CN103054988A

CN103054988A - 清热祛湿冲剂在制备防治手足口病中药中的应用

Info

Publication number: CN103054988A
Application number: CN2013100113043A
Authority: CN
Inventors: 李耿; 赖小平; 许仕杰; 姚海燕
Original assignee: Dongguan Institute of Traditional Chinese Medicine Engineering Guangzhou Univers
Current assignee: Dongguan Institute of Traditional Chinese Medicine Engineering Guangzhou Univers
Priority date: 2013-01-11
Filing date: 2013-01-11
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2033-01-11
Also published as: CN103054988B

Abstract

本发明涉及清热祛湿冲剂在制备防治EV71型肠道病毒感染引起的手足口病中药中的应用。所述的清热祛湿冲剂为国家正式批准生产和上市的中成药，其国药准字号为Z44020564，处方组成为：党参30g，茵陈45g，岗梅根75g，黄芪45g，苍术15g，野菊花75g，陈皮15g。本发明所涉及的清热祛湿冲剂能抑制肠道病毒EV71在RD细胞上复制，减少RD细胞的病变，具有抗肠道病毒EV71的作用，用于防治手足口病的效果显著。

Description

清热祛湿冲剂在制备防治手足口病中药中的应用

技术领域

本发明涉及医用配制品，具体涉含来自植物的未确定结构的药物制剂。

背景技术

手足口病（Hand-foot-mouth disease,HFMD）是由多种肠道病毒引起的常见传染病，以婴幼儿发病为主。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征。少数患者可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，个别重症患者儿病情进展快，已发生死亡。少年儿童和成人感染后多不发病，但能够传播病毒。手足口病的症状表现为：急性起病，发热，手掌或脚掌部出现斑丘疹和疱疹，臀部或膝盖也可出现皮疹。皮疹周围有炎性红晕，疱内液体较少；口腔黏膜出现散在的疱疹，疼痛明显。部分患儿可伴有咳嗽、流涕、食欲不振、恶心、呕吐和头疼等症状。

手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。1957年在新西兰首次报道该病，1958年第一次分离出柯萨奇病毒，1959年提出并命名为手足口病。我国于1981年上海首次报道本病，此后，北京、河北、天津、福建、吉林、安徽等10几个省份均有本病报道。1983年天津发生CoxA16引起的手足口病暴发，5-10月间发生了7000余病例。1995年武汉病毒研究所从手足口病人中分离出EV71。2008年HFMD疫情在安徽省阜阳市暴发，共发生HFMD病例4496例，死亡22例，其病原体为EV71。2010年全国报告1795336例患者，死亡888例，流行呈逐年增加的趋势，严重威胁着人类的健康和全球经济的发展。

引起手足口病的肠道病毒包括肠道病毒71型（EV71）和A组柯萨奇病毒（CoxA）、埃可病毒（Echo）等某些血清型。EV71病毒颗粒为二十面体对称的球形结构，无包膜和突起，直径大约在24～30nm。病毒颗粒的衣壳共包括60个亚单位,分别由4种衣壳蛋白（VP1-VP4）拼装成五聚体样结构。4种结构蛋白中,除VP4包埋在病毒颗粒外壳的内侧与病毒的核心紧密连接以外，其他3种结构蛋白均暴露在病毒颗粒的表面，因而抗原决定簇基本上位于这三种蛋白上。病毒基因组为712～815kb核苷酸单股正链RNA，基因组中仅有一个开放阅读框,编码含2194个氨基酸的多聚蛋白,在其两侧为5′和3′非编码区,在3′非编码区的末端含有一个长度可变的多聚腺苷酸尾巴（polyA）。该多聚蛋白可进一步被水解成P1、P2、P33个前体蛋白。P1前体蛋白编码VP1、VP2、VP3、VP44个病毒外壳蛋白；P2和P3前体蛋白编码7个非结构蛋白，包括2A（特异性蛋白水解酶）、2B、2C、3A、VPg（5′蛋白水解酶）、3C（特异性蛋白水解酶）、3D（RNA多聚酶组分）。据推测，5′非编码区可能与病毒株的致病性有关。

目前防治手足口病的最有效手段是接种疫苗，但至今仍未开发出供临床应用的的手足口病病毒疫苗，从而加大了防治的难度。由于目前尚无特异、高效的抗病毒药物，对症处理是临床的主要治疗原则，利用更昔洛韦、病毒唑、干扰素进行抗病毒治疗，但最终还需靠人的自身免疫力治愈，且大多数的西药都可能导致严重的副作用。

清热祛湿冲剂（国药准字Z44020564)是一种治疗暑湿热病的中药制剂，其有效成分由以下原料药制成：党参30g，茵陈45g，岗梅根75g，黄芪45g，苍术15g，野菊花75g，陈皮15g。该颗粒剂具有清热祛湿，益气生津的作用，用于暑湿病邪引起的四肢疲倦，食欲不振，身热口干症状，对于治疗暑热、湿热有显著效果，但目前尚未有该清热祛湿冲剂有防治手足口病的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供清热祛湿冲剂在制药中的新用途。

清热祛湿冲剂在制药中的新用途是：

清热祛湿冲剂在制备防治EV71型肠道病毒感染引起的手足口病中药中的应用。所述的清热祛湿冲剂为国家正式批准生产和上市的中成药，国药准字号为Z44020564，其每1000g中所含的有效成分由以下原料制得：

党参30g、茵陈45g、岗梅根75g、黄芪45g、苍术15g、野菊花75g和陈皮15g。

上述的清热祛湿冲剂可按代号为WS3-B-1841-94的部颁标准所规定的方法制备（见中药成方制剂第九册第81页），该方法的具体步骤为：

取野菊花、苍术、陈皮加水蒸馏，收集蒸馏液30ml，加入乙醇使含乙醇量为50%；药渣与党参，茵陈，岗梅根，黄芪四味药，加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩成稠膏，加蔗糖适量，混匀，制粒，干燥，喷入上述蒸馏后的乙醇溶液，制成1000g，即得。

本发明所涉及的清热祛湿冲剂除了具有治疗暑湿热病的作用外，还能抑制肠道病毒EV71在RD细胞上复制，减少RD细胞的病变，具有抗肠道病毒EV71的作用，用于防治手足口病的效果显著。当所述的清热祛湿冲剂用于防治手足口病时，其用法如下：每次10g，一日3次，7天一个疗程；儿童每次5g，一日3次，7天一个疗程。

为了公众能更好地理解本发明的有益效果，下面将通过实施例和体外细胞实验进一步阐明。

附图说明

图1为清热祛湿冲剂对RD细胞的细胞毒性示意图，该图是不同浓度药物加入到RD细胞中培养60h后，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测药物对细胞生长的影响结果图。

图2为清热祛湿冲剂抗肠道病毒EV71的作用示意图，该图是不同浓度药物加入肠道病毒EV71侵染的RD细胞中培养60h后，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测药物对肠道病毒EV71抑制的影响结果图。

具体实施方式

1实验材料与方法

1.1细胞、病毒

RD细胞购自美国模式菌种收集中心（ATCC），病毒EV71由广州市儿童医院中心实验室惠赠。

1.2药物

受试药物：清热祛湿冲剂，广东众生药业股份有限公司，批号：111203。所述受试药物按代号为WS3-B-1841-94的部颁标准生产（见中药成方制剂第九册第81页），具体步骤组如下：

（1）取野菊花75g、苍术15g和陈皮15g加水蒸馏，收集蒸馏液30ml，加入乙醇使含乙醇量约为50%；

（2）药渣与党参30g，茵陈45g，岗梅根75g，黄芪45g四味药，加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩成稠膏，加蔗糖适量，混匀，制粒，干燥，喷入上述蒸馏后的乙醇溶液，制成1000g，即得。

对照药物：利巴韦林注射液，由广州市白云山天心制药股份有限公司，批号：120201。

1.3实验仪器

倒置显微镜（Nikon，型号：TMS-F）、酶标仪（BIO-RAD，型号：iMark）

2实验方法

2.1细胞培养

37℃，5%（体积比，以下相同）CO₂加湿培养箱中培养。使用含有10%（体积比，以下相同）FBS、100U/ml的青霉素和链霉素的DMEM培养基。细胞至90%汇合度后传代，传代比例1/3-1/4。

2.2病毒培养

接种EV71病毒200ul/孔于已经长满90%细胞的24孔板，置37℃，5%CO2培养箱中，吸附1h，加入含1%FBS的维持液，次日换液，逐日观察，待3/4细胞出现病变时，放在-80℃冰箱中冻存20min，自然解冻20min，反复3次，13000rpm，10min，4℃离心，过滤膜，取上清液，每管0.5ml分装于无菌离心管（1.5ml）中，冷冻保存于-80℃备用。

2.3TCID₅₀肠道病毒EV71感染性的测定

2.3.1TCID₅₀的测定

选择经24-48h培养后生长旺盛、成层良好的RD细胞细胞1瓶，倾弃生长液，加入1ml胰酶，37℃消化2-3min，用含10%FBS的DMEM生长液分散细胞，使细胞胞悬液浓度为2×10⁴个/孔。用移液器将细胞悬液加入96孔板中，每孔100ul。将培养板置于37℃，5%CO₂温箱中培养12～18小时，待细胞长成单层后备用；将肠道病毒EV71用含1%FBS的维持液作10倍稀释系列成10个浓度，弃去培养板中的生长液，每孔加入不同稀释度的病毒液100ul，每个稀释度6孔。6个对照孔加入维持液100ul，37℃吸附1h，然后各孔再加入维持液100ul，轻轻摇匀，37℃，5%CO2培养箱培养3天，逐日观察记录各孔细胞病变情况。

2.3.2结果统计

细胞全部出现CPE判为（++++）；50%-75%细胞出现CPE为（+++）；25%-50%细胞出现CPE（++）；25%以内细胞出现CPE为（+）；无CPE为（—）。并根据Reed和Muench方法对病毒滴度进行计算，最终获得TCID₅₀/100微升；距离比=（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%的病变率）LogTCID₅₀＝距离比*稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数，结果见表1。

表1肠道病毒EV71接种RD细胞的TCID₅₀滴度统计

测定结果显示肠道病毒EV71的TCID₅₀为10^-5.6/100ul

2.4清热祛湿冲剂对RD细胞毒性作用

RD细胞按2×10⁴个/孔（100ul）接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用；用细胞维持液将药物2倍稀释成9个梯度，每孔100μl，每个浓度6孔，同时设立6孔正常细胞对照、空白组，置37℃、5%CO₂培养箱，每日在倒置显微镜下观察细胞形态，连续观察60h。吸去培养液，PBS润洗一遍，每孔加入100uL的0.5mg/mL MTT溶液，37℃孵育4h，弃去MTT，加入150uL DMSO，震荡5min，于酶标仪测定490nm波长处的OD值，计算各药物浓度细胞存活率，结果见图1。

结果显示清热祛湿冲剂在8mg/ml-0.5mg/ml范围内对RD细胞没有明显细胞毒性，说明清热祛湿冲剂有比较安全的范围，即清热祛湿冲剂的给药剂量按照细胞实验用量为8mg/ml-2mg/ml。

2.5清热祛湿冲剂的抗病毒药效作用

RD细胞按2×10⁴个/孔（100ul）接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用；细胞在96孔板中长成单层后，吸去培养液，每孔加入100ul的100TCID₅₀病毒液和100ul的不同稀释浓度的清热祛湿冲剂药液，每一药物浓度设置4个复孔，同时设置空白对照组、正常细胞对照组、病毒对照组和阳性对照组。继续将培养板置于37℃，5%CO2温箱中培养，逐日观察细胞病变效应，约在病毒对照组75%-100%病变时吸去含药维持液，加入100ul的PBS润洗一遍，每孔加入100uL的0.5mg/mL MTT溶液，37℃孵育4h，弃去MTT，加入150uL DMSO，震荡5min，于酶标仪测定490nm波长处的OD值，计算药物的病毒抑制率，结果见图2。

结果显示在不影响细胞活性的浓度下，清热祛湿冲剂可以抑制肠道病毒EV71在RD细胞中的复制，在浓度为8mg/ml情况下，清热祛湿冲剂的抑制率为92.2%，说明清热祛湿冲剂具有体外抗肠道病毒EV71的药效作用，具有显著的防治手足口病的作用。

Claims

1.清热祛湿冲剂在制备防治EV71型肠道病毒感染引起的手足口病中药中的应用；所述的清热祛湿冲剂，每1000g中所含的有效成分由以下原料制得：

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述的清热祛湿冲剂的制备方法由以下步骤组成：

取野菊花、苍术和陈皮加水蒸馏，收集蒸馏液30ml，加入乙醇使含乙醇量为50%；药渣与党参、茵陈、岗梅根和黄芪四味药，加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩成稠膏，加蔗糖适量，混匀，制粒，干燥，喷入上述蒸馏后的乙醇溶液，制成1000g，即得。