CN108186866B - 金贝口服液在抗病毒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及金贝口服液在抗病毒中的应用。金贝口服液对RSV、H1N1均有抑制作用，抗病毒作用的主要机制是阻断病毒的粘附，即发挥预防作用，因此预防性用药效果更好；潜伏期内病毒的数量、危害都不是很强大，因此更有利于对病毒的灭杀及排除作用，达到事半功倍效果。

Description

金贝口服液在抗病毒中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及金贝口服液在抗呼吸道病毒中的应用。

背景技术

呼吸道病毒是引起呼吸道疾病的重要病原，临床常见的呼吸道病毒包括呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(如H1N1)等。

呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Viruses，RSV)归属于副黏液病毒科，是造成婴幼儿支气管炎、支气管哮喘以及肺炎等严重下呼吸道感染的主要病原体，发病率极高，流行范围广。不同年龄段人群感染RSV的临床症状及病情轻重差异较大，其中以6个月以下发病率最高，病情最严重，且治疗不及时会有一定的死亡率。研究表明对成人也有一定的感染率，是引起人类患呼吸道相关疾病住院的最主要原因。

目前仍缺少有效对抗RSV的理想药物，利巴韦林作为被公认的抗病毒药物疗效也并不确切，且大量研究报道和临床事实反应其具有一定的毒副作用。临床及市场也未有安全可靠的疫苗可供使用。而中医治疗病毒性支气管炎、肺炎历史悠久，有典有据，源远流长，且具有明显改善症状和体征、减少毒副作用、疗效持久且增强机体免疫能力等优势，得到了越来越多的重视和认可。现代药理学也在逐步证实许多中药材及中药复方不但具有广谱抗病毒作用，还能调节机体免疫，增强抗病能力，在病毒性感染机体的病理环节中多靶点起效，整体调节，且预防效果极佳，为人类抵御病毒入侵、遏制病情加重、降低病症痛苦、减轻医药费用做出极大贡献。因此，中药也越来越成为抗病毒新药研发的热点和趋势。

如何降低病毒感染的相关疾病复发率和治疗成本，研发低毒高效药物，降低初次感染的严重性减少患儿后续并发症，是目前所亟需的。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了金贝口服液在抗病毒中的应用。金贝口服液对RSV、H1N1均有抵抗作用。初步机理研究表明，感染病毒前2h加药的抗RSV效果最明显，TI值为19.29。

为了解决上述问题，本发明通过以下技术方案实现：

第一个方面，本发明提供了金贝口服液在制备治疗抗呼吸道病毒药物中的应用，金贝口服液制备简单，给药方便，目前未见不良反应，用于临床药物中，抗病毒疗效显著。

第二个方面，本发明提供一种含有金贝口服液的药物组合物。

第三个方面，本发明提供所述药物组合物在制备抗呼吸道病毒药物中的应用。包括体外抗病毒细胞水平筛选，体内小鼠肺炎模型抗病毒筛选。体重变化和病毒滴度改变、细胞因子改变等指标中，表现出多证据的抗病毒作用。

本发明与现有技术相比，具有以下优势：

(1)金贝口服液抗病毒效果显著：研究表明金贝口服液发挥抗病毒作用的主要机制是阻断病毒的粘附，即发挥预防作用，因此预防性用药效果更好；潜伏期内病毒的数量、危害都不是很强大，因此更有利于对病毒的灭杀及排除作用，达到事半功倍效果；

(2)金贝口服液可缓解病毒导致的肺炎的体重减轻、降低体内病毒滴度、提高细胞因子水平以提高机体抗病毒能力；有效抑制病毒，避免了病情的恶化，据各大城市的调查，在医院治疗RSV所致的感冒及炎症疾病的费用少则几百元多则上千元，而潜伏期加以预防则使费用大幅降低；

附图说明

图1，各组小鼠每天体重变化。

图2，金贝口服液对RSV、TLR3、TLR4mRNA表达影响。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。

为了解决背景技术中所述问题，本发明第一个方面提供了金贝口服液在制备治疗抗病毒药物中的应用。

进一步，在制备抗呼吸道和胞病毒(RSV)药物中的应用，初步机理研究表明，感染病毒前2h加药的抗RSV效果最明显，TI值为19.29。

进一步，在制备抗H1N1病毒药物中的应用。小鼠动物模型表明金贝口服液可以缓解病毒感染后小鼠的体重减轻，降低体内病毒滴度、提高体内细胞因子水平以提高机体抗病毒能力。

所述金贝口服液：

【处方】黄芪66g，党参66g，北沙参70g，丹参66g，当归55g，川芎55g，金银花115g，连翘46g，黄芩46g，半夏46g，川贝母46g，甘草35g。

【制法】以上十二味，当归、川芎、连翘提取挥发油，同时收集馏液，蒸馏后的水液另器收集，药渣与其余黄芪等九味加水提取三次。第一次2h，第二次1小时，第三次0.5h。提取液与上述水液合并，减压浓缩至相对密度为d＝1.10～1.15(60℃)，加乙醇使含醇量达65％，静置24h，滤过，回收乙醇，加入上述馏液，冷藏，滤过。滤液与蔗糖100g制成的糖浆合并，挥发油用适量乙醇溶解，加入药液中，加苯甲酸3g，以氢氧化钠溶液调pH5.0～6.0，滤过，加水至1000mL，灌装，灭菌，即得。

【性状】本品为棕红色澄清液体，久置有少量轻摇易散的沉淀；气微，味苦。

【功能与主治】益气养阴，祛瘀化痰。用于气短、乏力、喘促、咳嗽、胸痛、紫绀等证。西医诊断特发性肺纤维化病患者。

【用法与用量】口服，一次20～40mL，一日3次，或遵医嘱。

【规格】每支装10mL。

【贮藏】遮光、密封。置阴凉处。

第二个方面，本发明提供一种含有金贝口服液的药物组合物。

所述药物组合物还包括与所述金贝口服液配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

进一步，所述药物组合物的剂型为粉剂、颗粒剂或胶囊剂。

第三个方面，本发明提供所述的药物组合物在制备抗病毒药物中的应用。

进一步，所述的药物组合物在制备抗呼吸道和胞病毒药物中的应用。

进一步，所述的药物组合物在制备抗H1N1病毒药物中的应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

1.材料

1.1病毒

RSV(呼吸道合胞病毒)long株、H1N1(流感病毒)。

1.2细胞

见表1-1。

表1-1所用细胞及其适用病毒

注：实验所用病毒及细胞均由山东省医学科学院基础医学研究所微生物室提供

1.3主要仪器

生物安全柜(Thermo公司)；低温高速离心机(德国Hermle)；超净工作台(济南隆宏公司)；酶标仪(芬兰雷勃公司产品)；倒置显微镜(Olympus公司)；高压灭菌锅(济南德强仪器有限公司MJ37600)；纯水机(济南太平玛环保有限公司)；CO₂细胞恒温培养箱(日本三样公司)

1.4药物

金贝口服液方药组成如表1-2所示，此次实验所用金贝口服液由济南宏济堂药业有限公司制备，规格10mL/瓶，含生药1.0g/mL，批号1303001。阳性药物：利巴韦林(山东辰欣药业有限公司，批号：1403316821)双黄连口服液(哈尔滨三精通泰制药有限公司，规格10mL/瓶，含生药1.5g/mL，批号14012547)

表1-2金贝口服液药物组成

1.5常用试剂与常见溶液配制

特级胎牛血清(中美血源)(FBS)：Biological Industries(BI)；1640细胞培养液(Gibco)；0.25％Trypsin-EDTA(GENVIEW)；双抗；磷酸缓冲液(PBS)；MTT(GENVIEW)

双抗配制：取将100wU链霉素溶于小青瓶中，加入5mL的蒸馏水，弃去1mL的小青瓶中的溶液；再将80wU青霉素溶于76mL蒸馏水中，将两次所得溶液相混匀，微孔滤膜过滤除菌(0.22μm)，分装，置于-20℃备用。

MTT配制：精确称取MTT粉末0.5g于100mL PBS中，微孔滤膜过滤除菌(0.22μm)，分装，置于-20℃避光保存备用。

PBS配制：8g NaCl、2.9g Na₂HPO₃、0.2g KCl、0.2g KH₂PO₃溶解到1000mL去离子水中，高压灭菌后分装，置于4℃备用。

2实验方法

2.1细胞复苏及传代培养

将液氮冻存的Hep-2、MDCK细胞在37℃水浴1min内迅速融化(遵循慢冻速溶原则)，1000rpm离心5min，吸弃上清，用完全培养基吹打悬浮，于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待细胞长成单层时，用0.25％胰酶消化，按1:2或1:3传代，整个实验过程均在无菌超净工作台内进行。

2.2病毒的活化

2.2.1 RSV、HSV-1

将保存的RSV毒种0.1mL接种于已经长成单层的Hep-2细胞上，35℃、5％CO₂培养，镜下观察CPE，当CPE达到90％，收集。反复冻融3次，1000r/min，5min离心后，定量分装，–80℃冰箱冻存备用。

2.2.2 H1N1

H1N1毒种5mL与250μL胰酶混匀(H1N1属于有包膜病毒)，再在恒温培养箱内孵育1h后，接种于己经长成单层的MDCK细胞上，待细胞出现90％以上的病变时，反复冻融3次，1000r/min，5min，取上清液，分装，-80℃冻存备用。

2.3病毒TCID₅₀测定

用细胞维持液将上述所得病毒液做10倍比系列稀释，横向依次接种在96孔板内单层细胞上，35℃、5％CO₂培养，观察48h，终止培养，MTT染色，读取A₅₄₀值。计算获得细胞病变率：

细胞病变率＝1-细胞存活率

然后用Reed-Muench两氏法，计算各病毒的半数细胞感染量TCID₅₀(50％tissueculture infective dose)。

TCID50＝Antilog(logC+pd×logCm)

其中：pd＝细胞比距；p₁＝高于50％病变百分数；p₂＝低于50％病变百分数；C＝高于50％病变率的稀释度；C_m倍比稀释系数。

2.4受试药物对细胞毒性的测定

将浓度1×10⁵/mL的Hep-2、MDCK细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，100μL/孔。CO₂培养箱培养至长成单层细胞。次日吸弃培养基，加入含不同浓度药物的细胞维持液(1.00g/mL、0.50g/mL、0.25g/mL、0.125g/mL、62.50mg/mL、31.25mg/mL、15.63mg/mL、7.81mg/mL、3.91mg/mL、1.95mg/mL)，同时设置正常对照组、病毒对照组、阳性药物利巴韦林和双黄连组。当病毒对照孔病变率达到90％时，MTT法检测，并计算药物半数中毒浓度(TC₅₀)和最大无毒浓度(TC₀)。

2.5体外抗病毒实验

2.5.1金贝口服液体外抗病毒

用含2％牛血清的RPMI-1640细胞维持液将金贝口服液从无毒浓度起二倍比系列稀释8个浓度，每孔50μL接种于已长成单层细胞的96板孔中，每孔再加入50μL病毒液(所加病毒对应其敏感细胞)，放于5％CO₂、35℃细胞培养箱中观察细胞病变情况，同时设利巴韦林阳性对照组、双黄连对照组、病毒对照组及空白细胞对照组，每组3个复孔。当病毒对照孔病变率达到90％以上时，MTT法检测细胞存活率。

2.5.2金贝口服液体外抗RSV探究

通过不同时间段加入药物，初步探讨金贝口服液对病毒的作用环节。

用含2％牛血清的RPMI-1640细胞维持液将金贝口服液从无毒浓度起二倍比系列稀释8个浓度，分别在加入100个TCID₅₀的RSV病毒液的2h前、0h、2h后以每孔50μL量接种在单层细胞Hep-2细胞的96板孔中，同时设置正常对照组、病毒对照组、阳性药物利巴韦林和双黄连组。当病毒对照孔病变率达到90％时，MTT法检测，并计算药物半数有效浓度(EC₅₀)和治疗指数(TI)。TI＝半数中毒浓度(TC_5o)/半数有效浓度(EC_5o)

2.6数据处理

用统计软件SPSS19.0进行数据统计，组间比较用单因素方差分析，实验所得计量数据均采用

表示。

3实验结果

3.1病毒TCID₅₀测定

应用Reed-Muench方法计算RSV病毒TCID₅₀为10^-4.35，H1N1病毒TCID₅₀为10^-2.80，EV71病毒TCID₅₀为10^-3.78，Cox-B₃病毒的TCID₅₀为10^-5.32，Cox-B₅病毒的TCID₅₀为10^-4.63，HSV-1的TCID₅₀为10^-4.08。实验时用100个TCID₅₀作为病毒液浓度。

3.2受试药物对细胞毒性的测定

受试药物对各细胞的毒性在加入药物6h后就开始显现，24h后药物毒性全部显现，药物浓度在小于0.25g/mL范围内未见明显的细胞毒性，随着药物浓度的降低而降低，细胞的存活率随着药物浓度的降低而增加。对Hep-2、RD细胞的毒性表现为大部分细胞破碎或脱落，颗粒物质增多，细胞增值缓慢，折光性增强，细胞形态改变。对MDCK细胞细胞毒性主要表现在细胞出现空泡，细胞聚集成网状或树枝状，折光性降低，细胞脱落。正常对照组细胞排列紧密，胞浆清晰，细胞壁完整，培养液清澈。金贝口服液及阳性对照药对实验中三种细胞的TC₀、TC₅₀见表1-3。

表1-3药物对实验用细胞的TC₀、TC₅₀

3.3金贝口服液体外抗病毒结果

3.3.1金贝口服液体外抗病毒结果

表1-4药物对各病毒作用的药物半数有效浓度(EC50)及治疗指数(TI)

如表1-5所示，金贝口服液对RSV有效，且在加入病毒前2h加药的抗病毒治疗指数最大，即金贝口服液在预防阶段效果较佳。为下一步动物实验提供了依据。

表1-5金贝口服液体外抗RSV的TC50、EC50、TC值

4小结与讨论

从金贝口服液对三种细胞的毒性实验可以看出，对Hep-2细胞、MDCK细胞毒性较小，其中对Hep-2细胞的毒性小于阳性对照药双黄连。

体外抗病毒筛选实验表明，从抗病毒的种类来看，金贝口服液对RSV、H1N1均有显著抑制作用。金贝口服液在体外实验中可以有效抑制RSV，对治疗RSV治疗指数较高，CPE病变程度最低，效果最好。

实施例2

1材料

1.1病毒

RSV鼠肺分离株，山东省医学科学院微生物室保存。病毒于Hep-2细胞上培养活化后，反复冻融后离心取上清所得，测其在该细胞上的半数细胞感染量(TCID₅₀)为10^-7。^。2/mL。

1.2药物

如实施例1所述。

1.3实验动物

BALA/c雌性小鼠，SPF级，6-8周龄，购自山东大学实验动物中心，生产许可证号SCXK(鲁)20150001。

1.4仪器

生物安全柜(济南鑫贝西生物技术有限公司公司)；超净工作台(济南隆宏公司)；酶标仪(芬兰雷勃公司产品)；低温高速离心机(贺立氏台式低温离心机)；倒置显微镜(Olympus公司)；高压灭菌锅(济南德强仪器有限公司MJ37600)；纯水机(济南太平玛环保有限公司)；CO₂细胞恒温培养箱(日本三样公司)；

实验场地为山东省医学科学院基础所生物安全实验室。

2实验方法

2.1动物分组设计

随机将动物分为6组，每组10只，分别设为正常对照组(空白组)、病毒对照组(模型组)、双黄连口服液组(剂量为0.18mL/只，相当于人临床用量)、金贝口服液大剂量组(剂量为0.55mL/只，相当于人临床用量的2倍)、金贝口服液中剂量组(剂量为0.28mL/只，相当于人临床用量)、金贝口服液小剂量组(剂量为0.14mL/只，相当于人临床用量的1/2倍)。

2.2感染模型的建立及给药

各组小鼠在乙醚轻微麻醉的情况下，除正常对照组外每只小鼠以50μL RSV滴鼻感染，正常对照组采用滴鼻等量滴入Hep-2细胞培养液上清。连续给药10d，模型组和正常对照组灌胃等量的生理盐水。

2.3各项检测指标

2.3.1小鼠体重及活动情况

感染后每天称量体重，观察记录各组小鼠精神状况、活动情况，连续观察10d。

2.3.2金贝口服液对感染RSV小鼠肺指数影响

于感染后的第5d(预实验表明感染5日后各组小鼠差异性逐渐减少)，每组随机选取5只小鼠麻醉后处死，无菌解剖，取肺组织于PBS缓冲液的平皿中清洗2次，用吸水纸吸干表面水分，称其重量。计算肺指数和肺指数抑制率。剩余5只继续按2.3.1观察。

肺指数＝肺质量/体质量

肺指数抑制率＝(病毒组平均肺指数－药物组平均肺指数)/病毒组平均肺指数

3实验结果

3.1各组小鼠外部行为观察

由图1可知，正常组小鼠精神状态良好，毛色顺滑有光泽，进食与饮水均正常，体重随日期不断增加，行动敏捷。其他各组病毒感染组小鼠第2天开始出现症状，表现为体重明显下降，食量、饮水量下降，毛发无光泽，呼吸短促、蜷缩。药物组经过药物治疗后，部分小鼠症状减轻，体重开始增加。

3.2各组小鼠体重变化

如图2结果所示，病毒组及给药组于感染后的第2d均出现体重下降。双黄连组和中剂量组在第3d就开始有体重回升，大剂量组和小剂量组第4d开始有体重回升，病毒组在第6d才有体重回升现象。

4结果与讨论

体内实验是评价药物抗病毒效果的重要指标，可以验证在体外有效的抗病毒药物在体内是否同样具有抗病毒效果，既能评价药物的抗病毒效果，又能反映机体对病毒的免疫过程，更接近人体抗病毒感染的全部过程，综合、全面的评价药物的抗病毒效果。实验中使用RSV鼠肺分离株病毒，该病毒是从肺炎小鼠肺组织中分离得到的，使病毒处于最佳致病状态，对肺炎模型的建立更有针对性感染。

本实验通过肉眼观察记录各组小鼠的精神状况、饮食饮水状况、毛色光泽程度、行动灵活情况，对各组实验有大致的了解，对病毒模型组小鼠的状况有了清晰地认识，而金贝口服液及双黄连四个组中小鼠均得到了保护。通过各组小鼠体重变化也能了解到RSV感染后的小鼠体重变化趋势。

通过检测小鼠病毒感染模型的体重指数，小鼠体内病毒滴度的改变以及细胞因子水平的改变，发现金贝口服液对小鼠模型具有良好的保护作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.金贝口服液在制备抗呼吸道合胞病毒药物中的应用，其特征在于，所述金贝口服液由以下成分及用量组成：黄芪 66 g，党参 66 g，北沙参 70 g，丹参 66 g，当归 55 g，川芎55 g，金银花 115 g，连翘 46 g，黄芩 46 g，半夏 46 g，川贝母 46 g，甘草 35 g；

以上十二味，当归、川芎、连翘提取挥发油，同时收集馏液，蒸馏后的水液另器收集，药渣与其余黄芪等九味加水提取三次；第一次2 h，第二次1小时，第三次0.5 h；提取液与上述水液合并，60 ℃减压浓缩至相对密度为d＝1.10～1.15，加乙醇使含醇量达65 %，静置24h，滤过，回收乙醇，加入上述馏液，冷藏，滤过；滤液与蔗糖100 g制成的糖浆合并，挥发油用适量乙醇溶解，加入药液中，加苯甲酸3 g，以氢氧化钠溶液调pH5.0～6.0，滤过，加水至1000 mL，灌装，灭菌，即得。

2.金贝口服液在制备抗H1N1病毒药物中的应用，其特征在于，所述金贝口服液由以下成分及用量组成：黄芪 66 g，党参 66 g，北沙参 70 g，丹参 66 g，当归 55 g，川芎 55 g，金银花 115 g，连翘 46 g，黄芩 46 g，半夏 46 g，川贝母 46 g，甘草 35 g；

以上十二味，当归、川芎、连翘提取挥发油，同时收集馏液，蒸馏后的水液另器收集，药渣与其余黄芪等九味加水提取三次；第一次2 h，第二次1小时，第三次0.5 h；提取液与上述水液合并，60 ℃减压浓缩至相对密度为d＝1.10～1.15，加乙醇使含醇量达65 %，静置24h，滤过，回收乙醇，加入上述馏液，冷藏，滤过；滤液与蔗糖100 g制成的糖浆合并，挥发油用适量乙醇溶解，加入药液中，加苯甲酸3 g，以氢氧化钠溶液调pH5.0～6.0，滤过，加水至1000 mL，灌装，灭菌，即得。

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