CN105940777B

CN105940777B - 一种抗病毒的中药组合物

Info

Publication number: CN105940777B
Application number: CN03140577.0A
Authority: CN
Inventors: 闫希军
Original assignee: DISHILI INVESTMENT HOLDING GROUP Co Ltd TIANJIN
Current assignee: DISHILI INVESTMENT HOLDING GROUP Co Ltd TIANJIN
Filing date: 2003-05-30
Publication date: 2008-01-09
Anticipated expiration: 2023-05-30

Abstract

本发明公开了抗病毒的药物组合物，特别是具有抗冠状病毒作用的中药组合物，该药物主要由百部、酸橙、天门冬、甘草、珊瑚菜、桑叶、桔梗组成，根据不同病情需要，可以将本发明药物的组分进行加减，制成药物制剂。

Description

一种抗病毒的中药组合物

技术领域

本发明属于中药领域，涉及一种抗病毒的中药组合物，特别是具有抗冠状病毒作用的中药组合物。

背景技术

很多折磨人类的重要传染病是由病毒引起的，由一种或多种病毒引起的疾病的流行越来越引起人们的不安。一些传染病之所以重要是由由于它们经常是致命的；这些传染病是狂犬病、天花、脊髓灰质炎、肝炎、黄热病、免疫抉损和多种脑炎。其它传染病也重要的原因是它们极具传染性，并会出现急性不适，如流感，麻疹，腮腺炎和水痘，以及呼吸道-胃肠道不适。如风疹的其它传染病和巨细胞病毒可导致先天性异常，肿瘤病毒可导致人和动物的肿瘤和癌症。普通感冒的主要病原体是鼻病毒，其次为副流感病毒、腺病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒以及呼吸道合胞病毒等，常易合并细菌感染。流行性感冒，则是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病。自20世纪以来已有五次世界性流感大流行的记载，分别发生于1900、1918、1957、1968和1977年。其中以1918年的一次流感最为严重，死亡人数达2100万之多。我国从1953年至1976年已有12次中等或中等以上的流感流行。根据世界卫生组织2002年11月26日发表的公告显示，流感在去年至少对全世界人口中的6亿至12亿人造成影响，其中症状严重的有300万至500万人，因为流感导致死亡的人数为25万至50万人，病死率高达8％至10％。而目前造成SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome严重急性呼吸系统综合症，俗称非典型肺炎)全球流行的则是SARS病毒——冠状病毒的一个变种。

己知的“冠状病毒”品种超过20个，有9组基因，会存在于牛、马、狗及禽鸟身上，与人类有关的有3种。人冠状病毒分别属于OC43和229E两个抗原型，它是引起人类上呼吸道感染的病原，典型的冠状病毒感染呈流涕、不适等感冒症状。但造成本次传染性非典型肺炎的冠状病毒，其基因构造与现有的3种病毒有所不同，很可能是导致普通感冒冠状病毒的变异种，或由于病毒突破人与动物自然界限，象禽流感一样传染给人。世界卫生组织在2003年4月16日正式确认，引起非典型肺炎的病原体是冠状病毒的一个变种，以前没有在人体发现过。冠状病毒家族的成员一般有29000至31000个核苷，SARS病毒的基因排序共有29727个核苷，在冠状病毒的典型的核糖核酸界值之内。SARS病毒是一种正链有膜核糖核酸(RNA)病毒，很容易发生变异。

西药点对点的作用使得西药开发难以适应病毒的变异性，与西药开发严重滞后及西药的副作用相对应，中草药抗病毒方面则显示出得天独厚的优越性。根据临床实践和现代中药药理研究，抗病毒中药可分为两大类：直接灭活或抑制病毒的中药和通过诱生干扰素或调节人体免疫功能而间接抗病毒作用的中药。

具有直接抗流感病毒作用的单味中药大多数为清热解毒类中药，所含成分复杂，其中多数含黄酮或类黄酮类物质，该类物质可以抑制流感病毒唾液酸酶的活性和抑制膜融合作用。例如连翘、金银花、野菊花、黄连、黄芩、板蓝根、大青叶、鱼腥草等。具有间接抗病毒作用的单昧中药主要通过调节机体的免疫功能而达到间接抗病毒作用，例如黄芪、人参等。

除中药单方外，抗病毒的中药复方或中成药也多有报道。石钺等(北京中医药大学学报，2001，24(2)：44-45)对银翘散的研究表明，其抗流感病毒有效部位群中主要有效部分为黄酮类物质，其中以连翘、薄荷、荆芥和金银花贡献为大。王金华认为(国外医学·中医中药分册，2000，22(1)：32-33)，在流感早期服用葛根汤，以达到快速诱生干扰素抑制病毒颗粒、降低白细胞介素-1a水平而控制机体对流感病毒感染之后所表现的异常亢进的病理反应。吴风英等报道(时珍国医国药，1998，9(3)：268)流感浓煎剂(大青叶2kg，板蓝根2kg，连翘1kg，拳参1kg，制成水煎剂4000ml)对流感具有很好的治疗作用，能加快症状缓解，缩短病程，退热效果明显。汪永红等研究报道(上海中医药杂志，2001，35(3)：41-42)中药退热微型灌剂(由黄芩、柴胡、细辛等组成)在7-27mg/ml浓度下对流感病毒A3型、副流感病毒2型等有抑制作用，在1.8-3.6g/kg剂量下对FM1感染小鼠有减轻肺损伤和减少死亡率作用。乔学军等(四川中医，1999，17(9)：45)用葛根芩连汤加味(粉葛根、黄芩、黄连、滑石、炙甘草、木香、生白芍)治疗小儿流感高热80例，取得满意疗效。邓学龙等(广州中医药大学学报，1999，16(2)：130-133)对病毒宁滴剂(由柴胡、甘草等组成)体外实验研究结果表明，该药在20g/L剂量对7种呼吸道病毒均有明显的抑制病毒致细胞病变作用，在100g/L剂量时对流感病毒引起的小鼠肺炎有明显的抑制作用，200g/L、100g/L组能抑制流感病毒增殖，200g/L浓度能延长流感病毒感染的小鼠生存时间。王冬梅等(中国中药杂志，1999，24(5)：306-307)采用鸡胚培养术，证实清热宁冲剂(由黄芩、柴胡、大黄等组成的复方制剂)具有明显抑制流感病毒甲3型作用，且作用强度强于抗病毒口服液。李荣生等(中医药研究，2000，16(4)：39-40)研究肺毒清颗粒(由柴胡、僵蚕、苏叶、蝉衣、连翘等组成)的抗病毒作用，结果显示，该药在7.0g/kg、21.0g/kg、42.0g/kg剂量组对甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)感染小鼠死亡具有明显的保护作用，并能降低H1N1病毒感染小鼠肺指数，肺指数抑制率为26％、30％、31％。王胜春等(中草药，1997，29(1)：27-29)研究报道柴胡与黄芩配伍能显著抑制鸡胚内流感病毒，降低小鼠肺炎病毒所致小鼠肺指数增高和死亡率。郝向春等(中国中西医结合急救杂志，2001，8(1)：45)用清瘟败毒饮(生石膏、生地、玄参、黄芬、牡丹皮、知母、黄连、桅子、淡竹叶、桔梗、甘草)治疗流行性出血热120例，结果：治疗组平均发热天数、尿蛋白转阴天数均明显短于病毒唑对照组：少尿期越期率，低血压休克期越期率明显高于对照组，说明清瘟败毒饮加减治疗流行性出血热疗效显著。魏连波等(中医杂志，2000，41(4)：226)用急泻停(黄连、黄芩、藿香、白芍、茯苓、番石榴叶等)和番石榴叶治疗HRV性肠炎进行了临床研究，结果急泻停组总有效率96.7％，从止泻时间、肠道对Na、糖的吸收作用，HRK转阴几方面与葛根芩连汤对照组比较，差异有显著性意义。邢玮等(中国中西医结合杂志，2000，20(4)：245)认为热毒清(金银花、鱼腥草、大青叶、蒲公英)具有抗人巨细胞病毒作用。范瑞强等(新中医，2000，32(11)：16)用抗病毒胶囊对复发性生殖器疱疹35例进行了对比观察，在发作期给予抗病毒1号胶囊(板蓝根、虎杖、紫草、茵陈、苍术、甘草等)，在非发作期给予抗病毒2号胶囊(板蓝根、西洋参、黄芪、知母、黄柏、白术等)，结果表明抗病毒胶囊治疗复发性生殖器疱疹的疗效基本等同于目前公认的西药阿昔洛韦。赵玲报道(四川中医，1999，17(3)：42)报道，运用荆柴解毒汤(荆芥、柴胡、黄耳、赤芍、僵蚕、川贝母、野菊花、大青叶、蒲公英、紫花地丁、玄参)治疗痄腮110例，在治疗3天后，痊愈80例，好转(症状体征明显减轻)30例。

虽然抗病毒的中药单方和复方报道不少，但其疗效未得到确切肯定，作用需进一步研究。因此，急需研制针对性强、疗效确切、毒副作用小的抗病毒中药，以解决抗病毒临床治疗乏力的问题。在当前非典型肺炎流行的形势下，为临床提供疗效确切的抗SARS病毒中药更加成为当务之急。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗病毒中药组合物，该组合物具有广谱的抗病毒作用，对呼吸道病毒特别有效，对SARS病毒有明显的抑制作用，且没有不必要的毒副作用。

本发明的另一目的是提供该中药组合物的制备方法。

本发明的再一目的是提供该中药组合物及其制剂的具体抗病毒用途。

本发明通过以下方案予以实施：

本发明中药组合物的基本组成是由下述重量配比的原料制成的药剂：

百部5-20 天门冬5-20 桔梗5-20

桑叶5-20 甘草3-12

本发明上述中药组合物的基本组成还可以进一步加入荷叶10-30重量份。

本发明上述中药组合物的基本组成还可以进一步加入香薷6-15重量份。

本发明上述中药组合物的基本组成还可以进一步加入酸橙5-20重量份。

本发明上述中药组合物的基本组成还可以进一步加入白芷5-20重量份。

本发明上述中药组合物的基本组成还可以进一步加入穿山甲5-20重量份。

本发明上述中药组合物的基本组成还可以进一步加入珊瑚菜5-20重量份。

本发明上述中药组合物的基本组成还可以进一步加入陈皮5-20重量份。

本发明的中药组合物可使用任何适当的给药类型或模式给哺乳动物，尤其是给人提供有效剂量的本发明中药组合物药剂。例如，可使用口服，非肠道和局部给药。剂型包括片剂、胶囊、粉末、颗粒剂、溶液、分散剂、悬浮液、乳剂、软膏和气雾剂以及外部消毒用药剂等。其中优选剂型为口服制剂。

以本发明的中药组合物制备成颗粒剂的方法具体步骤如下：

按照上述配方组成，选取原料百部、天门冬、珊瑚菜、桑叶、桔梗、穿山甲，加5-10倍量水，煎煮20-50分钟，再加入酸橙、甘草、香薷、白芷，继续加热5-20分钟，再加入荷叶，进一步煎煮1-3分钟，过滤，滤液真空抽提，浓缩，制得浸膏，粉碎，过筛，装胶囊。

上述方法当中第一次加热时间优选25分钟，第二次加热时间优选10分钟，第三次加热时间优选2分钟。

本发明通过抗病毒体外实验，包括病毒致细胞病变(CPE)抑制实验、血凝抑制实验、诱生干扰素实验，以及动物实验和组织病理学检查，观察本发明中药组合物对病毒所致细胞病变的抑制作用，对病毒感染的阻断作用，对病毒的直接杀伤作用。结果表明，本发明中药组合物具有广谱的抗病毒活性，对呼吸道病毒特别有效，对SARS病毒有明显的抑制作用，且没有的毒副作用。

上述本发明中药组合物具有广谱的抗病毒活性，其“病毒”包括但不限于一般的DNA和RNA病毒以及逆转录病毒。DNA病毒包括细小病毒科，乳多空病毒科，腺病毒科，疱疹病毒科，痘病毒科和嗜肝DNA病毒科。RNA病毒包括小RNA病毒科，披膜病毒科，弹状病毒科，正粘病毒科，副粘病毒科，冠状病毒科，呼肠孤病毒科，RNA肿瘤病毒科和线状病毒科。尤其包括DNA病毒类疱疹病毒科、腺病毒科，RNA病毒类的副粘病毒科，正粘病毒科，小RNA病毒科，冠状病毒科，披膜病毒科，弹状病毒科。进一步还包括疱疹病毒科水痘病毒属的水痘-带状疱疹病毒(VZV)、单纯疱疹病毒属的单纯疱疹病I、II型(HSV-I、II)；腺病毒科腺病毒属的腺病毒3、7型(AdV3、7)；副粘病毒科麻疹病毒属的麻疹病毒(MV)、肺病毒属的小鼠肺炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)和副流感病毒-I；正粘病毒科流感病毒属的的流感病毒(A3V)、流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1(用于体内试验)；小RNA病毒科肠病毒属的脊髓灰质炎病毒III型(PVIII)、埃可病毒6、11型(ECHO6、11)、柯萨奇B族病毒3、4、5、6型(CVB3、CVB4、CVB5、CVB6)、柯萨奇病毒Al6(CVA16)、新型肠道病毒71型(EV71)；冠状病毒科冠状病毒属的SARS病毒；披膜病毒科风疹病毒属的风疹病毒(RV)；弹状病毒科水泡病毒属的水泡性口炎病毒(VSV)。

上述本发明中药组合物具有广谱的抗病毒活性，对DNA和RNA病毒以及逆转录病毒引起的病毒感染有效果，但对某一种病毒而言则不是特异性的，因此对变异后的病毒也有效果。

病毒是一种非细胞形态的微生物，它的感染是分子水平的感染。由于其基因组只含一种类型核酸(RNA或DNA)，体内缺乏产生能量的酶系统，只能寄生在活细胞内依靠宿主细胞提供原料和酶系统进行病毒复制增殖。它通过：①杀细胞效应引起细胞熔解破坏；②整合感染引起宿主细胞癌变；②引起免疫应答导致宿主细胞损伤最终引起相应疾病。本发明的中药组合物及其制剂抗病毒活性的可能机制如下：具有强烈的吸附作用，使病毒难以附着和穿入细胞内，影响病毒的复制增殖；激活网状内皮系统和细胞免疫系统，增强巨嗜细胞的吞噬作用，强化免疫功能，使T淋巴细胞释放出多种淋巴因子参与杀伤感染病毒的细胞，并阻止病毒核酸和蛋白质在宿主细胞内组合成病毒体。

为了证实本发明药物的抗病毒活性，发明人进行了一系列药理实验，以下实验结果说明，本发明药物具有突出的抗病毒作用。

试验例1 体外抗呼吸道病毒药效试验(细胞培养内试验)

一、试验目的

检测本发明药物体外抗甲3型流感病毒和7型腺病毒及呼吸道合胞病毒的药效试验，为临床提供试验依据。

二、试验材料

1.验证药物：本发明药物，呈棕黄色液体，由天士力制药股份公司提供。

2.阳性药物：双黄连口服液，呈棕黄色液体，批号990716，哈尔滨松花江制药厂生产。

3.阳性对照药物：利巴韦林注射液，苏州第六制药厂生产，批号980801苏卫药准字(1988)第347033。

4.病毒：

①甲3型流感病毒A3/山东/9/93(H3N3)病毒株，本室传代保存。

②7型腺病毒(Ad7)，引自美国ATCC菌种库，由本室传代保存。

③呼吸道合胞病毒(RSV)，引自美国ATCC菌种库，由本室传代保存。

5.细胞：

①狗肾传代细胞系(MDCK)由本室提供。

②人肺癌传代细胞(A549)，由本室提供。

③人宫颈癌细胞(HeLa)由本室提供。

6.Eagle′s细胞维持液等试验材料，均由本室提供。

三、试验方法

(一)预备试验

1.在细胞培养内测定药物对细胞的毒性，计算药物的最大无毒浓度(TD₀)和半数中毒浓度(TD₅₀)

在狗肾传代细胞(MDCK)，人肺癌传代细胞(A549)，人宫颈癌细胞(HeLa)细胞培养内对药物毒性进行测定。计算药物的半数中毒浓度(TD₅₀)和最大无毒浓度(TD₀)。

细胞CPE法：

将不同的细胞以每毫升40万浓度接种于96孔培养板，37℃、5％CO₂培养24小时后，分别加入不同浓度的本发明药物即药物的原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64和双黄连口服液2000ug/ml-250ug/ml及利巴韦林2000ug/ml～250gg/ml，每浓度4孔，每孔100ul。同时设正常细胞对照。置37℃、5％CO₂培养5-7天。每24小时在倒置显微镜下观察细胞形态变化：以25％以下形态变化记+，26％-50％形态变化记++，51％-75％形态变化记+++，76％-100％形态变化记++++。用Reed-Muench法计算药物的半数中毒浓度(TD₅₀)和最大无毒浓度(TD₀)。

2.在MDCK细胞培养内测定甲3型流感病毒效价计算病毒半数感染滴度(TCID₅₀)

甲3型流感病毒毒种的传代：

流感病毒甲3型A3/山东/9/93(H3N3)干燥毒种，用生理盐水配制1∶100病毒液，接种10日令鸡胚尿囊腔，35℃培养48小时。4℃过夜，收获尿囊液，用血球凝集试验法测定流感病毒效价。-70℃保存作为毒种。

MDCK细胞以每毫升40万细胞浓度接种于96孔培养板，每孔100ul，置37℃、5％CO₂温箱培养24小时。甲3型流感病毒以1∶10、1∶20、1∶40稀释，每浓度接种细胞4孔，每孔0.1ml，置33℃、5％CO₂温箱培养5-7天。每24小时在倒置显微镜下观察细胞形态变化，记录细胞形态病变情况，以25％以下细胞形态病变记+，26％-50％细胞形态病变记++，51％-75％细胞形态病变记+++，76％-100％细胞形态病变记++++，无病变记-。用Reed-Muench法计算病毒半数感染滴度(TCID₅₀)。

3.在A549和Hela细胞培养内测定7型腺病毒和呼吸道合胞病毒效价计算病毒半数感染剂量(TCID₅₀)

A549和Hela细胞以每毫升40万细胞浓度接种于96孔培养板，每孔100μl，置37℃、5％CO₂温箱培养24小时。7型腺病毒和RSV病毒10倍连续稀释10-3-10·10，每浓度接种细胞3孔，每孔0.1ml，置37℃、5％CO₂温箱培养5-7天。每24小时在倒置显微镜下观察细胞形态病变情况，记录细胞形态病变情况，25％以以下细胞形态病变记+，26％-50％细胞形态病变记++，51％-75％细胞形态病变记+++，76％-100％细胞形态病变记++++，无病变记-。用Reed-Muench法计算病毒半数感染滴度(TCID₅₀)。

(二)正式试验

1.本发明药物在MDCK细胞培养内对甲3型流感病毒的抑制作用

采用病毒细胞病变(CPE)法进行试验，测定药物的半数有效浓度(IC₅₀)，最小有效浓度(MIC)及治疗指数。试验分一次给药组和三次给药组，试验重复三次。

一次给药组

病毒CPE法：

MDCK细胞以每毫升40万细胞浓度接种于96孔培养板，每孔100ul，置37℃、5％CO₂温箱培养24小时。分别加入甲3型流感病毒，病毒量以1∶20，每孔1001-1，置33℃吸附3小时后，弃掉病毒液，加入本发明药物，药物均选用对细胞的最大无毒浓度1∶2～1∶64二倍稀释7个浓度。双黄连口服液选用对细胞的最大无毒浓度1000ug/ml～7.8ug/ml，二倍稀释8个浓度。利巴韦林对细胞的最大无毒浓度选用1000ug/ml～3.9ug/ml二倍稀释9个浓度。每浓度3孔，每孔100ul。同时设正常细胞对照和病毒对照，置33℃、5％CO₂温箱培养5-7天。每24小时在倒置显微镜下观察病变(CPE)，至病毒对照细胞病变(CPE)出现+++至++++时结束试验。用Reed-Muench法计算药物半数有效浓度(IC₅₀)最小有效浓度(MIC)及治疗指数(TI)。

三次给药组

三次给药组方法同一次给药组，三次给药组每24小时将旧药液弃掉，重新加入同浓度药液，

病毒对照和细胞对照换维持液，连续三天。试验重复三次。

2.本发明药物在A549和Hela细胞培养内对Ad7和RSV病毒的抑制作用

采用病毒细胞形态病变法进行试验，测定半数有效浓度(IC₅₀)，最小有效浓度(MIC)及治疗指数。

试验分一次给药组和三次给药组，试验重复三次。

一次给药组

病毒CPE法：

A549和Hela细胞以每毫升40万细胞浓度接种于96孔培养板，每孔100ul，置37℃、5％CO₂温箱培养24小时。分别加入100TCID₅₀的Ad7和RSV病毒，每孔100ul，置37℃吸附1小时后，弃掉病毒液。加入本发明药物对细胞的最大无毒浓度1∶2～1∶64二倍稀释6个浓度。双黄连口服液对细胞的最大无毒浓度1000ug/ml-7.8gg/ml二倍稀释8个浓度。利巴韦林以对细胞的最大无毒浓度选用1000ug/ml-7.8ug/ml二倍稀释9个浓度。每浓度3孔，每孔100gl。同时设病毒对照和细胞对照，置37℃、5％CO₂温箱培养5-7天。每24小时在倒置显微镜下观察细胞病理变化(CPE)，至病毒对照细胞病变(CPE)出现+++至++++时结束试验。用Reed-Muench法计算药物半数有效浓度(IC₅₀)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数(TI)。

三次给药组

三次给药组方法同一次给药组，三次给药组每24小时将旧药液弃掉，重新加入同浓度药液，病毒对照和细胞对照换维持液，连续三天，试验重复三次。

四.试验结果

(一)预备试验结果

药物对细胞的毒性作用：

验证本发明药物和阳性药物双黄连口服液及阳性对照药物利巴韦林，在MDCK和A549及Hela细胞培养内比较其对细胞的毒性。

1、本发明药物对MDCK细胞的毒性试验结果

验证药物：本发明药物CPE法：最大无毒浓度(TD₀)为1∶2，半数中毒浓度(TD₅₀)为1∶2.5。

阳性药物：双黄连口服液CPE法：最大无毒浓度(TD₀)为1000±0ug/ml，半数中毒浓度(TD₅₀)为1500±0ug/ml，

阳性对照药物：利巴韦林CPE法：最大无毒浓度(TD₀)为1000±0ug/ml，半数中毒浓度(TD₅₀)为2000±0ug/ml。

2、本发明药物对A549细胞的毒性试验结果

验证药物：本发明药物CPE法：最大无毒浓度(TD₀)为1∶2，半数中毒浓度(TD₅₀)为1∶25。

阳性药物：双黄连口服液CPE法：最大无毒浓度(TD₀)为1000±0ug/ml，半数中毒浓度(TD₅₀)为1500±0ug/ml。

阳性对照药物：利巴韦林CPE法：最大无毒浓度(TD₀)为＞1000±0ug/ml，半数中毒浓度(TD₅₀)为＞2000±0ug/ml。

3、本发明药物对Hela细胞的毒性试验结果

验证药物：本发明药物CPE法：最大无毒浓度(TD₀)为1-2，半数中毒浓度(TD₅₀)为1∶2.5。

4、在MDCK细胞培养内测定甲3型流感病毒的半数感染量(TCID₅₀)试验结果。

甲3型流感病毒半数感染量(TCID₅₀)为1∶28。

5、在A549细胞培养内测定7型腺病毒的半数感染量(TCID₅₀)试验结果。

7型腺病毒半数感染量(TCID₅₀)为10^-4

6、在Hela细胞培养内测定呼吸合胞病毒的半数感染量(TCID₅₀)试验结果。

呼吸道合胞病毒半数感染量(TCID₅₀)为10^-6

(二)正式试验结果

本发明药物在MDCK和A549及Hela细胞培养内对甲3型流感病毒和7型腺病毒及呼吸道合胞病毒的抑制作用。

1.本发明药物在MDCK细胞培养内对甲3型流感病毒的抑制试验结果。

①、一次给药组：

验证药物：本发明药物CPE法：药物半数有效浓度(IC₅₀)为1∶64，最小有效浓度(MIC)为1∶32。

对照药物：双黄连口服液CPE法，药物半数有效浓度(IC₅₀)为15.6±0ug/ml，最小有效浓度(MIC)为31.3±0ug/ml，治疗指数(TI)为32。

阳性对照药物：利巴韦林CPE法：药物半数有效浓度(IC₅₀)为7.8±0ug/ml，最小有效浓度(MIC)为15.6±0ug/ml，治疗指数(TI)为64。

②、三次给药组

验证药物：本发明药物CPE法，药物半数有效浓度(IC₅₀)为＞1∶64，最小有效浓度(MIC)为＞1∶32。

对照药物：双黄连口服液CPE法：药物半数有效浓度(IC₅₀)为15.6±0ug/ml，最小有效浓度(MIC)为31.3±0ug/ml，治疗指数(TI)为32。

2.本发明药物在A549细胞内对7型腺病毒的抑制实验结果

①、一次给药组：

验证药物：本发明药物CPE法：药物半数有效浓度(IC₅₀)为＜1∶64，最小有效浓度(MIC)为＜32，

②、三次给药组

三次试验结果基本同一次试验结果。

3.本发明药物在Hela细胞内对RSV病毒的抑制实验结果

①、一次给药组：

②、三次给药组

三次试验结果基本同一次试验结果。

小结

试验结果表明本发明药物在MDCK和A549及Hela细胞培养内对甲3型流感病毒和7型腺病毒及呼吸道合胞病毒有不同程度的抑制作用。

试验例2 体内抗流感病毒药效学实验(动物体内试验)

一、试验目的

检测本发明药物在动物体内抗流感病毒的药效，为临床应用提供试验依据。

二、试验材料

1.验证药物：本发明药物，呈棕黄色液体。

2.阳性药物：双黄连口服液，呈棕黄色液体，批号990716，由哈尔滨松花江制药厂生产。

3.阳性对照药物：利巴韦林(病毒唑)，规格100mg/支，苏洲第六制药厂生产，批号980801苏卫药准字(1988)第347033.

4.试验病毒：甲1型流感病毒(FM1鼠肺适应株)，本室保存，鼠肺病毒液由本室制备。

5.试验动物：昆明种小鼠(体重18～20g)，雌雄皆可，动物合格证号：医动字第01-3001号，由中国医学科学院协和医大动物中心提供。

三、试验方法

(一)预备试验病毒毒力测定：

将制备的新鲜病毒悬液(甲1型FM1鼠肺适应株)用生理盐水10倍连续稀释5个稀释度(10^-1～10^-5)。小鼠用乙醚轻度麻醉，滴鼻接种已稀释的病毒液，每个稀释度接种10只，每只接种量0.03ml。逐日观察小鼠发病及死亡情况，同时设正常小鼠对照。以Reed-Muench法计算其半数致死量(LD₅₀)。

(二)正式试验

1.本发明药物体内抗流感病毒药效试验(以小鼠死亡保护率和延长生命率为指标)：

小鼠滴鼻感染FM1病毒液0.03ml/只，病毒感染量为10LD₅₀每组10只，病毒感染2小时后，口服给予本发明药物，按药物原液的二倍稀释4个浓度，即原液、1∶2、1∶4、1∶8/kg，每只小鼠口服给予0.2ml，阳性药物双黄连口服液选用49/kg、2g/kg、1g/kg、0.5g/kg二倍稀释4个浓度，阳性对照药物利巴韦林选用100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg，二倍稀释3个浓度，每浓度接种10只小鼠，每日二次，连续给药6天，观察2周。记录小鼠死亡数和平均生活日，与病毒对照组比较死亡保护率％和延长生命率％。并作统计学处理，计算X²值和P值。

同时设药物对照(小鼠不感染病毒照常给药)、病毒对照(小鼠感染病毒后不给药)及正常小鼠对照。试验1次。

2.本发明药物体内抗流感病毒药效试验(观察小鼠肺部病变程度及治疗指标)：

小鼠滴鼻感染FM1病毒液0.03ml/只，病毒感染量为10LD₅₀。每组10只，感染病毒2小时后，口服给予本发明药物，按药物原液的二倍稀释4个浓度，即原液、1∶2、1∶4、1∶8/kg，每只小鼠口服给予0.2ml，阳性药物双黄连口服液选用4g/kg、2g/kg、1g/kg、0.5g/kg，二倍稀释4个浓度，阳性对照药物利巴韦林选用100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg，二倍稀释3个浓度，每浓度接种10只小鼠，每日二次，连续给药6天，停药后第5天杀剖小鼠，观察肺部病变程度。与病毒对照组比较肺部病变减轻率％。作统计学处理，计算X²值和P值，及治疗指数(TI)。

同时设药物对照(小鼠不感染病毒照常给药)、病毒对照(小鼠感染病毒后不给药)和正常小鼠对照。试验1次。

四、试验结果

(一)甲1型流感病毒鼠肺适应株(FM1)经小鼠滴鼻感染测定其半数致死量(LD₅₀)为10^-3.68。

(二)本发明药物体内抗流感病毒治疗效果：

1.本发明药物体内抗流感病毒药效试验结果(以小鼠死亡保护率和延长生命率为指征)：

小鼠经滴鼻感染FM1，2小时后，口服给予不同浓度的本发明药物和双黄连口服液及利巴韦林，药物分别为本发明药物原液、1∶2、1∶4、1∶8/kg，每只小鼠口服给予0.2ml，双黄连口服液4g/kg、2g/kg、1g/kg、0.5g/kg利巴韦林100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg，每日二次，连续给药6天。试验结果与病毒对照组比较结果见表1。小鼠死亡保护率％分别为89％、78％、56％、44％、和70％、60％、40％、20％。及100％、100％、78％。说明本发明药物具有抗流感病毒的作用。

2.本发明药物体内抗流感病毒药效试验结果(计算肺部病变程度及治疗指数)

小鼠经滴鼻感染FM1，2小时后，口服给予不同浓度的药物，本发明药物原液、1∶2、1∶4、1∶8/kg，每只小鼠口服给予0.2ml，双黄连口服液4g/kg、2g/kg、1g/k9、0.5g/kg利巴韦林100mg/kg、50mg/、25mg/kg，每日二次，连续给药6天，停药后第5天杀剖小鼠，观察肺部病变程度。试验结果与病毒对照组比较见表2，其肺部病变减轻率％分别为60％、60％、50％、30％和56％、56％、44％、11％及97％、83％、50％。说明本发明药物具有对小鼠感染FM-1病毒引起的肺炎有治疗效果。

小结

经小鼠体内试验证明本发明药物具有抗流感病毒的作用。

试验例3 本发明药物体外抑制冠状病毒的药效试验总结

一、试验目的

检测本发明药物体外抑制冠状病毒的效果，为加快药物的筛选进度，提供试验依据。

二、试验材料

1.验证药物：本发明药物由天士力制药股份公司制备提供。

2.阳性对照药物：注射用更昔洛韦，批号：020802由湖北科益药业股份有限公司提供。

3.细胞：肿瘤横纹肌传代细胞(RDa)由本室提供。

4.病毒：冠状病毒04号分离株(SARS病人血清04号标本)由佑安医院提供。

5.CO₂培养箱NUAIR US AUTO FLOW提供

6.(XSZ-D2)由重庆光学仪器厂生产

7.其它试剂、器材等均由本室提供。

三、试验方法

预备试验：

1.本发明药物对RDa细胞的毒性测定

RDa细胞以40万/ml浓度接种96孔培养板，37℃、5％CO₂培养24小时加入验证药物，验证药物本发明药物倍比稀释为6000ug/ml-11.7ug/ml，本发明药物倍水稀释为6000ug/ml-11.7ug/ml，阳性对照药物更昔洛韦稀释为6000ug/ml-11.7ug/ml，每浓度接种3孔，每孔100ul，同时设正常细胞对照，37℃5％CO₂孵箱培养6天，每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化(CPE)，以25％以下形态变化为“+”，26％～50％形态变化为“++”，51％-75％形态变化为“+++”，76％-1000％形态变化为“++++”，用Reed-Muench法，计算药物半数中毒浓度(TD₅₀)和最大无毒浓度(TD₀)。

2.在RDa细胞培养内对冠状病毒04号的分离和毒力测定

冠状病毒04号的分离(SARS病人血清分离)：

RDa细胞以每毫升40万浓度接种试管，37℃5％CO₂培养24小时，弃掉培养液，每管加入SAAS病人血清0.2ml，33℃转鼓培养5小时后，加入维持液1ml，同时设正常细胞对照，33℃转鼓培养5-7天。细胞出现CPE变化后，采用PCR的方法检测冠状病毒，04号标本PCR阳性，确定为冠状病毒分离株。用终末稀释法纯化病毒2次，PCR检测冠状病毒仍为阳性，经免疫荧光测定双份SARS病人血清，IgM阳性，IgG4倍升高，确定为冠状病毒。采用病毒CPE法测定其效价。

病毒CPE法：

RDA细胞以每毫升40万浓度接种96孔培养板，37℃5％CO₂培养24小时，加入病毒液，病毒稀释10^-1～10^-6，6个浓度，每浓度3孔，每孔100ul，设正常细胞对照，37℃5％CO₂培养5-7天，每24小时在倒置显微镜下观察记录细胞形态变化(CPE)：以25％以下变化为“+”，26％-50％变化为“++”，51％～75％为“+++”，76％-100％变化为“++++”，用Reed-Muench，法，计算病毒半数感染浓度TCID₅₀。

正式试验

本发明药物在RDa细胞培养内对冠状病毒04号的抑制作用

试验自的：

观察不同浓度的本发明药物在RDa细胞培养内对冠状病毒04号的抑制作用，试验采用病毒细胞(CPE)法，计算药物的半数有效浓度(IC₅₀)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数TI，判断药效。

RDa细胞以40万/ml浓度接种96孔培养板，37℃5％CO₂孵箱培养24个时，绅胞培养至单层，弃掉培养液，加入100TCID50的冠状病毒液，同时设正常细胞对照和病毒对照，置37℃5％CO₂吸附2小时后，弃掉病毒液，加入不同浓度的本发明药物药液，药物选用对细胞的最大无毒浓度(TD₀)2倍稀释10个浓度即本发明药物1500ug/ml-2.93ug/ml，本发明药物375ug/ml-0.73ug/ml，阳性对照药物更昔洛韦为2倍稀释10个浓度即6000ug/ml-11.7ug/ml，将稀释的药物分别加入细胞孔内，每浓度3孔，同时设正常细胞对照和病毒对照，置37℃5％CO₂培养箱培养3-5天，逐日在倒置显微镜下观察病毒CPE，以病毒对照出现+++-++++时结束试验，用Reed-Muench法，计算药物的半数有效浓度(IC₅₀)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数(TI)判断药效，试验重复三次。

四、试验结果

预备试验结果：

本发明药物对RDa细胞的毒性作用：

本发明药物和阳性对照药物注射用更昔洛韦在RDa细胞培养内，采用细胞形态变化(CPE)法。计算药物最大无毒浓度(TD₀)和半数中毒浓度(TD₅₀)，以下试验纬果为三次试验结果的均值。

1.本发明药物对RDa细胞的毒性试验结果

验证药物：

本发明药物I号：最大无毒浓度(TD₀)为1500±0ug/ml，半数中毒浓度(TD₅₀)为3000±0ug/ml

本发明药物II号：最大无毒浓度(TD₀)为375±0ug/ml，半数中毒浓度(TD₅₀)为750±0ug/ml。

阳性对照药物：注射用更昔洛韦：最大无毒浓度(TD₀)为＞6000±0ug/ml，半数中毒浓度(TD₅₀)为＞6000±0ug/ml。

2.在RDa细胞培养内对冠状病毒04号毒力测定结果(TCID₅₀)

冠状病毒04号：半数感染量(TCID₅₀)为10^-3

正式试验结果

本发明药物在RDa细胞培养内对冠状病毒04号的抑制作用(以下试验数据为三次试验结果的均值)

验证药物：

本发明药物I号：CPE法，药物半数有效浓度(IC₅₀)为23.4ug/ml，最小有效浓度(MIC)为46.8ug/ml，治疗指数(TI)为32。

本发明药物II号：CPE法，药物半数有效浓度IC₅₀)为23.4±0ug/ml，最小有效浓度(MIC)为46.8±0ug/ml，治疗指数(TI)为8。

阳性对照药物：注射用更昔洛韦：CPE法，药物半数有效浓度(IC₅₀)为11.7±0ug/ml，最小有效浓度(MIC)为23.44±0ug/ml，治疗指数(TI)为256。

总结

本发明药物在RDa细胞培养内，采用病毒CPE法，试验结果表明有抑制冠状病毒的作用，本发明药物I号抑制冠状病毒的效果优于本发明药物II号。

具体实施方式

参考下列实施例将更易于理解本发明，给出实施例是为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围，以下原料用量单位均为千克。

实施例一

百部10 天门冬15 桔梗10

桑叶10 甘草10

按照上述配方组成，选取原料百部、天门冬、珊瑚菜、桑叶、桔梗、穿山甲，加5倍量水，煎煮25分钟，再加入酸橙、甘草、香薷、白芷，继续加热10分钟，再加入荷叶，进一步煎煮2分钟，过滤，滤液真空抽提，浓缩，制得浸膏，粉碎，过筛，装胶囊。

实施例二

百部10 天门冬15 桔梗10

桑叶10 荷叶20 甘草10

按照上述配方组成，选取原料百部、天门冬、珊瑚菜、桑叶、桔梗、穿山甲，加8倍量水，煎煮20分钟，再加入酸橙、甘草、香薷、白芷，继续加热15分钟，再加入荷叶，进一步煎煮3分钟，过滤，滤液真空抽提，浓缩，制得浸膏，粉碎，过筛，装胶囊。

实施例三

实施例四

实施例五

实施例六

实施例七

实施例八

实施例九

Claims

1.一种抗病毒的中药组合物，其特征在于由以下重量配比的原料药制成：

百部5～20 天门冬5～20 桔梗5～20 桑叶5～20 甘草3～12 荷叶10～30 香薷6～15 酸橙5～20 白芷5～20 穿山甲5～20 珊瑚菜5～20。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于由以下重量配比的原料药制成：

百部7 天门冬7 桔梗7 桑叶6 甘草7 荷叶7 香薷7 酸橙7 白芷8 穿山甲7 珊瑚菜7。

3.权利要求1或2所述药物组合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

取原料药，其中百部、天门冬、珊瑚菜、桑叶、桔梗、穿山甲加5～10倍量水，煎煮20～50分钟，再加入酸橙、甘草、香薷、白芷，继续加热5～20分钟，再加入荷叶，进一步煎煮1～3分钟，过滤，滤液真空抽提，浓缩，制得浸膏，粉碎，过筛，装胶囊。

4.权利要求1或2所述的组合物在制备抗SARS冠状病毒药物中的应用。