CN111544581B - 一种过氧化物酶酰基辅酶a氧化酶1的新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于抗病毒药物技术领域，公开了一种过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1的新用途，首先利用昆虫杆状病毒表达系统在昆虫细胞SF9中表达ACOX1蛋白，然后使用镍柱亲和层析的方法对ACOX1蛋白进行纯化，最后在感染EV71的恶性胚胎横纹肌瘤细胞RD细胞中来验证ACOX1蛋白的抗病毒效果。实验结果证明：纯化后的ACOX1蛋白在一定浓度时可以在mRNA水平和蛋白水平抑制EV71病毒的复制。本发明从细胞和分子层面对过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1(ACOX1)抗EV71病毒的作用进行了评价，为其进一步的开发和应用奠定了良好的基础。表明该药物具有开发成为抗EV71病毒的有效药物而应用于临床的前景。

Description

一种过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1的新用途
技术领域
本发明属于抗病毒药物技术领域，尤其涉及一种过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1的新用途。
背景技术
目前，人类肠道病毒71型(Human enterovirus，EV71)属于小RNA病毒科(Picomaradae)肠道病毒属(Enterovirus)。EV71病毒颗粒为正二十面体对称球形结构，没有包膜和刺突，其直径在24–30nm左右。病毒基因组全长为7408bp，为单链正义RNA，基因组中只有一个开放阅读框(ORF)，在ORF的两侧为5’和3’的非编码区(UTRs)，在基因组的3’端末尾还有一个长度可变的多聚腺苷酸尾巴(poly-A)。病毒基因组中的ORF可以编码2194个氨基酸，这些氨基酸组成的多聚蛋白可以产生P1、P2和P3一共3个前体蛋白。其中P1前体蛋白编码4个病毒外壳蛋白，分别为VP1、VP2、VP3和VP4；P2和P3前体蛋白一共编码7个非结构蛋白。其中，VP1蛋白是最主要的衣壳蛋白，含有EV71主要的抗原决定簇，其编码的基因序列与病毒的血清学有很高的相关性，因此常常被用来作为病毒型别的鉴定和基因的进化分析。病毒粒子的衣壳有60个亚单位组成，每一个亚单位都有VP1-VP4形成的五聚体样结构，其抗原决定簇基本上都位于VP1-VP3上。
EV71病毒以人体的上呼吸道、咽喉以及肠道为侵入对象，先在局部的黏膜和扁桃体及咽等淋巴组织和肠道淋巴结集合并初步的扩增，然后将EV71病毒释放入血液，形成第一次病毒血症，EV71病毒随血液扩散到带有其受体的靶组织，再次增殖从而引起第二次病毒血症和一些临床症状。EV71的感染会造成长期的后遗症，例如神经系统后遗症以及认知功能的延迟和降低。肺水肿和出血是儿童感染EV71后引起死亡的主要原因。
目前并没有有效的抗病毒药物来治疗重症的EV71感染，也没有进入临床阶段的疫苗可以使用，所以，避免接触感染的患者和疑似感染患者是预防EV71感染的主要方法。在抗EV71药物的研究方面，吡啶基咪唑啉酮是一类新型粘合剂类的药物，它可以与EV71的VP1蛋白的相互作用，通过使VP1基因的疏水区域的扩大，从而干扰VP1与其受体结合的方法来抑制EV71的复制。另外，细胞因子介导的方法可以用来治疗EV71感染所引起的水肿，例如像利巴韦林就能通过降低感染小鼠组织中的病毒载量来降低EV71感染的死亡率和后续的麻痹后遗症。最后，可以通过接种疫苗的方法来预防EV71的感染，目前EV71的候选疫苗主要包括减毒活性疫苗、基因工程疫苗、DNA疫苗、病毒样颗粒以及转基因疫苗，这些疫苗已在动物实验中得到评估但是临床试验尚未进行。
过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1(Peroxisomal acyl-coenzyme A oxidase 1，ACOX1)是过氧化物酶体(Peroxisome)的重要组分，是脂肪酸β氧化过程中的关键限速酶。过氧化物酶体是真核生物中普遍存在的细胞器，对过氧化氢的降解至关重要。过氧化物酶体中含有多种生成或降解ROS/RNS的酶，对于维持细胞内氧化平衡是至关重要的。在大脑中，过氧化物酶体的主要作用之一是降解长链脂肪酸(VLCFA)，如C24:0和C26:0。
在多种过氧化物酶体紊乱导致的神经退行性疾病中，ACOX1缺乏会导致伪新生儿肾上腺脑白质营养不良(Pseudoneonatal adrenoleukodystrophy，P-NALD)，病人血浆和组织中VLCFA积累产生炎症反应，引起炎性脱髓鞘。ACOX1的缺乏以及VLCFA的积累会引发氧化应激，其特征是活性氧(ROS)的过量产生。除线粒体以外，MAVS也定位在过氧化物酶体上，病毒感染的早期，过氧化物酶体定位的MAVS被激活，并激活III型干扰素，产生抗病毒作用。黄病毒，如西尼罗病毒(West Nile virus)和登革病毒(Dengue virus)感染导致过氧化物酶体发生因子19(Pex19)降解、过氧化物酶体(peroxisome)减少，从而抑制III型干扰素((Interferon-γ，IFN-γ)的激活，逃逸天然免疫。HIV感染的病例的巨噬细胞和脑组织中过氧化物酶体减少，人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)可能通过这一机制抑制天然免疫、引起神经系统病变。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：(1)关于过氧化物酶体以及ACOX1对EV71的抗病毒作用则没有相关报道。
(2)目前还没有有效的抗病毒药物来治疗重症的EV71感染；
(3)疫苗只能预防而不能用于治疗EV71感染，而且预防效果达不到百分之百。
解决以上问题及缺陷的难度为：研发抗病毒药物是一个耗时耗钱的工作，虽然有多个制药公司和研究机构已进行了多年的研发工作，到目前为止还没一个抗EV71的新药上市。
解决以上问题及缺陷的意义为：研发抗EV71感染的药物有助于由EV71感染导致的手足口病的治疗。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1(Peroxisomal acyl-coenzyme A oxidase 1，ACOX1)的新用途，更涉及一种过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1在预防和/或治疗EV71感染中的应用。
本发明是这样实现的，一种过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1(U Varanasi,R Chu,etal.Isolation of the Human Peroxisomal acyl-CoA Oxidase Gene:Organization,Promoter Analysis,and Chromosomal Localization，Proc Natl Acad Sci U SA.1994Apr 12；91(8):3107-11)在制备治疗或预防肠道病毒感染药物的用途。
进一步，过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1蛋白剂量浓度为13.5ng/ml或337.5ng/ml。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述用途中的治疗或预防肠道病毒感染药物制备的药学上接受的剂型，所述剂型以过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1作为药物活性成分，制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂或注射剂中的一种。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述用途中的过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1构建的表达载体(分子克隆第三版，New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2002)。
本发明的另一目的在于提供一种表达载体的构建方法，所述表达载体的构建方法包括：
将ACOX1基因的C端连接上His标签，然后将其克隆到pFastBac载体的PH启动子下，通过测序得到克隆pFastBac-ACOX1。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述用途中的过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1编码的蛋白。
本发明的另一目的在于提供一种蛋白的检测方法，所述蛋白的检测方法包括：
(1)将ACOX1基因的C端连接上His标签，然后将其克隆到pFastBac载体的PH启动子下，通过测序得到克隆pFastBac-ACOX1；
(2)将pFastBac ACOX1转化大肠杆菌(DH10B)，通过Tn7转座子，基因重组得到携带有ACOX1基因的杆状病毒Bacmid-ACOX1；
(3)将Bacmid-ACOX1转染SF9细胞得到P1代重组病毒，经过病毒扩增得到活性最高的P3代重组杆状病毒，并且证明了ACOX1蛋白的成功表达；
(4)用P3代病毒感染SF9悬浮细胞来进行大规模的蛋白表达，然后利用镍柱亲和层析法成功得到了纯化的ACOX1蛋白；
(5)将纯化后的ACOX1蛋白以不同的浓度作用于感染EV71病毒的RD细胞，于8h后提取总RNA，以病毒的VP1结构蛋白作为检测EV71病毒复制的标志物，分别在RNA和蛋白水平检测该蛋白的抗病毒效果。
文献Smith GE,Summers MD,Fraser MJ.Production of human beta interferonin insect cells infected with a baculovirus expression vector[J].Molecularand Cellular Biology,1983,3(12):2156-2165记载有相关Tn7、Bacmid-ACOX1、SF9、P1代重组病毒、P3代重组杆状病毒。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：
本发明首先利用昆虫杆状病毒表达系统在昆虫细胞(SF9)中表达ACOX1蛋白，然后使用镍柱亲和层析的方法对ACOX1蛋白进行纯化，最后在感染EV71的恶性胚胎横纹肌瘤细胞(RD细胞)中来验证ACOX1蛋白的抗病毒效果。实验结果证明：纯化后的ACOX1蛋白在一定浓度时可以在mRNA水平和蛋白水平抑制EV71病毒的复制。
本发明从细胞和分子层面对过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1(ACOX1)抗EV71病毒的作用进行了评价，为其进一步的开发和应用奠定了良好的基础。表明该药物具有开发成为抗EV71病毒的有效药物而应用于临床的前景。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的P3代杆状病毒表达ACOX1蛋白的时间以及表达环境鉴定的示意图。
图2是本发明实施例提供的利用镍柱亲和层析法来纯化蛋白的不同咪唑浓度梯度洗脱图。
图3是本发明实施例提供的不同浓度的ACOX1蛋白抑制EV71病毒mRNA水平的示意图。
图4是本发明实施例提供的不同浓度的ACOX1蛋白抑制EV71病毒蛋白水平的示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1的新用途，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明提供一种过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1在制备治疗或预防肠道病毒感染药物的用途。
过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1蛋白剂量浓度为13.5ng/ml或337.5ng/ml。
优选13.5ng/ml。
本发明提供一种应用所述用途中的治疗或预防肠道病毒感染药物制备的药学上接受的剂型，所述剂型以过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1作为药物活性成分，制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂或注射剂中的一种。
本发明提供一种利用所述用途中的过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1构建的表达载体。
本发明提供一种表达载体的构建方法，所述表达载体的构建方法包括：
将ACOX1基因的C端连接上His标签，然后将其克隆到pFastBac载体的PH启动子下，通过测序得到克隆pFastBac-ACOX1。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述用途中的过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1编码的蛋白。
本发明提供一种蛋白的检测方法，所述蛋白的检测方法包括：
(1)将ACOX1基因的C端连接上His标签，然后将其克隆到pFastBac载体的PH启动子下，通过测序得到克隆pFastBac-ACOX1；
(2)将pFastBac ACOX1转化大肠杆菌(DH10B)，通过Tn7转座子，基因重组得到携带有ACOX1基因的杆状病毒Bacmid-ACOX1；
(3)将Bacmid-ACOX1转染SF9细胞得到P1代重组病毒，经过病毒扩增得到活性最高的P3代重组杆状病毒，并且证明了ACOX1蛋白的成功表达；
(4)用P3代病毒感染SF9悬浮细胞来进行大规模的蛋白表达，然后利用镍柱亲和层析法成功得到了纯化的ACOX1蛋白；
(5)将纯化后的ACOX1蛋白以不同的浓度作用于感染EV71病毒的RD细胞，于8h后提取总RNA，以病毒的VP1结构蛋白作为检测EV71病毒复制的标志物，分别在RNA和蛋白水平检测该蛋白的抗病毒效果。
下面结合具体实验效果对本发明作进一步描述。
图1为P3代杆状病毒表达ACOX1蛋白的时间以及表达环境鉴定的示意图。
图2为利用镍柱亲和层析法来纯化蛋白的不同咪唑浓度梯度洗脱图。
图3为不同浓度的ACOX1蛋白抑制EV71病毒mRNA水平的示意图。
图4为不同浓度的ACOX1蛋白抑制EV71病毒蛋白水平的示意图。
实验结果表明：纯化后的ACOX1蛋白在一定浓度时可以明显的抑制EV71病毒VP1的mRNA水平，免疫印迹结果也显示该蛋白可以在相同浓度时抑制VP1蛋白水平的表达。从而证明了该蛋白就用抗E71病毒复制的功能。
本发明发现了过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1新的药用价值，为抗肠道病毒71型、治疗和/或预防EV71感染提供了新有效药物。
实验结果证明P3代病毒感染昆虫细胞(sf9)第三天ACOX1蛋白表达效果最好，且该蛋白是胞内表达。
结果证明在咪唑浓度为112mM时，ACOX1蛋白可以被大量的洗脱下来，并且杂蛋白很少，从而可以得到纯化的蛋白。
结果显示在ACOX1蛋白浓度为13.5ng/ml和337.5ng/ml时，EV71病毒的VP1蛋白的mRNA水平与不加病毒的对照组相比有明显的下降，说明当蛋白在此浓度时对EV71病毒的mRNA的产生有比较明显的抑制作用。
结果显示当蛋白的浓度为189ng/ml和360ng/ml时，与只加入病毒的对照组相比，VP1的蛋白水平有明显的下降，说明在此浓度时，ACOX1蛋白对于EV71病毒的复制有比较明显的抑制作用。
在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上；术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、“头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种人源的过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1在制备治疗或预防EV71肠道病毒感染药物的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1蛋白剂量浓度为13.5ng/ml或337.5ng/ml。
3.如权利要求1~2任意一项所述用途，其特征在于，以过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1作为药物活性成分，制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂或注射剂中的一种。
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