CN102178678B

CN102178678B - 石蒜碱在制备治疗人肠道病毒71型感染引发疾病的药物的应用

Info

Publication number: CN102178678B
Application number: CN 201110066315
Authority: CN
Inventors: 张连峰; 杨亚军; 刘江宁; 秦川; 马春梅
Original assignee: Institute of Laboratory Animal Science of CAMS
Current assignee: Institute of Laboratory Animal Science of CAMS
Priority date: 2011-03-18
Filing date: 2011-03-18
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2031-03-18
Also published as: CN102178678A

Abstract

本发明属于医药领域，公开了石蒜碱、石蒜碱盐、石蒜碱水合物、石蒜碱光学异构体或石蒜碱前药在治疗人肠道病毒71型感染引发疾病的药物的应用，作为优选，所述人肠道病毒71型感染引发的疾病为手足口病、疱疹性咽峡炎、病毒性脑膜炎、病毒性脑炎、迟缓性麻痹、肺水肿和病毒性心肌炎。体外及体内试验表明石蒜碱可以抑制EV71在细胞中的复制和病变，具有良好的抑制EV71病毒作用，具有临床应用前景。

Description

石蒜碱在制备治疗人肠道病毒71型感染引发疾病的药物的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，特别涉及石蒜碱作为治疗人肠道病毒71型感染引发疾病的药物的应用。

背景技术

石蒜碱属于吡咯并菲啶型生物碱，分子式为C₁₆H₁₇NO₄，存在于传统药用植物石蒜的鳞茎内，是其含量较高的生物碱成分，其结构式如下所示：

石蒜碱有较显著的催吐作用，毒性较小；有祛痰作用。石蒜碱经氢化后生成二氢石蒜碱，后者具有较强的抗阿米巴痢疾作用，且毒性较小，已供临床使用。石蒜碱的丙胺盐在动物身上表现出抗肿瘤作用。生物活性研究表明，石蒜碱及其衍生物具有抗炎、抗疟疾、抑制乙酰胆碱酯酶、保护心血管作用。

人肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、致肠细胞病变人孤儿病毒(简称埃可病毒)、新型肠道病毒等共71个种，每个种各有特点。

人肠道病毒71型为一种新型肠道病毒，简称为EV71，常引起儿童手足口病、病毒性咽峡炎、肺水肿、病毒性脑炎等疾病，统称为肠道病毒71型感染。该病多发生于儿童，少数病情较重，甚至会引起死亡。该病一年四季都可发生，常见于4-9月份。

肠道病毒71型感染患儿多以发热起病，一般为38℃左右，发热同时在口腔、手足、臀部出现皮疹，或出现口腔内溃疡、粘膜疹。部分病人早期有咳嗽等感冒样表现。少数患儿可出现严重并发症。这类病人大多持续高热，病情发展迅速，多在发病后3-5天内出现中枢神经系统、呼吸系统、循环系统严重并发症，并可引起死亡，死亡原因主要为脑水肿、脑疝，中枢性呼吸、循环衰竭。

目前未见能够有效抑制EV71感染药物的报道。

发明内容

本发明的主要目的在于提供石蒜碱在治疗人肠道病毒71型感染引发疾病的药物的应用。

肠道病毒71型属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员，归属于人类肠道病毒A。该病毒的颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突出，直径约24～30nm，核酸为单股正链RNA。EV71型病毒基因组编码的分子量分别为34KD、30KD、26KD和7KD的多肽VP1(α)、VP2(β)、VP3(γ)、VP4(δ)，构成原聚体，后者再拼装成具有五聚体样结构的亚单位，60个亚单位通过各自的结构域相互连接，最终形成病毒的外壳。VP1、VP2和VP3三个多肽暴露在病毒外壳的表面，而VP4包埋在病毒外壳的内侧与病毒核心紧密连接，因而抗原决定簇基本上位于VP1-VP3上。EV71病毒由于没有类脂膜，所以它对乙醚、脱氧胆酸盐、去污剂以及弱酸有抵抗性。此外，该病毒还能抵抗70％乙醇和5％甲酚皂溶液等常见的消毒剂。

EV71病毒的基因组为含有大约7411个核苷酸(7423/MS/87株)的单股正链RNA，腺嘌呤核苷酸和尿嘧啶核苷酸丰富(A+U＝52.8)。RNA中仅有一个开放阅读框(ORF)，编码含2194个氨基酸的多聚蛋白，在其两侧为5′和3′非编码区(UTRs)，它与其他肠道RNA病毒一样，在3′末端有多聚腺苷酸(poly A)尾，而其5′末端共价结合有一个小分子量的蛋白(VPg)。病毒的单链RNA具有感染性。

EV71病毒的基因组从5′末端至3′末端依次排列着含有746个核苷酸的5′非编码区(UTR)、编码区1A(多肽VP4)、1B(多肽VP2)、1C(多肽VP3)、1D(多肽VP1)、2A(特异性蛋白酶)、2B、2C、3A、VPg(5′末端结合蛋白)、3C(特异性蛋白酶)、3D(RNA多聚酶组分)、3′末端非编码区(83个核苷酸)以及多聚腺苷酸尾(AAAn)。

EV71病毒衣壳蛋白VP1是该病毒主要的中和决定因子，它直接决定病毒的抗原性。VP1基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性，VP1基因序列不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据.并可作为小RNA病毒科内不同属的分类参考，因此VP1基因成了EV71基因分型和遗传进化分析的最重要的对象。目前基于VP1核苷酸序列的差异，可将EV71分为A、B、C等三个基因型，A型仅包括原型株BrCr-CA-70；B型和C型又可进一步分为B1、B2、B3、B4以及c1、c2、C3和C4亚型。

本发明所述肠道病毒71型感染引发的疾病是指肠道病毒71型感染导致感染性疾病，包括手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑炎、迟缓性麻痹、肺水肿和病毒性心肌炎等多种疾病。

肠道病毒71型发病特点、侵犯部位和疫情规律与同属的其他病毒如脊髓灰质炎病毒或柯萨奇病毒不同，而且脊髓灰质炎病毒与人肠道病毒71型的核苷酸同源性仅为55％，而柯萨奇病毒与人肠道病毒71型的同源性也不超过80％。三种病毒间的疫苗均无交叉保护活性。

本发明还提供石蒜碱盐、石蒜碱水合物、石蒜碱光学异构体或石蒜碱前药在治疗人肠道病毒71型感染引发疾病的药物的应用。

所述石蒜碱盐包含无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐或硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐或磷酸氢盐等以及有机酸盐如甲酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、丁二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、葡糖酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐。

本发明利用实验室所建立的EV71感染人横纹肌瘤细胞模型和小鼠模型，对石蒜碱抑制人肠道病毒71型复制和治疗人肠道病毒71型感染引发疾病的效果进行了研究，结果显示：病毒感染72小时后1未经治疗组可见细胞大量病变，而经1微克/毫升石蒜碱治疗的细胞未见明显病变，有效保护50％人横纹肌瘤细胞免受EV71感染的石蒜碱浓度为0.5微克/毫升，而当药物浓度大于等于1微克/毫升时，能够完全抑制病毒导致的人横纹肌瘤细胞病变。

EV71感染小鼠模型研究结果显示：每天给予1毫克/千克体重剂量的石蒜碱，持续给药7天，感染小鼠的症状减弱：体重下降和瘫痪特征明显变缓，小鼠的死亡率降低到40％以下，而模型组小鼠死亡率为100％，说明石蒜碱对EV71A、B、C三个基因型所致感染均具有治疗作用，有临床应用前景。

附图说明

图1为EV71病毒感染72小时后1微克/毫升石蒜碱治疗的细胞与未经药物治疗的细胞。

图2显示石蒜碱对EV71病毒的剂量-抑制曲线。

图3显示不同剂量石蒜碱治疗EV71感染小鼠的生存率。

具体实施方式

本发明公开了石蒜碱、石蒜碱的盐、石蒜碱水合物、石蒜碱的光学异构体或石蒜碱的前药在制备治疗人肠道病毒71型感染引发的疾病的药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：石蒜碱抑制EV71在细胞中的复制

在EV71感染人横纹肌瘤细胞模型中，将新培养24小时人横纹肌瘤细胞接种至96孔板中，每孔细胞数量2×10⁴个。37℃孵箱中培养24小时候，开始接种病毒。

所使用EV71为中国大陆地区流行毒株，菌株名称FY0805，分离自安徽阜阳，基因序列在NCBI中存储号为HQ882182。病毒接种细胞的剂量为100TCID₅₀，体积为98微升，继续在37℃孵箱中培养。

盐酸石蒜碱用生理盐水溶解，并在病毒感染细胞2小时后给药，药物体积为2微升。药物终浓度分别为0.1微克/毫升、0.5微克/毫升、1微克/毫升、2微克/毫升、5微克/毫升、10微克/毫升。观察3天内细胞病变，根据细胞病变的孔数计算药物的有效浓度。

结果见附图1和附图2。附图1为光镜下病毒感染72小时后1微克/毫升石蒜碱治疗的细胞与未经药物治疗的细胞。未经治疗组(左图)可见细胞大量病变，而经1微克/毫升石蒜碱治疗的细胞(右图)未见明显病变。

附图2为石蒜碱对EV71病毒的抑制曲线，显示有效保护50％人横纹肌瘤细胞免受EV71感染的石蒜碱浓度为0.5微克/毫升，而当药物浓度大于等于1微克/毫升时，能够完全抑制病毒导致的人横纹肌瘤细胞病变。

实验方法同上，对从中国大陆不同地区分离的4株EV71流行株(A、B、C三个基因型)的抑制效果进行了研究，结果表明，4株不同地区分离的EV71病毒(A、B、C三个基因型)感染人横纹肌瘤细胞时，石蒜碱抑制半数细胞病变的浓度均为0.5微克/毫升。

实施例2：石蒜碱对EV71感染小鼠的治疗效果

本实验的试验目的是验证石蒜碱在小鼠体内对EV71治疗效果，所用模型为中国大陆地区流行EV71毒株感染10日龄ICR小鼠的模型。毒株为临床分离株FY0805在小鼠体内的适应株，毒株名为MP10，基因序列在NCBI中存储号为HQ712020。以1×10⁷TCID₅₀剂量的MP10病毒经腹腔注射感染10日龄ICR小鼠后，可导致小鼠在4日内表现出后肢瘫痪和体重减轻症状，并于感染后10天内全部死亡。

应用上述模型，对石蒜碱的治疗效果进行体内评价。使用小鼠为SPF级ICR小鼠，10日龄，雌雄各半。首先，经腹腔注射对小鼠进行病毒感染，感染1天后开始经腹腔注射给药(石蒜碱用生理盐水溶解)，设置剂量分别为0.2毫克/千克体重/天、1毫克/千克体重/天、4毫克/千克体重/天，每组小鼠数量为30只。每天分两次给药，间隔12小时，连续给药7天。自病毒感染之日起，持续观察14天，每天观察2次，记录小鼠的体重、症状和生存率，评价石蒜碱对EV71感染的治疗效果。本实验重复两次。

结果表明：每天给予1毫克/千克体重剂量的石蒜碱，持续给药7天，感染小鼠的症状减弱：体重下降和瘫痪特征明显变缓，小鼠的死亡率降低到40％以下，而模型组小鼠死亡率为100％见附图3所示，体内实验说明石蒜碱对EV71感染具有治疗作用。

实验方法同上，对其它株EV71流行株(A、B、C三个基因型)的抑制效果进行了研究，结果表明，石蒜碱对EV71病毒A、B、C三个基因型所致感染均具有治疗作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.石蒜碱在制备治疗人肠道病毒71型感染引发的疾病的药物中的应用，所述人肠道病毒71型感染引发的疾病为手足口病、疱疹性咽峡炎、病毒性脑膜炎、病毒性脑炎、迟缓性麻痹、肺水肿和病毒性心肌炎。

2.石蒜碱的盐在制备治疗人肠道病毒71型感染引发的疾病的药物中的应用，所述人肠道病毒71型感染引发的疾病为手足口病、疱疹性咽峡炎、病毒性脑膜炎、病毒性脑炎、迟缓性麻痹、肺水肿和病毒性心肌炎。

3.根据权利要求2所述的应用，所述石蒜碱的盐包括石蒜碱无机酸盐和石蒜碱有机酸盐。

4.根据权利要求3所述的应用，所述石蒜碱无机酸盐选自石蒜碱的盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐或磷酸氢盐。

5.根据权利要求3所述的应用，所述石蒜碱有机酸盐选自石蒜碱的甲酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、丁二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、葡糖酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐。