CN103070991A

CN103070991A - 克感利咽口服液在制备防治手足口病中药中的应用

Info

Publication number: CN103070991A
Application number: CN201310015183XA
Authority: CN
Inventors: 李耿; 赖小平; 许仕杰; 姚海燕
Original assignee: Dongguan Institute of Traditional Chinese Medicine Engineering Guangzhou Univers
Current assignee: Dongguan Institute of Traditional Chinese Medicine Engineering Guangzhou Univers
Priority date: 2013-01-15
Filing date: 2013-01-15
Publication date: 2013-05-01

Abstract

本发明涉及克感利咽口服液在制备防治EV71型肠道病毒感染引起的手足口病中药中的应用。所述的克感利咽口服液为国家正式批准生产和上市的中成药，其国药准字号为Z10970100，它由以下原料药制成的有效成分与适量的聚山梨酯80、甜菊苷和苯甲酸钠混合加水至去离子水至1000ml制得：金银花72g、黄芩72g、荆芥72g、栀子72g、连翘72g、玄参72g、僵蚕43g、地黄108g、射干22g、桔梗43g、薄荷43g、蝉蜕43g、防风43g和甘草22g。本发明所涉及的克感利咽口服液能抑制肠道病毒EV71在RD细胞上复制，减少RD细胞的病变，具有抗肠道病毒EV71的作用，用于防治手足口病的效果显著。

Description

克感利咽口服液在制备防治手足口病中药中的应用

技术领域

本发明涉及医用配制品，具体涉含来自植物的未确定结构的药物制剂。

背景技术

手足口病（Hand-foot-mouth disease,HFMD）是由多种肠道病毒引起的常见传染病，以婴幼儿发病为主。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征。少数患者可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，个别重症患者儿病情进展快，已发生死亡。少年儿童和成人感染后多不发病，但能够传播病毒。手足口病的症状表现为：急性起病，发热，手掌或脚掌部出现斑丘疹和疱疹，臀部或膝盖也可出现皮疹。皮疹周围有炎性红晕，疱内液体较少；口腔黏膜出现散在的疱疹，疼痛明显。部分患儿可伴有咳嗽、流涕、食欲不振、恶心、呕吐和头疼等症状。

手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。1957年在新西兰首次报道该病，1958年第一次分离出柯萨奇病毒，1959年提出并命名为手足口病。我国于1981年上海首次报道本病，此后，北京、河北、天津、福建、吉林、安徽等10几个省份均有本病报道。1983年天津发生CoxA16引起的手足口病暴发，5-10月间发生了7000余病例。1995年武汉病毒研究所从手足口病人中分离出EV71。2008年HFMD疫情在安徽省阜阳市暴发，共发生HFMD病例4496例，死亡22例，其病原体为EV71。2010年全国报告1795336例患者，死亡888例，流行呈逐年增加的趋势，严重威胁着人类的健康和全球经济的发展。

引起手足口病的肠道病毒包括肠道病毒71型（EV71）、A组柯萨奇病毒（CoxA）和埃可病毒（Echo）等某些血清型。EV71病毒颗粒为二十面体对称的球形结构，无包膜和突起，直径大约在24～30nm。EV71病毒颗粒的衣壳共包括60个亚单位,分别由4种衣壳蛋白（VP1-VP4）拼装成五聚体样结构。4种结构蛋白中,除VP4包埋在病毒颗粒外壳的内侧与病毒的核心紧密连接以外，其他3种结构蛋白均暴露在病毒颗粒的表面，因而抗原决定簇基本上位于这三种蛋白上。病毒基因组为712～815kb核苷酸单股正链RNA，基因组中仅有一个开放阅读框,编码含2194个氨基酸的多聚蛋白,在其两侧为5′和3′非编码区,在3′非编码区的末端含有一个长度可变的多聚腺苷酸尾巴（polyA）。该多聚蛋白可进一步被水解成P1、P2、P33个前体蛋白。P1前体蛋白编码VP1、VP2、VP3、VP44个病毒外壳蛋白；P2和P3前体蛋白编码7个非结构蛋白，包括2A（特异性蛋白水解酶）、2B、2C、3A、VPg（5′蛋白水解酶）、3C（特异性蛋白水解酶）、3D（RNA多聚酶组分）。据推测，5′非编码区可能与病毒株的致病性有关。

目前防治手足口病的最有效手段是接种疫苗，但至今仍未开发出供临床应用的的手足口病病毒疫苗，从而加大了防治的难度。由于目前尚无特异、高效的抗病毒药物，对症处理是临床的主要治疗原则，利用更昔洛韦、病毒唑、干扰素进行抗病毒治疗，但最终还需靠人的自身免疫力治愈，且大多数的西药都可能导致严重的副作用。

克感利咽口服液（国药准字Z10970100)是一种治疗感冒的中药制剂，其有效成分由以下原料药制成：金银花72份、黄芩72份、荆芥72份、栀子（炒制）72份、连翘72份、玄参72份、僵蚕（姜制）43份、地黄108份、射干22份、桔梗43份、薄荷43份、蝉蜕43份、防风43份和甘草22份。该口服剂具有疏风清热，解毒利咽的作用，用于风热外侵、邪热内扰证者，对于治疗流行性感冒有显著效果。公开号为CN101564475A的发明专利申请还公开了上述克感利咽口服液可抗禽流感病毒，抑制禽流感病毒致小鼠肺部炎症，并能降低禽流感病毒感染小鼠的死亡率并延长其存活时间，具有显著的防治禽流行性感冒的作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供克感利咽口服液在制药中的新用途。

克感利咽口服液在制药中的新用途是：

克感利咽口服液在制备防治EV71型肠道病毒感染引起的手足口病中药中的应用。所述的克感利咽口服液为国家正式批准生产和上市的中成药，国药准字号为210970100，其每1000ml中所含的有效成分由以下原料制得：

金银花72g、黄芩72g、荆芥72g、栀子72g、连翘72g、玄参72g、僵蚕43g、地黄108g、射干22g、桔梗43g、薄荷43g、蝉蜕43g、防风43g和甘草22g；其中，所述的栀子为经炒制的栀子，所述僵蚕为经姜制的僵蚕。

本发明所述克感利咽口服液还可含有聚山梨酯80、甜菊苷和苯甲酸钠等辅料。

上述克感利咽口服液的制备方法由以下步骤组成：

（1）取金银花、荆芥、防风和薄荷用水蒸汽蒸馏法提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集；

（2）取黄芩加65%乙醇提取2次，每次2小时，回收乙醇，加水适量煮沸，趁热滤过，滤液备用；

（3）将步骤（2）黄芩用乙醇提取后的药渣及步骤（1）金银花、荆芥、防风和薄荷提取挥发油后的药渣与栀子、连翘、玄参、僵蚕、地黄、射干、桔梗、蝉蜕和甘草加水煎煮2次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液与步骤（1）所得水溶液合并，浓縮至在70℃时相对密度为1.06～1.11，加入乙醇使醇含量达60%（v/v），静置，滤过，滤液回收乙醇并浓縮至在70℃时相对密度为1.16～1.20，加入步骤（2）所得滤液，浓缩，干燥，得药粉；

（4）将步骤（1）所得到的挥发油和步骤（3）所得到的药粉混合，加入去离子水至1000ml，分装，灭菌，即得。

上述方法中的步骤中，还可以取适量聚山梨酯80、甜菊苷和苯甲酸钠等辅料与步骤（1）所得到的挥发油和步骤（3）所得到的药粉一道混合。

本发明所涉及的克感利咽口服液除了具有治疗普通感冒的作用外，还能抑制肠道病毒EV71在RD细胞上复制，减少RD细胞的病变，具有抗肠道病毒EV71的作用，用于防治手足口病的效果显著。当所述的克感利咽口服液用于防治手足口病时，其用法如下：每次20毫升，一日3次，7天一个疗程；儿童每次10毫升，一日3次，7天一个疗程。

为了公众能更好地理解本发明的有益效果，下面将通过实施例和体外细胞实验进一步阐明。

附图说明

图1为克感利咽口服液对RD细胞的细胞毒性示意图，该图是不同浓度药物加入到RD细胞中培养60h后，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测药物对细胞生长的影响结果图。

图2为克感利咽口服液抗肠道病毒EV71的作用示意图，该图是不同浓度药物加入肠道病毒EV71侵染的RD细胞中培养60h后，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测药物对肠道病毒EV71抑制的影响结果图。

具体实施方式

1实验材料与方法

1.1细胞、病毒

RD细胞购自美国模式菌种收集中心（ATCC），病毒EV71由广州市儿童医院中心实验室惠赠。

1.2药物

受试药物：克感利咽口服液，由广州王老吉药业股份有限公司生产，生产批号为120303。所述受试药物的具体制备方法由以下步骤组成：

（1）取金银花72g、荆芥72g、防风43g和薄荷43g用水蒸汽蒸熘法提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集；

（2）取黄芩72g加65%（v/v）乙醇提取2次，每次2小时，回收乙醇，加水适量煮沸，趁热滤过，滤液备用；

（3）将步骤（2）黄芩乙醇提取后的药渣及步骤（1）金银花、荆芥、防风和薄荷提取挥发油后的药渣与梔子72g、连翘72g、玄参72g、僵蚕43g、地黄108g、射干22g、桔梗43g、蝉蜕43g和甘草22g加水煎煮2次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液与金银花经蒸馏后的水溶液合并，浓缩至在70℃时相对密度为1.06-1.21，加入乙醇使醇含量达60%（v/v），静置，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至在70℃时相对密度为1.06-1.21，加入步骤（2）黄芩乙醇提取液，浓缩，干燥，得药粉；

（4）将步骤（1）所得到的挥发油和步骤（3）所得到的药粉与聚山梨酯80.5g、甜菊苷0.5g和苯甲酸钠2g混合，加入去离子水至1000ml，分装成100支，每支10ml，灭菌，即得。

对照药物：利巴韦林注射液，由广州市白云山天心制药股份有限公司，批号：120201。

1.3实验仪器

倒置显微镜（Nikon，型号：TMS-F）、酶标仪（BIO-RAD，型号：iMark）

实验方法

2.1细胞培养

37℃，5%（体积比，以下相同）CO₂加湿培养箱中培养。使用含有10%（体积比，以下相同）FBS、100U/ml的青霉素和链霉素的DMEM培养基。细胞至90%汇合度后传代，传代比例1/3-1/4。

2.2病毒培养

接种EV71病毒200ul/孔于已经长满90%细胞的24孔板，置37℃，5%CO2培养箱中，吸附1h，加入含1%FBS的维持液，次日换液，逐日观察，待3/4细胞出现病变时，放在-80℃冰箱中冻存20min，自然解冻20min，反复3次，13000rpm，10min，4℃离心，过滤膜，取上清液，每管0.5ml分装于无菌离心管（1.5ml）中，冷冻保存于-80℃备用。

2.3TCID₅₀肠道病毒EV71感染性的测定

2.3.1TCID₅₀的测定

选择经24-48h培养后生长旺盛、成层良好的RD细胞1瓶，倾弃生长液，加入1ml胰酶，37℃消化2-3min，用含10%FBS的DMEM生长液分散细胞，使细胞胞悬液浓度为2×10⁴个/孔。用移液器将细胞悬液加入96孔板中，每孔100ul。将培养板置于37℃，5%CO₂温箱中培养12～18小时，待细胞长成单层后备用；将肠道病毒EV71用含1%FBS的维持液作10倍稀释系列成10个浓度，弃去培养板中的生长液，每孔加入不同稀释度的病毒液100ul，每个稀释度6孔。6个对照孔加入维持液100ul，37℃吸附1h，然后各孔再加入维持液100ul，轻轻摇匀，37℃，5%CO₂培养箱培养3天，逐日观察记录各孔细胞病变情况。

2.3.2结果统计

细胞全部出现CPE判为（++++）；50%-75%细胞出现CPE为（+++）；25%-50%细胞出现CPE（++）；25%以内细胞出现CPE为（+）；无CPE为（—）。

并根据Reed和Muench方法对病毒滴度进行计算，最终获得TCID₅₀/100微升；距离比=（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%的病变率）,LogTCID₅₀=距离比×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数，结果见表1。表1所示的测定结果显示肠道病毒EV71的TCID₅₀为10^-5.6/100ul。

表1肠道病毒EV71接种RD细胞的TCID₅₀滴度统计

2.4克感利咽口服液对RD细胞毒性作用

RD细胞按2×10⁴个/孔（100ul）接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用；用细胞维持液将药物2倍稀释成9个梯度，每孔100μl，每个浓度6孔，同时设立6孔正常细胞对照、空白组，置37℃、5%CO₂培养箱，每日在倒置显微镜下观察细胞形态，连续观察60h。吸去培养液，PBS润洗一遍，每孔加入100uL的0.5mg/mL MTT溶液，37℃孵育4h，弃去MTT，加入150uL DMSO，震荡5min，于酶标仪测定490nm波长处的OD值，计算各药物浓度细胞存活率，结果见图1。

结果显示克感利咽口服液在4mg/ml-0.5mg/ml范围内对RD细胞没有明显细胞毒性，说明克感利咽口服液有比较安全的范围，即克感利咽口服液的给药剂量按照细胞实验用量为4mg/ml-0.5mg/ml。

2.5克感利咽口服液的抗病毒药效作用

RD细胞按2×10⁴个/孔（100ul）接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用；细胞在96孔板中长成单层后，吸去培养液，每孔加入100ul的100TCID₅₀病毒液和100ul的不同稀释浓度的克感利咽口服液药液，每一药物浓度设置4个复孔，同时设置空白对照组、正常细胞对照组、病毒对照组和阳性对照组。继续将培养板置于37℃，5%CO2温箱中培养，逐日观察细胞病变效应，约在病毒对照组75%-100%病变时吸去含药维持液，加入100ul的PBS润洗一遍，每孔加入100uL的0.5mg/ml MTT溶液，37℃孵育4h，弃去MTT，加入150ul DMSO，震荡5min，于酶标仪测定490nm波长处的OD值，计算药物的病毒抑制率，结果见图2。

结果显示在不影响细胞活性的浓度下，克感利咽口服液可以抑制肠道病毒EV71在RD细胞中的复制，在浓度为4mg/ml情况下，克感利咽口服液的抑制率为51.8%，说明克感利咽口服液具有体外抗肠道病毒EV71的药效作用，具有显著的防治手足口病的作用。

Claims

1.克感利咽口服液在制备防治EV71型肠道病毒感染引起的手足口病中药中的应用；所述的克感利咽口服液，每1000ml中所含的有效成分由以下原料制得：

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述的克感利咽口服液的制备方法由以下步骤组成：

（3）将步骤（2）黄芩用乙醇提取后的药渣及步骤（1）金银花、荆芥、防风和薄荷提取挥发油后的药渣与栀子、连翘、玄参、僵蚕、地黄、射干、桔梗、蝉蜕和甘草加水煎煮2次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液与步骤（1）所得水溶液合并，浓縮至在70℃时相对密度为

加入乙醇使醇含量达60%（v/v），静置，滤过，滤液回收乙醇并浓縮至在70℃时相对密度为

加入步骤（2）所得滤液，浓缩，干燥，得药粉；

（4）将步骤（1）所得到的挥发油和步骤（3）所得到的药粉与适量的聚山梨酯80、甜菊苷和苯甲酸钠混合，加入去离子水至1000ml，分装，灭菌，即得。