ctccatcacc acatacgtgg gcttttgcct 180

gcccttcgtg gtcctggata tcctgtgctc ctgggtgccc gccctgcggc gctacaagat 240

ccaccctgac ttctcgccat ccgcgcagca gctgctacct tgcctggggc agaccctcta 300

ccagcatgtg atgtttgtgt tccccgtgac gctgctgcat tgggcccgca gcccggccct 360

cctgccccac gaagctcccg agctgctcct gctgctgcac cacatcctgt tctgcctgct 420

actcttcgac atggagttct tcgtgtggca cctgctgcac cacaaggtgc cctggctgta 480

ccgcaccttc cacaaggtgc accaccagaa ctcgtcctcg ttcgcgctgg caacgcagta 540

tatgagcgtc tgggaactgt tttctttggg cttcttcgac atgatgaacg tcacactgct 600

cgggtgccac ccgctcacca ccctgacctt ccacgtggtc aacatctggc tttccgtgga 660

ggaccactcc ggctacaact tcccttggtc cactcacaga ctggtgccct tcgggtggta 720

cgggggtgtg gtgcaccacg acctgcatca ctctcacttt aactgcaact tcgctccgta 780

ctttacacac tgggacaaaa tactgggaac gctgcggact gcatctgtcc cagcgcggtg 840

atgtggctgc ggtgggtgcc cctaagactc gggactgctg tgcctttcac acttgaatga 900

agagaaacac ctgagctata tattttttta aagcaactaa cttattgctt tatgtttatc 960

tatgaaaacc atagataaaa tctgatgcat ttttgtaatc tgacaaagta atttacatac 1020

tgtttgtgta tcaatacaat tttgtgttct tggtattctt agtctagctc acctcaatag 1080

ccttgaatcc tgcatatgaa ttagacattc atcactggca tatttagaat atctctaaaa 1140

ggacttgttt gtagaataag gaattttcta tgtttcaaag tgttctaaaa cctggctaaa 1200

agaatgtatt tttgtggatg gtgttgactt ctgactctaa aagcaatcaa acatgtttct 1260

gctggacagt gaccaagaat tatagtacct tcttatattt ttttatagaa ctgtatattt 1320

attttgaaag aaatgttatt cgtgctttaa aaaggaaaaa aaaccatgaa tcaaataa 1378

<210> 2

<211> 272

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Ser Cys His Asn Cys Ser Asp Pro Gln Val Leu Cys Ser Ser Gly

1 5 10 15

Gln Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp Asp His Leu Arg Ser Trp Glu Ala

20 25 30

Leu Leu Gln Ser Pro Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Ile Thr Thr Tyr

35 40 45

Val Gly Phe Cys Leu Pro Phe Val Val Leu Asp Ile Leu Cys Ser Trp

50 55 60

Val Pro Ala Leu Arg Arg Tyr Lys Ile His Pro Asp Phe Ser Pro Ser

65 70 75 80

Ala Gln Gln Leu Leu Pro Cys Leu Gly Gln Thr Leu Tyr Gln His Val

85 90 95

Met Phe Val Phe Pro Val Thr Leu Leu His Trp Ala Arg Ser Pro Ala

100 105 110

Leu Leu Pro His Glu Ala Pro Glu Leu Leu Leu Leu Leu His His Ile

115 120 125

Leu Phe Cys Leu Leu Leu Phe Asp Met Glu Phe Phe Val Trp His Leu

130 135 140

Leu His His Lys Val Pro Trp Leu Tyr Arg Thr Phe His Lys Val His

145 150 155 160

His Gln Asn Ser Ser Ser Phe Ala Leu Ala Thr Gln Tyr Met Ser Val

165 170 175

Trp Glu Leu Phe Ser Leu Gly Phe Phe Asp Met Met Asn Val Thr Leu

180 185 190

Leu Gly Cys His Pro Leu Thr Thr Leu Thr Phe His Val Val Asn Ile

195 200 205

Trp Leu Ser Val Glu Asp His Ser Gly Tyr Asn Phe Pro Trp Ser Thr

210 215 220

His Arg Leu Val Pro Phe Gly Trp Tyr Gly Gly Val Val His His Asp

225 230 235 240

Leu His His Ser His Phe Asn Cys Asn Phe Ala Pro Tyr Phe Thr His

245 250 255

Trp Asp Lys Ile Leu Gly Thr Leu Arg Thr Ala Ser Val Pro Ala Arg

260 265 270

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcctgttctg cctgctactc ttc 23

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggtacagcca gggcacctt 19

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cggagtcaac ggatttggtc gta 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agccttctcc atggtggtga agac 24

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acatggtgtg aagagyctay tgagct 26

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acacggacac ccaaagtagt cggttccgc 29

Claims

1.胆固醇-25-羟化酶、编码胆固醇-25-羟化酶的核酸序列或诱导胆固醇-25-羟化酶表达的物质在制备预防和/或治疗肠道病毒感染所致疾病和/或症状的药物中的用途。

2.权利要求1的用途，其中所述胆固醇-25-羟化酶来源于哺乳动物或人，优选来源于人、牛、羊或鼠，更优选来源于人；或者所述胆固醇-25-羟化酶是重组胆固醇-25-羟化酶，优选重组人、牛、羊或鼠胆固醇-25-羟化酶，更优选重组人胆固醇-25-羟化酶；或者所述胆固醇-25-羟化酶是包含序列SEQ ID NO:2的重组人胆固醇-25-羟化酶。

3.权利要求1的用途，其中所述药物包含编码胆固醇-25-羟化酶的核酸序列及递送所述核酸序列的载体；优选地，所述核酸序列编码氨基酸序列SEQ ID NO:2；或者优选地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:1或其互补序列；或者优选地，所述载体是pCMV6、pcDNA3.1、pEGFP，更优选地，所述载体是pCMV6-XL5；或者优选地，所述药物包含美国Origene公司的胆固醇-25-羟化酶表达载体pCMV6-CH25H-C-Flag。

4.权利要求1的用途，其中所述诱导胆固醇-25-羟化酶表达的物质是TLR4激动剂。

5.权利要求1-4的用途，其中所述药物用于人；优选地，所述药物用于5岁以下的婴幼儿。

6.权利要求1-5的用途，其中所述疾病包括手足口病、急性迟缓性脑瘫、脑炎、脑膜炎、脑干脑炎、脑脊髓炎、脊髓灰质炎样综合征、无菌性脑膜炎、上呼吸道感染、毛细支气管炎、支气管炎、肺炎、疱疹性咽喉炎、胸膜痛、松弛性瘫痪、新生儿败血症；优选所述疾病是手足口病；或者，其中所述症状包括发热，咽喉疼痛，手、足和/或口腔等部位皮肤和/或粘膜出现红斑、水疱和/或溃疡等损害，恶心、呕吐、腹痛、腹泻等消化系统症状，以及神经源性肺水肿、肺出血、呼吸道感染、心血管损伤、心肌炎、肠道出血、肝功能异常以及多器官功能衰竭，流鼻涕，打喷嚏，咳嗽，肌肉痛，哮喘，呼吸困难；优选所述症状包括发热，咽喉疼痛，手、足和/或口腔等部位皮肤和/或粘膜出现红斑、水疱和/或溃疡。

7.用胆固醇-25-羟化酶表达载体抑制体外细胞中的肠道病毒的非治疗目的的方法，所述方法包括：在肠道病毒与细胞接触之前和/或接触同时和/或接触之后，用胆固醇-25-羟化酶表达载体转染细胞；优选地，所述胆固醇-25-羟化酶表达载体是美国Origene公司的胆固醇-25-羟化酶表达载体pCMV6-CH25H-C-Flag。

8.用胆固醇-25-羟化酶、编码胆固醇-25-羟化酶的核酸序列及诱导胆固醇-25-羟化酶表达的物质中的至少一种抑制体外细胞中的肠道病毒的非治疗目的的用途。

9.权利要求1-6的用途、或权利要求7的方法、或权利要求8的用途，其中所述肠道病毒是肠道病毒68型或肠道病毒71型；优选地，所述肠道病毒是肠道病毒71型。

10.权利要求7的方法或权利要求8的用途，其中所述细胞是人的细胞，更优选地，所述细胞是人横纹肌肉瘤细胞。