CN103655757A - 一种有效抗猪流感病毒的中药复方 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种有效防治猪流感病的中药复方，包括中药复方的中药种类和含量。中药复方由下列药物组成：金银花42重量份，赤芍药42重量份，绵马贯众16重量份。体内和体外试验证明，本发明的中药复方制剂能有效防治猪流感病。

Description

一种有效抗猪流感病毒的中药复方

技术领域

本发明属于兽用中药领域，涉及一种体内和体外抑制猪流感病毒的中药复方。

背景技术

猪流感（swine influenza，SI）又称猪流行性感冒，是由正黏病毒科A型流感病毒属的猪流感病毒（swine influenza virus，SIV）引起的一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病，临床以突发、高热、咳嗽、呼吸困难、反复发作、发病率高、死亡率低为特征。如：我们2009年至2013年10月期间广东省11个地级市共采集血清样品5048份，应用ELISA试剂盒或HI试验检测H1、H3亚型猪流感抗体，结果发现：H1、H3和H1+H3的阳性率分别为42.09%、15.25%和6.62%。此病在世界各地都有发生, 危害严重, 经济损失巨大, 并对人类的健康构成威胁。

其突出的流行特点是常以亚临床形式存在并常引起其他呼吸道细菌和病毒的继发或混合感染，如猪繁殖与呼吸综合症、猪圆环病毒病和猪传染性胸膜肺炎等，使疫情变得复杂，死亡率增高。

在临床实践猪流感的防治上，由于抗生素具有控制并发症的特点而被广泛使用，同时配合大量的解热镇痛、糖皮质激素类等药物。这些处理方式在抑制机体炎症反应的同时也加重了免疫抑制，导致病情更加的恶化。中草药作为天然产物，具有药源丰富，残毒较低或无残毒，副作用小，不易产生耐药性等优点；同时能调节机体免疫功能，抑制病毒复制，改善临床症状，在治疗病毒感染性疾病上应用广泛。因此，应用中草药防治猪流感，前景极为广阔。

纵观现在中药复方抗病毒的实验研究，对人甲型流感病毒和禽流感病毒的研究多，而对猪流感病毒的实验研究较少。并且大多分别采用体内试验或体外试验的方法独立研究，不能全面评价中药复方抗猪流感病毒的效果。

为解决上述问题，迫切需要筛选出有效防治猪流感的中药复方。并且同时采用体外试验和体内试验，从作用机理和临床实际上综合研究中药复方抗猪流感病毒的效果，为临床防治提供理论和实际依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效防治猪流感的中药复方。

本发明所提供的用于抗猪流感病毒的中药复方，其组成为：金银花42重量份，赤芍药42重量份，绵马贯众16重量份。

所述的复方是指所含的中药种类及其中药比重。

本申请书所述的重量份是指复方中各种药物占整个复方的重量比例。

作为本发明的另一目的，还包括一种用于抗猪流感病毒的中药复方的提取方法，采用水煎煮方法进行粗提，具体步骤是：

（1）按金银花42重量份、赤芍药42重量份、绵马贯众16重量份的比例，称取各中药，组成100g中药复方；

（2）将100g中药复方粉碎到20目，浸泡1h，水煎2次，每次煮沸30 min，合并2次煎液；

（3）将煎液在常压真空抽滤及浓缩，定容至200mL水煎液,每毫升相当于0.5g生药（即500mg/mL）；

（4）将水煎液进行高压灭菌，保存至温度为4℃冰箱内备用。

本发明采用的金银花：金银花，又名忍冬花，性寒，味甘，入肺、胃、大肠经。具有清热解毒，凉散风热的功效，为清热解毒的良药。本发明研究表明：金银花对猪流感病毒具有阻断和直接杀灭作用。

本发明采用的赤芍药：赤芍药，性微寒，味苦，归肝经。为毛茛科植物芍药或川赤芍干燥根，有行瘀止痛、凉血消肿的功效。本发明的研究结果显示：赤芍药在体外对猪流感病毒具有阻断、抑制和直接杀灭作用

本发明采用的绵马贯众：绵马贯众，性微寒，味苦，归肝、胃经。为鳞毛蕨科多年生草本植物粗茎鳞毛蕨、蹄盖蕨科多年生草本植物峨眉蕨、乌毛蕨科多年生草本植物单芽狗脊、紫萁科多年生草本植物紫萁的根茎及叶柄基部，具有清热解毒、抗病毒、抗癌、驱虫、凉血、止血等作用。本发明的研究结果显示：绵马贯众在体外对猪流感病毒具有贯众对猪流感病毒具有阻断、抑制和直接杀灭作用。

本发明的有益效果：

本发明提供的中药复方可以有效抗猪流感病毒，并在临床上可有效防治猪流感。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

一种用于防治猪流感病的中药复方，包含如下药物：金银花42重量份，赤芍药42重量份，绵马贯众16重量份。

所述的复方是指所含的中药种类及其中药比重。

所述的重量份是指复方中各种药物占整个复方的重量比例。

下述实施例中所用实验材料如下：

（一）试验动物

9~11日龄SPF鸡胚购自广东大华农禽蛋有限公司；SPF级15g±2g BALB/c小鼠购自广东省医学实验动物中心。

（二）溶液或试剂配制

1. PBS的配制：称取NaCl 8.0g、Na2HPO4 3.63g、KCl 0.2g  KH2PO4 0.24g溶于适量超纯水，调pH值至7.4，定容至1000mL；100ml/瓶分装，15磅高压灭菌30min，4℃保存备用。

2. 1%鸡红细胞悬液的配制：先用灭菌注射器吸取3.8%枸橼酸钠溶液（其用量为所需血量的1/5），从鸡翅静脉抽血至所需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌PBS为抗凝血的2倍，以2000r/min离心10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据所需用量，用灭菌PBS配成1%悬液，现配现用。

3. 中药的提取：采用水煎煮方法进行粗提，具体步骤是：

（1）按麻黄30重量份、桂枝25重量份、杏仁30重量份、炙甘草15重量份比例，称取各中药，组成100g中药复方；

（2）将100g中药复方粉碎到20目，浸泡1h，水煎2次，每次煮沸30 min，合并2次煎液；

（3）将煎液在常压真空抽滤及浓缩，定容至200mL水煎液,每毫升相当于0.5g生药（即500mg/mL）；

（4）将水煎液进行高压灭菌，保存至温度为4℃冰箱内备用。

实施例1 中药复方在体外抗猪流感病毒的效果

1. SIV对鸡胚半数感染量（EID50 ）的测定   

将病毒液依次作10倍倍比稀释，接种于10日龄鸡胚尿囊腔内，每个稀释度接种0.2ml/枚，作4个重复，同时设正常鸡胚对照。置37℃恒温箱内孵化72h，弃去24h内死亡胚，收获24h后死亡胚及72h活胚的尿囊液，进行HA效价的测定。按Reed-Muench两氏法计算EID50。

2．中药复方制剂对鸡胚的最大安全浓度的测定  

将中药提取液依次作2倍倍比稀释，稀释成原浓度、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64等7个浓度，然后接种于10日龄鸡胚尿囊腔内，每个稀释度接种0.2ml/枚，作4个重复，同时设生理盐水对照。置37℃恒温箱孵育72 h，每天观察存活情况，弃去24h内死亡胚。鸡胚全部存活的最高药物浓度为正式试验的起始浓度，即中药对鸡胚的最大安全浓度。

3．中药复方制剂在鸡胚内抗猪流感病毒的试验  

将鸡胚随机分成三组，采用三种加药方式：

方式一、先加中药再加病毒（中药对SIV的阻断作用）：先将各中药提取液接种于10日龄鸡胚，0.2ml/枚，作4个重复，置37℃恒温箱孵育2h，然后接种100EID50病毒液0.2ml/枚，37℃恒温培养72h，测定鸡胚尿囊液的血凝（HA）效价。

方式二、先加病毒再加中药（中药对SIV的抑制作用）：先将100EID50病毒液接种于10日龄鸡胚，0.2ml/枚，作4个重复，置37℃恒温箱孵育2h，然后接种各中药提取液0.2ml/枚，37℃恒温培养72h，测定鸡胚尿囊液的血凝（HA）效价。

方式三、中药病毒混合后一起加（中药对SIV的直接杀灭作用）：先将各中药提取液与等量100EID50病毒液混合后，置37℃2h后，接种于10日龄鸡胚，0.2ml/枚，作4个重复。37℃恒温培养72h，测定鸡胚尿囊液的血凝（HA）效价。

同时设立病毒对照和阴性对照。

4．数据处理  

数据以x(—)±S.E表示，用SPSS17.0软件统计分析。

如表一所示：

表1 中药复方制剂在鸡胚内抗猪流感病毒的效果

注：以上数据为测得HA平均值；与病毒对照相比， *表示P﹤0.01，差异极显著。

表1显示本发明所述的中药复方在鸡胚内抗猪流感病毒效果，结果显示中药复方与病毒对照组相比，差异极显著或显著，具有明显的抗猪流感病毒效果。

实施例2 中药复方对小鼠感染猪流感病毒的抵抗效果

1．中药复方对猪流感病毒感染小鼠的死亡保护作用和延长寿命作用

（1）实验动物分组

将BALB/c小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、病毒唑组、中药复方组，共4组，每组10只。

（2）实验动物给药

各组小鼠均以灌胃给药，2次/d，0.2 ml/次。中药各组于感染前1 d开始给药，连续5 d。同时，正常对照组、模型对照组给予等量蒸馏水

（3）实验动物攻毒

将小鼠用乙醚麻醉后，除正常对照组外，各组滴鼻接种10 LD50流感病毒50μl，正常对照组接种50μl灭菌PBS。

（4）试验观察

逐日观察小鼠发病情况，记录死亡数、存活时间，计算死亡率=(各组死亡数/各组总数×100%)；死亡保护率=(模型对照组死亡率-给药组死亡率)/模型对照组死亡率×100%]；延长寿命率=(给药组平均存活时间-模型对照组平均存活时间)/模型对照组平均存活时间×100%，详见表2：

表2 中药复方制剂对猪流感病毒感染小鼠的死亡保护作用和延长寿命作用

注：以上数据与模型对照组相比， *表示P﹤0.01，差异极显著。

由表2可见，本发明所述的中药复方组的小鼠死亡率低于模型对照组，死亡保护率、平均存活时间和延长寿命率均高于模型对照组，显示：本发明所述中药复方具有抗猪流感的作用。

2．中药复方对猪流感病毒感染小鼠肺炎的影响

（1）实验动物分组、给药、造模同1（1）（2）（3）

（2）感染后第5天（禁食8h以上）称重，摘眼球放血处死小鼠，无菌摘取肺脏，用PBS冲洗并用无菌滤纸吸去表面多余液体后分别称量肺重。

肺指数与肺指数抑制百分率计算公式如下：

肺指数=肺脏重量（g）/小鼠重量（g）×100

肺指数抑制百分率=（对照组肺指数均数-实验组肺指数均数）/对照组数×100%

（3）统计分析：用SPSS17.0软件统计分析，详见表3：

表3三种中药复方制剂对猪流感病毒感染小鼠肺炎的影响

注：以上数据与模型对照组相比， *表示P﹤0.01，差异极显著。

    由表3可见，中药复方组和病毒唑组小鼠的肺指数均低于模型对照组，表明：本发明所述的中药复方可抑制猪流感病毒导致的小鼠肺炎。

3．中药复方对猪流感病毒感染小鼠后血液中细胞因子含量的影响

（1）实验动物分组、给药、造模同1（1）（2）（3）

（2）血清的制备

感染后第5天，眼球采血，置于灭菌离心管中，室温血液自然凝固2~3小时，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

（3）采用ELISA试剂盒检测

①标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为2400 pg/mL，1600 pg/mL ，800 pg/mL，400 pg/mL，200 pg/mL）。 

②加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 

③温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 

④配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 

⑤洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 

⑥加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 

⑦温育：操作同3。 

⑧洗涤：操作同5。 

⑨显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟. 

⑩终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 

○11测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。 

（4）统计分析

用SPSS17.0软件统计分析，详见表4。

表4中药复方制剂对猪流感病毒感染小鼠细胞因子的影响（x(—)±S.E， ng/mL）

注：以上数据与模型对照组相比， *表示P﹤0.05，差异显著；**表示P﹤0.01，差异极显著。

结果显示，本发明的中药复方与病毒模型组相比，差异极显著。

4.中药复方对小鼠感染猪流感病毒后的临床症状和肺部病变的影响

（1）实验动物分组、给药、造模同1（1）（2）（3）

（2）感染后观察小鼠的精神状态、呼吸、采食和饮水等状况，第5天（禁食8h以上）称重，摘眼球放血处死小鼠，无菌摘取肺脏，观察肺部病变。

临床症状如下：模型组小鼠在接毒后第2天出现精神不振，反应迟钝，皱毛，弓背，食欲下降及呼吸急促，爱扎堆，蜷缩，竖毛，颤抖；第3天出现死亡，第5~6天全部死亡。正常对照组小鼠未出现临床症状，复方中药组小鼠的临床症状有不同程度的减轻。 

肺部病变如下，肉眼观察各组小鼠肺脏大体病变：正常对照组小鼠肺脏呈淡粉红色，含气，无实变区，无异常所见。病毒感染模型组可见感染小鼠肺脏体积增大，大多数均有2个肺叶以上成片的实变区，呈现暗红色外观，而复方中药组肺部病变有不同程度的减轻。

Claims (4)

1.一种用于抗猪流感病毒的中药复方，包含如下药物：金银花42重量份，赤芍药42重量份，绵马贯众16重量份。

2.如权利要求1所述的一种用于抗猪流感病毒的中药复方，其特征在于，所述的复方是指所含的中药种类及其中药比重。

3.如权利要求1所述一种用于抗猪流感的中药复方，所述的重量份是指复方中各种药物占整个复方的重量比例。

4.一种权利要求1所述的用于抗猪流感病毒的中药复方的提取方法，其特征在于，采用水煎煮方法进行粗提，具体步骤是：

（1）按金银花42重量份、赤芍药42重量份和绵马贯众16重量份的比例，称取各中药，组成100g中药复方；

（2）将100g中药复方粉碎到20目，浸泡1h，水煎2次，每次煮沸30 min，合并2次煎液；

（3）将煎液在常压真空抽滤及浓缩，定容至200mL水煎液,每毫升相当于0.5g生药（即500mg/mL）；

（4）将水煎液进行高压灭菌，保存至温度为4℃冰箱内备用。