CN102697906A

CN102697906A - 防治猪流感病毒的复方中药制剂

Info

Publication number: CN102697906A
Application number: CN2012101862340A
Authority: CN
Inventors: 王丙云; 陈胜锋; 陈志胜; 计慧琴; 徐振娜; 冼琼珍
Original assignee: Foshan University
Current assignee: Foshan University
Priority date: 2012-06-07
Filing date: 2012-06-07
Publication date: 2012-10-03

Abstract

防治猪流感病毒的复方中药制剂，其特征在于由麻黄22—28重量份、杏仁17—22重量份、石膏22—28重量份、连翘28—33重量份构成；或者由麻黄27—33重量份、杏仁27—33重量份、桂枝22—27重量份、炙甘草13—17重量份构成。本发明与已有技术相比，具有药源丰富、残毒较低或无残毒、副作用小、不易产生耐药性的，同时能调节机体免疫功能、抑制病毒复制、改善临床症状的优点。

Description

防治猪流感病毒的复方中药制剂

技术领域

本发明属于兽用中药领域，特别是抑制猪流感病毒复方中药制剂。

背景技术

猪流感（swine influenza，SI）又称猪流行性感冒，是由正黏病毒科A型流感病毒属的猪流感病毒（swine influenza virus，SIV）引起的一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病，临床以突发、高热、咳嗽、呼吸困难、反复发作、发病率高、死亡率低为特征。此病在世界各地都有发生, 危害严重, 经济损失巨大, 并对人类的健康构成威胁。其突出的流行特点是常以亚临床形式存在并常引起其他呼吸道细菌和病毒的继发或混合感染，如猪繁殖与呼吸综合症、猪圆环病毒病和猪传染性胸膜肺炎等，使疫情变得复杂，死亡率增高。

在临床实践猪流感的防治上，由于抗生素具有控制并发症的特点而被广泛使用，同时配合大量的解热镇痛、糖皮质激素类等药物。然而在抑制机体炎症反应的同时也加深了免疫抑制，导致病情更加的恶化。

发明内容

本发明的目的是提供一种药源丰富、残毒较低或无残毒、副作用小、不易产生耐药性的，同时能调节机体免疫功能、抑制病毒复制、改善临床症状的防治猪流感病毒的复方中药制剂。

本发明是这样实现的，由麻黄22—28重量份、杏仁17—22重量份、石膏22—28重量份、连翘28—33重量份构成；或者由麻黄27—33重量份、杏仁27—33重量份、桂枝22—27重量份、炙甘草13—17重量份构成。由于采用纯中药，因此，残毒较低或无残毒、副作用小、不易产生耐药性，而且，各中药成分都是容易获得药材，经体外试验和体内试验，从作用机理和临床实际上综合研究均证明本发明具有防治猪流感病毒的作用。

这里，为了使用方便，将100g的构成本发明的各组分粉碎到至少20目，然后浸泡1h以上，水煎至少2次，每次煮沸30 min以上，合并煎液，常压真空抽滤及浓缩，定容至100mL中药提取液。

本发明与已有技术相比，具有药源丰富、残毒较低或无残毒、副作用小、不易产生耐药性的，同时能调节机体免疫功能、抑制病毒复制、改善临床症状的优点。

具体实施方式：

现实例对本发明作进一步说明：

本发明是这样实现的，由麻黄、杏仁、石膏、连翘构成；或者由麻黄、杏仁、桂枝、炙甘草构成，各组分的重量用量如下表1所示。

表1：

	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6
							麻黄	22	25	28	27	30	33
杏仁	22	20	17	33	30	27
							石膏	28	25	22
连翘	28	30	33
							桂枝				23	25	27
炙甘草				17	15	13

采用本发明的中药提取液进行下述的药效实验。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用实验材料如下：

（一）试验动物

9~11日龄SPF（无特定病原）鸡胚购自广东大华农禽蛋有限公司；SPF级15g±2g BALB/c小鼠购自广东省医学实验动物中心。

（二）溶液或试剂配制

1.PBS的配制：称取NaCl 8.0g、Na₂HPO₄3.63g、KCl 0.2g KH₂PO₄ 0.24g溶于适量超纯水，调pH值至7.4，定容至1000mL；100ml/瓶分装，15磅高压灭菌30min，4℃保存备用。

2. 1%鸡红细胞悬液的配制：先用灭菌注射器吸取3.8%枸橼酸钠溶液（其用量为所需血量的1/5），从鸡翅静脉抽血至所需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌PBS为抗凝血的2倍，以2000r/min离心10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据所需用量，用灭菌PBS配成1%悬液，现配现用。

药效实验1 ：

1. SIV（猪流感病毒）对鸡胚半数感染量（EID ₅₀ ）的测定

将病毒液依次作10倍倍比稀释，接种于10日龄鸡胚尿囊腔内，每个稀释度接种0.2ml/枚，作4个重复，同时设正常鸡胚对照。置37℃恒温箱内孵化72h，弃去24h内死亡胚，收获24h后死亡胚及72h活胚的尿囊液，进行HA效价（ HA即为病毒的血凝素，HA效价是一种通用的间接反应病毒含量的指标）的测定。按Reed-Muench两氏法（一种医学通用的测定病毒或细菌的50%致死剂量的试验方法）计算EID₅₀。

．本发明中药提取液对鸡胚的最大安全浓度的测定

将中药提取液依次作2倍倍比稀释，稀释成原浓度、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64等7个浓度，然后接种于10日龄鸡胚尿囊腔内，每个稀释度接种0.2ml/枚，作4个重复，同时设生理盐水对照。置37℃恒温箱孵育72 h，每天观察存活情况，弃去24h内死亡胚。鸡胚全部存活的最高药物浓度为正式试验的起始浓度，即中药提取液对鸡胚的最大安全浓度。

．本发明中药提取液在鸡胚内抗猪流感病毒的试验

将鸡胚随机分成三组，采用三种加药方式：

方式一、先加中药再加病毒（中药对SIV的阻断作用）：先将各中药提取液接种于10日龄鸡胚，0.2ml/枚，作4个重复，置37℃恒温箱孵育2h，然后接种100EID50病毒液（病毒需要达到一定的浓度或剂量才能感染人或者细胞，100EID50就是一种病毒剂量的表示方法，指的是该剂量的病毒可以使50%的鸡胚感染）0.2ml/枚，37℃恒温培养72h，测定鸡胚尿囊液的血凝（HA）效价。

方式二、先加病毒再加中药（中药对SIV的抑制作用）：先将100EID50病毒液接种于10日龄鸡胚，0.2ml/枚，作4个重复，置37℃恒温箱孵育2h，然后接种各中药提取液0.2ml/枚，37℃恒温培养72h，测定鸡胚尿囊液的血凝（HA）效价。

方式三、中药病毒混合后一起加（中药对SIV的直接杀灭作用）：先将各中药提取液与等量100EID50病毒液混合后，置37℃2h后，接种于10日龄鸡胚，0.2ml/枚，作4个重复。37℃恒温培养72h，测定鸡胚尿囊液的血凝（HA）效价。

同时设立病毒对照和阴性对照。

．数据处理

数据以 ±S.E表示，用SPSS17.0软件（ SPSS是一种公认的统计分析软件，常用于科学研究，商业调查统计等，17.0是版本号）统计分析，获得表2的结果。

表2

注：以上数据为测得HA平均值；与病毒对照相比， *表示P﹤0.01，差异极显著。

药效实验2 ：

1．本发明中药提取液对猪流感病毒感染小鼠的死亡保护作用和延长寿命作用

（1）实验动物分组

将BALB/c小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、病毒唑组、实施例1组、实施例2组、实施例3组、实施例4组、实施例5组、实施例6组，每组10只。

（2）实验动物给药

各组小鼠均以灌胃给药，2次/d，0.2 ml/次。中药各组于感染前1 d开始给药，连续5 d。同时，正常对照组、模型对照组给予等量蒸馏水

（3）实验动物攻毒

将小鼠用乙醚麻醉后，除正常对照组外，各组滴鼻接种10 LD50流感病毒50μl，正常对照组接种50μl灭菌PBS。

（4）试验观察

逐日观察小鼠发病情况，记录死亡数、存活时间，计算死亡率=(各组死亡数/各组总数×100%)；死亡保护率=(模型对照组死亡率-给药组死亡率)/模型对照组死亡率×100%]；延长寿命率=(给药组平均存活时间-模型对照组平均存活时间)/模型对照组平均存活时间×100%。其结果如表3所示：

表3

试验分组	死亡率（%）	死亡保护率（%）	平均存活时间（d）	延长寿命率（%）
					实施例1组	80	20	6.8	90
实施例2组	80	20	7.1	91.9
					实施例3组	80	20	6.9	90.5
实施例4组	80	20	6.9	88.5
					实施例5组	80	20	7	89.2
实施例6组	80	200	6.8	88.4
					病毒唑组	80	20	6.5	75.7
模型对照组	100	0	3.7	0
					正常对照组	0	100	﹥14	100

2．本发明中药提取液对猪流感病毒感染小鼠肺炎的影响

（1）实验动物分组、给药、造模同1（1）（2）（3）

（2）感染后第5天（禁食8h以上）称重，摘眼球放血处死小鼠，无菌摘取肺脏，用PBS冲洗并用无菌滤纸吸去表面多余液体后分别称量肺重。

肺指数与肺指数抑制百分率计算公式如下：

肺指数=肺脏重量（g）/小鼠重量（g）×100

肺指数抑制百分率=（对照组肺指数均数-实验组肺指数均数）/对照组数×100%

（3）统计分析：用SPSS17.0软件统计分析，结果如表4所示。

表4

试验分组	肺指数	肺指数抑制百分率（%）
			实施例1组	1.85±0.25^*	35.00
实施例2组	1.78±0.25^*	36.43
			实施例3组	1.83±0.25^*	35.50
实施例4组	2.25±0.3^*	25.25
			实施例5	2.08±0.3^*	25.71
实施例6	2.30±0.24^*	31.79
			病毒唑组	1.95±0.22^*	30.35
模型对照组	2.80±0.10
			正常对照组	0.77±0.07^*	72.5

注：以上数据与模型对照组相比， *表示P﹤0.01，差异极显著。

．本发明中药提取液对猪流感病毒感染小鼠细胞因子的影响

（1）实验动物分组、给药、造模同1（1）（2）（3）

（2）血清的制备：感染后第5天，眼球采血，置于灭菌离心管中，室温血液自然凝固2~3小时，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

（3）采用ELISA试剂盒检测（ ELISA,中文名称是酶联免疫吸附试验，是一种常规的检测方法，在专业文献资料中均通用该缩写）:

①标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为2400 pg/mL，1600 pg/mL ，800 pg/mL，400 pg/mL，200 pg/mL）。

②加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

③温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

④配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

⑤洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

⑥加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

⑦温育：操作同3。

⑧洗涤：操作同5。

⑨显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

⑩终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

（4）统计分析：用SPSS17.0软件统计分析，其结果如表5所示。

表5

试验分组	IL-2（x±s，ng/ml）	IFN-γ（x±s，ng/ml）	TNF-α（x±s，ng/ml）
				实施例1	2.51±0.24^*	1.37±0.10^*	0.44±0.06^**
实施例2	2.56±0.26^*	1.38±0.10^*	0.46±0.06^**
				实施例3	2.53±0.25^*	1.36±0.09^*	0.45±0.05^**
实施例4	2.71±0.30^**	1.49±0.11^**	0.50±0.04^**
				实施例5	2.74±0.31^**	1.50±0.11^**	0.52±0.05^**
实施例6	2.72±0.31^**	1.48±0.10^**	0.51±0.05^**
				病毒唑	2.51±0.18^*	1.40±0.19^*	0.51±0.05^**
模型对照	1.91±0.16	1.07±0.18	0.69±0.09
				正常对照	2.17±0.19	1.17±0.11	0.43±0.03^**

注：以上数据与模型对照组相比， *表示P﹤0.05，差异显著；**表示P﹤0.01，差异极显著。

（IL-2，白细胞介素－2；IFN-γ:干扰素γ；TNF-α：肿痛坏死因子α；这三种物质都是反应机体受到病毒感染后产生的抵抗因子，可反应机的抵抗力。x±s表示表格中数据的表示方法为平均数±标准误；ng/ml表示的是单位，即每毫升中含有多少纳克。可以把（x±s，ng/ml）改为：（单位：ng/ml）或者直接删除也可）。

Claims

1.防治猪流感病毒的复方中药制剂，其特征在于由麻黄22—28重量份、杏仁17—22重量份、石膏22—28重量份、连翘28—33重量份构成；或者由麻黄27—33重量份、杏仁27—33重量份、桂枝22—27重量份、炙甘草13—17重量份构成。

2.根据权利要求1所述的防治猪流感病毒的复方中药制剂，其特征在于将100g的构成本发明的各组分粉碎到至少20目，然后浸泡1h以上，水煎至少2次，每次煮沸30 min以上，合并煎液，常压真空抽滤及浓缩，定容至100mL中药提取液。