CN108245586B - 小儿解感颗粒在抗病毒中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供小儿解感颗粒在抗病毒中的应用，所述病毒包括呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒1型(HSV1)、流感病毒(H1N1)。本发明人研究表明小儿解感颗粒对呼吸道合胞病毒(RSV)的治疗指数为13.55，抗单纯疱疹病毒1型(HSV1)的治疗指数3.68，抗流感病毒(H1N1)的治疗指数为14.62。本发明为进一步深入研究、拓展小儿解感颗粒的临床用药范围奠定了基础。

Description

小儿解感颗粒在抗病毒中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及到小儿解感颗粒在抗病毒中的应用。
背景技术
小儿解感颗粒是临床上常用的治疗小儿感冒的成方，是山东明仁福瑞达制药有限公司的重点产品。该方剂由大青叶、柴胡、黄芩、荆芥、桔梗、甘草组成。其药物配伍及药理作用为：以柴胡为君，去少阳之邪气，清肝胆之郁热，解除外感病之发热、头痛、胸胁苦满等症，可清热解毒，辛凉解表，柴胡为除少阳经郁热之主药，在全方中起着协调全身气机，除寒热邪气而解毒的作用。《景岳全书》谓柴胡:“其凉散，平肝之热，入肝、胆、三焦、心胞四经。其性凉，故解寒热往来，肌表潮热，肝胆火炎，胸胁痛结，……。”臣以黄芩，可加强柴胡清解少阳经和肝胆热毒之功，其味苦性寒，功能清热解毒，可清上、中、下三焦实火，尤擅清上焦肺火，也擅清少阳经和肝胆之火，能有效抗菌抗病毒，也有很强的退热作用，对于感冒发烧属实热证者，疗效确切。佐以大青叶，清少阳肝肝之热，并治咽喉肿痛，口苦等症，又佐以荆芥、桔梗，疏散风热之邪，并治头痛咽痛等症。以生甘草清热解毒，合而清解少阳郁热并达到扶正祛邪之功(肖飞等，小儿解感颗粒的临床应用经验探讨，世界中医药2017年1月第12卷第1期)。具清热解表，消炎止咳的功效。用于感冒发烧，头痛鼻塞，咳嗽喷嚏，咽喉肿痛。其在感染性疾病的治疗方面具有一定的临床应用基础和市场认知度。
作为治疗感染性疾病的中成药，小儿解感颗粒在临床上一般用于治疗小儿外感发热、咽喉肿痛、上呼吸道感染等病症。尚未有关于小儿解感颗粒单独用于抗病毒的应用的相关研究。现有研究中在上呼吸道感染抗病毒治疗过程中，一般以常规抗病毒药物如利巴韦林为主，辅以小儿解感颗粒，治疗效果良好。其中小儿解感颗粒依然作为清热解表药物，用于改善患儿发热、咳嗽等临床症状。如，农棉外.小儿解感颗粒治疗小儿急性上呼吸道感染临床研究(中医学报，2013，28(8):1253-1254.)一文中在治疗小儿急性上呼吸道感染过程中，在常规用利巴韦林抗病毒的基础上，同时服用小儿解感颗粒，治疗效果良好。方红霞等.小儿解感颗粒联合利巴韦林治疗急性上呼吸道感染的临床观察(中国药房，2015，26(32):4575-4577.)。
现有研究中对小儿解感颗粒单独使用是否具有抗病毒的功效，尚未可知。因此，开展了小儿解感颗粒的抗菌抗病毒研究、明确其作用、扩大小儿解感颗粒的临床应用范围十分有必要。
发明内容
本发明正是针对以上不足，开展了小儿解感颗粒的抗菌抗病毒谱研究，用现代科学语言诠释其治疗感染性疾病所针对的病原体，使非中医医务人员在临床使用时做到有的放矢，实现治疗精准化，同时扩大小儿解感颗粒的临床应用范围。
故，本发明提供小儿解感颗粒在抗病毒中的应用，具体地，所述病毒包括呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒1型(HSV1)、流感病毒(H1N1)；
为实现上述发明目的，本发明人完成了小儿解感颗粒的抗病毒谱研究，研究表明小儿解感颗粒对呼吸道合胞病毒(RSV)的治疗指数为13.55，抗单纯疱疹病毒1型(HSV1)的治疗指数3.68，抗流感病毒(H1N1)的治疗指数为14.62。
表1小儿解感颗粒体外抗病毒实验结果
Figure BDA0001584370930000021
本发明还提供小儿解感颗粒在制备抗病毒药物中的应用，所述药物包括小儿解感颗粒及其他具有抗病毒作用的药物和/或医学上可以接受的辅料；制成任何一种药学上可接受的剂型。所述的剂型可以是片剂、胶囊、颗粒剂。
本发明所述小儿解感颗粒由山东明仁福瑞达制药股份有限公司生产，其处方组成为：大青叶830g、柴胡415g、黄芩415g、荆芥415g、桔梗250g、甘草165g。制法为：取桔梗125重量份粉碎成细粉；柴胡415重量份加水蒸馏提取挥发油，蒸馏后的挥发油用β-环糊精包合成包合物，其中油:β-环糊精为1ml:6g、搅拌时间3h、温度为40℃；药渣与大青叶830重量份、黄苓415重量份、荆芥415重量份、桔梗125重量份、甘草165重量份混合，加水煎煮二次，依次为3小时、2小时，合并煎液及柴胡蒸馏后的水溶液，滤过，滤液浓缩至在60～80℃测得相对密度为1.20～1.25的浓缩液，加乙醇使含醇量为70％，充分搅拌，静止24小时，取上清液回收乙醇，并浓缩至在80℃测得相对密度为1.30～1.35的清膏；将上述清膏加入桔梗细粉及挥发油包合物，混匀，即得提取浸膏；加入糊精、乳糖和庶糖作为制粒辅料，进行一步制粒，混匀，即得小儿解感颗粒。
本发明提供了小儿解感颗粒在抗病毒方面的新用途：小儿解感颗粒外对呼吸道合胞病毒、抗单纯疱疹病毒1型、流感病毒具有一定的抑制效果。为进一步深入研究、拓展小儿解感颗粒的临床用药范围奠定了基础。拓展了小儿解感颗粒的发展前景。
尤其是2017年流感病毒的大规模爆发，虽然本次流感类型主要是乙型流感，但甲型H1N1流感病毒极有可能成为替代乙型流感大肆传播的病毒类型。抗病毒形势不容乐观，凸显了抗病毒中药的重要性。本发明小儿解感抗甲型流感病毒H1N1的这一发现，对于流感病毒的控制将会大有帮助。
附图说明
图1为小儿解感颗粒对Hep-2细胞毒性测定结果。图1A为正常Hep-2细胞(100*)，图1B为药物毒性细胞(100*)。
图2为小儿解感颗粒对RSV体外抑制作用结果。图2A为病毒对照(100*)，图2B为正常细胞对照(100*)，图2C为利巴韦林对照(100*)，图2D为小儿解感颗粒有效对照组(100*)。
图3为小儿解感颗粒对HSV-1体外抑制作用结果。图3A为病毒对照(100*)，图3B为正常细胞对照(100*)，图3C为阿昔洛韦对照(100*)，图3D为小儿解感颗粒有效对照组(100*)。
图4为小儿解感颗粒对MDCK细胞毒性测定结果。图4A为正常MDCK细胞(200*)，图4B为药物毒性细胞(100*)。
图5为小儿解感颗粒对H1N1体外抑制作用结果。图5A为病毒对照(100*)，图5B为正常细胞对照(100*)，图5C为利巴韦林对照(100*)，图5D为小儿解感颗粒有效对照组(100*)。
具体实施方式
下面结合具体实验过程对本发明做进一步说明。本发明所述方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。
实验1.小儿解感颗粒体外抗呼吸道合胞病毒效果研究
【摘要】目的：研究小儿解感颗粒的体外抗RSV病毒作用。方法：采用Hep2(人喉癌细胞)培养法检测小儿解感颗粒抗RSV病毒作用。结果：小儿解感颗粒可抑制呼吸道合胞病毒的繁殖，治疗指数为13.55。结论：小儿解感颗粒有体外抗RSV病毒作用。
1.1细胞与病毒
Hep2(人喉癌细胞)由山东省医学科学院微生物室提供；RSV(呼吸道合胞病毒)由山东省医学科学院微生物室提供；小儿解感颗粒(山东明仁福瑞达制药股份有限公司，批号：15105057)；利巴韦林(山东鲁抗辰欣药业有限公司，批号：110602304)
1.2主要仪器
超净工作台(济南隆宏公司)；酶标仪(芬兰雷勃公司产品)；低温高速离心机(贺立氏台式低温离心机)；倒置显微镜(Olympus公司)；高压灭菌锅(济南德强仪器有限公司MJ37600)；纯水机(济南太平玛环保有限公司)；CO2细胞恒温培养箱(美国FOMAS公司)
1.3主要试剂及配置
2％细胞维持液：改良型RPMI-1640液500mL，加入10mL新生牛血清(四季青)。
10％1640细胞培养液：改良型RPMI-1640液500mL，加入50mL新生牛血清，双抗2mL，混匀，置4℃冰箱，备用
双抗：取l00WU链霉素溶于5mL蒸馏水中，弃去1mL；将80wU青霉素溶于76mL蒸馏水中，与余4mL链霉素相混匀，0.22微米滤膜过滤除菌，每管1.5mL分装于EP管，置于－20℃冰箱备用。
PBS：HyClone产品
消化液：0.25％Trypsin-EDTA
MTT染色剂：取MTT粉末0.5g，溶于100ml PBS中，0.22微米滤膜过滤除菌，每管1ml分装于EP管，置于－20℃冰箱备用。
脱色剂：DMSO
2、试验方法
2.1细胞的复苏及培养
Hep2细胞冻存管从-80℃超低温冰箱取出，立即投入37℃～42℃温水中融化(遵循慢冻速溶原则)，超净工作台内将冻存管中液体移入离心管中，800r/min，5min，弃冻存液，加入5mL浓度10％的1640细胞培养液轻轻将下层沉淀细胞吹打混匀，用移液管转移到培养瓶内，在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。待细胞长成单层后进行传代。
2.2病毒的扩增
将RSV病毒接种于己经长成单层的Hep2细胞上，加1640维持液5mL置37℃、5％CO2病毒培养箱中培养，并设细胞对照，逐日观察。待细胞出现90％以上的病变时，反复冻融3次，用吸管轻轻吹打，1000r/min，5min，取上清液定量分装于冻存管中，封口膜封口，放于－80℃冰箱冻存备用。
2.3病毒毒力的测定
将病毒用1640维持液做10倍比系列稀释不同浓度，纵向重复4孔，依次接种于己长成单层的Hep2细胞的96孔板中，同时设细胞对照。37℃、5％C病毒培养箱中培养，倒置显微镜下观察24h，加5mg/ml MTT 10ul，37℃、5％CO2培养箱中4小时，吸弃染液，加DMSO 100ul，室温脱色10min，用酶标仪在490nm波长测定OD值。根据Reed-Muench公式计算病毒液的半数感染浓度TCID50。
细胞存活率＝各组OD值/正常细胞OD值×100％
细胞病变率＝1－细胞存活率
细胞比距＝(高于50％病变率－50％)/(高于50％病变率－低于50％病变率)×100％
TCID5o＝Antilg(Ig高于50％CPE百分率病毒稀释度+比距×稀释对数间的差)2.4药物对细胞毒性测定
将小儿解感颗粒用1640维持液按二倍比稀释10个浓度梯度，依次接种于己经长成单层的Hep2细胞的96孔板中，并设3个复孔，空白对照孔及细胞对照孔；37℃、5％CO2培养箱中培养，24h后观察细胞病变程度，计算药物的最大无毒浓度。细胞出现病变者判为药物毒性，MTT染色，用酶标仪在490nm波长测定OD值，应用Reed-Muench公式计算药物半数中毒浓度(TC50)，并确定最小无毒浓度(TC0)。
TC50＝[Antilog(log高于50％CPE百分率药物稀释度-比距)]×C
2.5小儿解感颗粒抗RSV病毒实验
小儿解感颗粒从无毒浓度起用1640二倍比系列稀释10个浓度，每孔100ul接种于已长成单层Hep-2细胞的96板孔中，每孔再加入100ulRSV病毒液，同时设利巴韦林阳性对照组、病毒对照组及空白细胞对照组，每组3个复孔。5％CO2培养箱中培养，观察细胞病变，待病毒对照出现90％以上的病变时，MTT染色，并用酶标仪在490nm波长测定OD值。应用Reed-Muench方法计算药物半数有效浓度(EC50)和治疗指数(TI)。
EC50＝[Antilog(log高于50％CPE百分率药物稀释度的值-比距)]×C
TI＝半数毒性浓度(TC50)/半数有效浓度(EC50)
3、实验结果
3.1RSV病毒毒力测定结果
应用Reed-Muench方法计算RSV病毒TCID50为10-3.89。实验时用100个TCID50作为病毒液浓度，因此将病毒原液稀释100倍用于实验。
3.2小儿解感颗粒对Hep-2细胞毒性测定结果
小儿解感颗粒对细胞的毒性在加入药物8小时后毒性开始出现，24小时后全部显现，随着药物浓度的降低而降低，Hep2细胞的存活率随着药物浓度的降低而增加。小儿解感颗粒对Hep-2细胞的毒性表现为大部分细胞破碎或脱落，颗粒物质增多，细胞增值缓慢，折光性增强，细胞形态改变。小儿解感颗粒TC50＝1.65mg/ml。图1A显示的是正常Hep-2细胞(100*)，图1B为药物毒性细胞(100*)。3.3小儿解感颗粒对RSV体外抑制作用
每日观察细胞病变情况，病毒感染12小时后病毒组开始出现病变，药物组也开始显现病变，细胞在无毒浓度范围内随着药物浓度的降低，RSV感染细胞表现明显，细胞间变圆、破碎、脱落，24小时病毒对照组90％病变，药物组几个浓度梯度孔被完全保护，细胞生长良好。小儿解感颗粒TI＝13.55。
图2为小儿解感颗粒对RSV体外抑制作用结果。图2A为病毒对照(100*)，图2B为正常细胞对照(100*)，图2C为利巴韦林对照(100*)，图2D为小儿解感颗粒有效对照组(100*)。
4小结与讨论
呼吸道合胞病毒是一种RNA病毒，属副粘液病毒科。该病经空气飞沫和密切接触传播。多见于新生儿和6个月以内的婴儿。潜伏期3～7日。婴幼儿症状较重，可有高热、鼻炎、咽炎及喉炎，以后表现为细支气管炎及肺炎。少数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。成人和年长儿童感染后，主要表现为上呼吸道感染。RSV肺炎占小儿病毒性肺炎的首位，严重危害小儿的身体健康。目前尚无理想的治疗手段。
小儿解感颗粒外对呼吸道合胞病毒具有一定的抑制效果。如能进一步深入研究，将拓展小儿解感颗粒的临床用药范围，其发展前景广阔。
实验2.小儿解感颗粒体外抗单纯疱疹病毒效果研究
【摘要】目的：研究小儿解感颗粒的体外抗HSV-1(单纯疱疹)病毒作用。方法：采用Hep2(人喉癌细胞)培养法检测小儿解感颗粒抗HSV-1病毒作用。结果：小儿解感颗粒对HSV-1病毒的繁殖有抑制作用，治疗指数为3.68。结论：小儿解感颗粒有一定的体外抗HSV-1病毒作用。
1、实验材料
1.1细胞与病毒
Hep2(人喉癌细胞)由山东省医学科学院微生物室提供；HSV-1(单纯疱疹病毒)由山东省医学科学院微生物室提供；小儿解感颗粒(山东明仁福瑞达制药股份有限公司，批号：15105057)；利巴韦林(山东鲁抗辰欣药业有限公司，批号：110602304)
1.2主要仪器
超净工作台(济南隆宏公司)；酶标仪(芬兰雷勃公司产品)；低温高速离心机(贺立氏台式低温离心机)；倒置显微镜(Olympus公司)；高压灭菌锅(济南德强仪器有限公司MJ37600)；纯水机(济南太平玛环保有限公司)；CO2细胞恒温培养箱(美国FOMAS公司)
1.3主要试剂及配置
2％细胞维持液：改良型1640液500mL，加入10mL新生牛血清(四季青)。
10％1640细胞培养液：改良型1640液500mL，加入50mL新生牛血清，双抗2mL，混匀，置4℃冰箱，备用
双抗：取100WU链霉素溶于5mL蒸馏水中，弃去1mL；将80WU青霉素溶于76mL蒸馏水中，与余4mL链霉素相混匀，0.22微米滤膜过滤除菌，每管1.5mL分装于EP管，置于－20℃冰箱备用。
PBS：HyClone产品
消化液：0.25％Trypsin-EDTA
MTT染色剂：取MTT粉末0.5g，溶于100ml PBS中，0.22微米滤膜过滤除菌，每管1ml分装于EP管，置于－20℃冰箱备用。
脱色剂：DMSO
2、实验方法
2.1细胞的复苏及培养
Hep2冻存管从液氮罐取出，立即投入37℃～42℃温水中融化(遵循慢冻速溶原则)，超净工作台内将冻存管中液体移入离心管中，800r/min，5min，弃冻存液，加入5mL浓度10％的1640细胞培养液轻轻将下层沉淀细胞吹打混匀，用移液管转移到培养瓶内，在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。待细胞长成单层后进行传代。
2.2病毒的扩增
将HSV-1病毒接种于己经长成单层的Hep2细胞上，加1640维持液5mL置37℃、5％CO2病毒培养箱中培养，并设细胞对照，逐日观察。待细胞出现80％以上的病变时，反复冻融3次，用吸管轻轻吹打，1000r/min，5min，取上清液定量分装于冻存管中，封口膜封口，放于－80℃冰箱冻存备用。
2.3病毒毒力的测定
将病毒用1640维持液做10倍比系列稀释不同浓度，纵向重复4孔，依次接种于己长成单层的Hep2细胞的96孔板中，同时设细胞对照。37℃、5％CO2病毒培养箱中培养，倒置显微镜下观察24h，加5mg/ml MTT 10ul，37℃、5％CO2培养箱中4小时，吸弃染液，加DMSO100ul，室温脱色10min，用酶标仪在490nm波长测定OD值。根据Reed-Muench公式计算病毒液的半数感染浓度TCID50。
细胞存活率＝各组OD值/正常细胞OD值×100％
细胞病变率＝1－细胞存活率
细胞比距＝(高于50％病变率－50％)/(高于50％病变率－低于50％病变率)×100％
TCID5o＝Antilg(Ig高于50％CPE百分率病毒稀释度+比距×稀释对数间的差)2.4药物对细胞毒性测定
将小儿解感颗粒用1640维持液按二倍比稀释10个浓度梯度，依次接种于己经长成单层的Hep2细胞的96孔板中，并设4个复孔及细胞对照孔；37℃、5％CO2培养箱中培养，逐日观察细胞病变，连续观察3d，计算药物的最大无毒浓度。细胞出现病变者判为药物毒性MTT染色，用酶标仪在490nm波长测定OD值，应用Reed-Muench公式计算药物半数中毒浓度(TC50)，并确定最小无毒浓度(TC0)。TC50＝[Antilog(log高于50％CPE百分率病毒稀释度-比距)]×C
2.5小儿解感颗粒抗HSV-1病毒实验
小儿解感颗粒从无毒浓度起用1640二倍比系列稀释10个浓度，每孔100ul接种于已长成单层Hep2细胞的96板孔中，每孔再加入100ulHSV-1病毒液，同时设阿昔洛韦阳性对照组、病毒对照组及空白细胞对照组，每设3个复孔。5％CO2培养箱中培养，观察细胞病变，待病毒对照出现90％以上的病变时，MTT染色，并用酶标仪在490nm波长测定OD值。应用Reed-Muench方法计算药物半数有效浓度(EC50)和治疗指数(TI)。
EC50＝[Antilog(log高于50％CPE百分率病毒稀释度的值-比距)]×C
TI＝半数毒性浓度(TC50)/半数有效浓度(EC50)
3、实验结果
3.1单纯疱疹病毒毒力测定结果
应用Reed-Muench方法计算HSV-1的TCID50为10-3.76。实验时用100个TCID50作为病毒液浓度，因此将病毒原液稀释100倍用于实验。
3.2小儿解感颗粒对Hep2细胞毒性测定结果
小儿解感颗粒对细胞的毒性在加入药物8小时候就开始显现，24小时候药物毒性全部显现，随着药物浓度的降低而降低，Hep2细胞的存活率随着药物浓度的降低而增加。小儿解感颗粒对Hep2细胞的毒性表现为大部分细胞破碎或脱落，颗粒物质增多，细胞增值缓慢，折光性增强，细胞形态改变。小儿解感颗粒TC50＝＝1.65mg/ml。
3.3小儿解感颗粒体外抑制HSV-1作用
每日观察，在接种HSV-1病毒12小时后病毒对照孔开始出现病变，细胞开始融合、肿胀、脱落，48小时后病毒对照组90％病变，药物组药物组几个浓度梯度孔被基本保护，细胞生长良好。小儿解感颗粒TI＝3.68，阿昔洛韦TI＝1530.73。
图3为小儿解感颗粒对HSV-1体外抑制作用结果。图3A为病毒对照(100*)，图3B为正常细胞对照(100*)，图3C为阿昔洛韦对照(100*)，图3D为小儿解感颗粒有效对照组(100*)。
4结论
单纯疱疹是一种由单纯疱疹病毒所致的病毒性皮肤病，中医称为热疮。单纯疱疹病毒在全球广泛分布，人群中感染极为普遍，潜伏和复发感染者较多。患者和带毒者是该病的传染源。病毒可通过皮肤、粘膜的直接接触或性接触途径进入机体。单纯疱疹病毒感染新生儿、儿童和成人，通常分为原发感染和复发感染。小儿解感颗粒治疗单纯疱疹病毒有一定的效果，如能进一步深入研究，小儿解感颗粒将拓展其临床用药范围，其发展前景广阔。
实验3.小儿解感颗粒体外抗流感病毒效果研究
【摘要】目的：研究小儿解感颗粒的体外抗流感病毒作用。方法：采用MDCK(犬肾细胞)培养法检测小儿解感颗粒抗流感病毒作用。结果：小儿解感颗粒可抑制流感病毒的繁殖，治疗指数为14.62。结论：小儿解感颗粒有体外抗流感病毒作用。
1、实验材料
1.1细胞与病毒
MDCK(犬肾细胞)由山东省医学科学院微生物室提供；H1N1(流感病毒)由山东省医学科学院微生物室提供；小儿解感颗粒(山东明仁福瑞达制药股份有限公司，批号：15105057)；利巴韦林(山东鲁抗辰欣药业有限公司，批号：
110602304)
1.2主要仪器
超净工作台(济南隆宏公司)；酶标仪(芬兰雷勃公司产品)；低温高速离心机(贺立氏台式低温离心机)；倒置显微镜(Olympus公司)；高压灭菌锅(济南德强仪器有限公司MJ37600)；纯水机(济南太平玛环保有限公司)；CO2细胞恒温培养箱(美国FOMAS公司)
1.3主要试剂及配置
无血清细胞维持液：改良型RPMI-1640液500mL。
2％细胞维持液：改良型RPMI-1640液500mL，加入10ml新生牛血清(四季青)。
10％1640细胞培养液：改良型RPMI-1640液500mL，加入50mL新生牛血清，双抗2mL，混匀，置4℃冰箱，备用。
双抗：取100WU链霉素溶于5mL蒸馏水中，弃去1mL；将80wu青霉素溶于76mL蒸馏水中，与余4mL链霉素相混匀，0.22微米滤膜过滤除菌，每管1.5mL分装于EP管，置于－20℃冰箱备用。
PBS：HyClone产品
消化液：0.25％Trypsin-EDTA
MTT染色剂：取MTT粉末0.5g，溶于100ml PBS中，0.22微米滤膜过滤除菌，每管1ml分装于EP管，置于－20℃冰箱备用。
脱色剂：DMSO
2、实验方法
2.1细胞的复苏及培养
MDCK细胞冻存管从-80℃超低温冰箱取出，立即投入37℃～42℃温水中融化(遵循慢冻速溶原则)，超净工作台内将冻存管中液体移入离心管中，800r/min，5min，弃冻存液，加入5mL浓度10％的1640细胞培养液轻轻将下层沉淀细胞吹打混匀，用移液管转移到培养瓶内，在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。待细胞长成单层后进行传代。
2.2病毒的扩增
将流感病毒毒种1mL与0.25％胰酶25μl混匀，放于37℃、5％CO2恒温培养箱内作用1h，接种于己经长成单层的MDCK细胞上，再在恒温培养箱内作用1h后，加无血清1640维持液5mL置37℃、5％CO2病毒培养箱中培养，并设细胞对照，逐日观察。待细胞出现90％以上的病变时，反复冻融3次，用吸管轻轻吹打，1000r/min，5min，取上清液定量分装于冻存管中，封口膜封口，放于－80℃冰箱冻存备用。
2.3病毒毒力的测定
将病毒用无血清1640维持液做10倍比系列稀释不同浓度，纵向重复4孔，依次接种于己长成单层的MDCK细胞的96孔板中，同时设细胞对照。37℃、5％CO2病毒培养箱中培养，倒置显微镜下观察3-4天，加5mg/ml MTT 10ul，37℃、5％CO2培养箱中4小时，吸弃染液，加DMSO 100ul，室温脱色10min，用酶标仪在490nm波长测定OD值。根据Reed-Muench公式计算病毒液的半数感染浓度TCID50。
细胞存活率＝各组OD值/正常细胞OD值×100％
细胞病变率＝1－细胞存活率
细胞比距＝(高于50％病变率－50％)/(高于50％病变率－低于50％病变率)×100％
TCID5o＝Antilg(Ig高于50％CPE百分率病毒稀释度+比距×稀释对数间的差)2.4药物对细胞毒性测定
将小儿解感颗粒用1640维持液按二倍比稀释10个浓度梯度，依次接种于己经长成单层的MDCK细胞的96孔板中，并设3个复孔，空白对照孔及细胞对照孔；37℃、5％CO2培养箱中培养，24h后观察细胞病变程度，计算药物的最大无毒浓度。细胞出现病变者判为药物毒性，MTT染色，用酶标仪在490nm波长测定OD值，应用Reed-Muench公式计算药物半数中毒浓度(TC50)，并确定最小无毒浓度(TC0)。
TC50＝[Antilog(log高于50％CPE百分率药物稀释度-比距)]×C
2.5小儿解感颗粒抗H1N1病毒实验
小儿解感颗粒从无毒浓度起用1640二倍比系列稀释10个浓度，每孔100ul接种于已长成单层MDCK细胞的96板孔中，每孔再加入100ul H1N1病毒液，同时设利巴韦林阳性对照组、病毒对照组及空白细胞对照组，每组3个复孔。5％CO2培养箱中培养，观察细胞病变，待病毒对照出现90％以上的病变时，MTT染色，并用酶标仪在490nm波长测定OD值。应用Reed-Muench方法计算药物半数有效浓度(EC50)和治疗指数(TI)。
EC50＝[Antilog(log高于50％CPE百分率药物稀释度的值-比距)]×C
TI＝半数毒性浓度(TC50)/半数有效浓度(EC50)
3、实验结果
3.1H1N1病毒毒力测定结果
应用Reed-Muench方法计算H1N1病毒TCID50为10-2.08。实验时用100个TCID50作为病毒液浓度，因此将病毒原液用于实验。
3.2小儿解感颗粒对MDCK细胞毒性测定结果
小儿解感颗粒MDCK的细胞毒性在加入药物12小时后完全显现，此时病毒组还未出现病变，48小时候药物组与病毒对照开始出现病变，72小时病毒对照组90％以上细胞病变。表现为细胞出现空泡，细胞聚集成网状或树枝状，折光性降低，细胞脱落。正常对照组细胞排列紧密，胞浆清晰，细胞壁完整，培养液清澈。小儿解感颗粒TC50＝3.03mg/ml。图4为小儿解感颗粒对MDCK细胞毒性测定结果。图4A为正常MDCK细胞(200*)，图4B为药物毒性细胞(100*)。
3.3小儿解感颗粒对H1N1体外抑制作用
每日观察细胞病变情况，病毒感染24小时后病毒组开始出现病变，药物组也开始显现病变，细胞在无毒浓度范围内随着药物浓度的降低，H1N1感染细胞表现明显，细胞间出现空斑、细胞破碎、脱落，72小时病毒对照组90％病变，药物组几个浓度梯度孔被完全保护，细胞生长良好,小儿解感颗粒TI＝14.62。
图5为小儿解感颗粒对H1N1体外抑制作用结果。图5A为病毒对照(100*)，图5B为正常细胞对照(100*)，图5C为利巴韦林对照(100*)，图5D为小儿解感颗粒有效对照组(100*)。
4小结与讨论
H1N1是一种RNA病毒，属于正黏液病毒科。它的宿主是犬科动物、鸟类和一些哺乳动物。经过鸟类和犬科动物为主的哺乳动物的传播和变异，这可能导致疫情或人类流感大面积传播。2009年初全球爆发了新型甲型H1N1流感，而且至今仍在流行。虽然到目前为止该疾病病情温和，但新型甲型H1N1流感病毒传染性强，人群因对这个新型病毒缺乏免疫力而普遍易感，导致疾病在短时间内迅速播散至全球大流行。
小儿解感颗粒外对流感病毒具有一定的抑制效果。如能进一步深入研究，将拓展小儿解感颗粒的临床用药范围，其发展前景广阔。
实验4.小儿解感颗粒体内抗流感病毒效果研究
【摘要】目的：研究小儿解感颗粒的体内抗流感病毒作用。方法：采用甲型H1N1流感病毒滴鼻感染小鼠造成肺炎模型，治疗给药后计算肺指数、死亡率、死亡保护率、平均存活天数等观察小儿解感颗粒体内抗流感病毒作用。结果：小儿解感颗粒降低了病毒性肺炎小鼠死亡率，延长了存活天数。结论：小儿解感颗粒有体内抗流感病毒作用。
1、实验材料
1.1动物与病毒
动物ICR小鼠(SPF/VAF级)，体重(14±1)g，雌雄不限。由实验动物公司提供。H1N1(流感病毒)由山东省医学科学院微生物室提供；小儿解感颗粒(山东明仁福瑞达制药股份有限公司，批号：15105057)；利巴韦林(山东鲁抗辰欣药业有限公司，批号：110602304)
1.2主要仪器
超净工作台(济南隆宏公司)；酶标仪(芬兰雷勃公司产品)；低温高速离心机(贺立氏台式低温离心机)；倒置显微镜(Olympus公司)；高压灭菌锅(济南德强仪器有限公司MJ37600)；纯水机(济南太平玛环保有限公司)；CO2细胞恒温培养箱(美国FOMAS公司)
1.3主要试剂及配置
小儿解感颗粒灌胃药物配制方法：试验时用0.5％羧甲基纤维素钠(CMC)溶液配制
2、实验方法
2.1体内试验剂量设计
小儿解感颗粒临床剂量按照四至六岁(体重平均约18kg)，一次2克，一日三次计算，300mg·kg-1·d-1。小鼠试验用量分别相当于小儿临床用药量的2倍、等倍、1/2倍；利巴韦林临床用量为10-15mg·kg-1·d-1。
2.2治疗给药对流感病毒感染小鼠肺炎模型的影响
小鼠分别按照正常组、病毒对照组、利巴韦林组、小儿解感颗粒组高、中、低三个剂量组。每组10只。除了正常对照组外，将小鼠用乙醚轻度麻醉，以15个LD50流感病毒液滴鼻感染，每只35μL。感染当天开始给药，正常组和病毒对照组同等条件灌胃给予0.5％CMC。第5天称体重后解剖称肺重，计算肺指数及肺指数抑制率。
肺指数＝肺湿质量(g)/体重(g)；
肺指数抑制率＝病毒对照组肺质量-实验组肺质量/病毒对照组肺质量-正常对照组肺质量×100％。
2.3治疗给药对流感病毒感染小鼠肺炎模型的死亡保护作用
小鼠随机分为病毒对照组、利巴韦林组、小儿解感颗粒高、中、低三个剂量组，每组15只。以2个LD50流感病毒液滴鼻感染，每只35μL。感染当天开始给药，连续4d。观察感染后2周内动物的死亡情况，计算死亡率、死亡保护率、平均存活天数和生命延长率。
死亡率＝死亡数/动物总数。
死亡保护率＝病毒对照组死亡率-试验组死亡率/病毒对照组死亡率×100％。
生命延长率＝试验组存活天数-病毒对照组存活天数/病毒对照组存活天数×100％。
3、实验结果
3.1小儿解感颗粒给药对流感病毒感染小鼠肺炎模型的作用
流感病毒感染小鼠后，病毒对照组肺指数明显增高。与正常对照组相比有显著差异，用小儿解感颗粒进行治疗给药后，给药3个不同剂量组肺指数均有不同程度降低，与模型组相比较有显著性差异。结果如表2所示。
表2小儿解感颗粒治疗给药对流感病毒感染小鼠肺炎的抑制作用(
Figure BDA0001584370930000151
n＝10)
Figure BDA0001584370930000152
3.2治疗给药对流感病毒感染小鼠肺炎模型的死亡保护作用
流感病毒感染正常小鼠2周内，病毒对照组动物死亡率大于90％，平均存活天数9.15天，治疗性给药后，3个剂量组死亡数均有一定程度的降低，高、中、低剂量组均能明显延长感染小鼠存活天数。结果见表3所示。
表3小儿解感颗粒治疗给药对流感病毒感染小鼠肺炎模型的死亡保护作用
Figure BDA0001584370930000153
Figure BDA0001584370930000154
Figure BDA0001584370930000161
4小结与讨论
H1N1是一种RNA病毒，属于正黏液病毒科。它的宿主是犬科动物、鸟类和一些哺乳动物。经过鸟类和犬科动物为主的哺乳动物的传播和变异，这可能导致疫情或人类流感大面积传播。2009年初全球爆发了新型甲型H1N1流感，而且至今仍在流行。自2017年秋冬大规模爆发的流感，虽然主要是乙型流感，但甲型H1N1流感病毒极有可能成为替代乙型流感大肆传播的病毒类型。目前，人群因对这个病毒缺乏免疫力而普遍易感，将导致疾病在短时间内迅速播散至全球大流行。
本研究中发现采用甲型H1N1流感病毒感染正常小鼠后肺指数明显增高，较正常对照组有显著差异，感染小鼠2周内，病毒对照组动物死亡率大于90％，平均存活天数为9天，给予小儿解感颗粒治疗后能明显降低流感病毒感染后小鼠的肺指数，对小鼠肺部炎症有明显治疗作用，与模型对照组比较有显著性差异，降低了病毒性肺炎小鼠死亡率，延长了存活天数。
综合体内外研究结果，小儿解感颗粒对甲型H1N1病毒具有较好的疗效，不仅体外对其有明显的抑制作用，在体内治疗性给药也可明显降低动物死亡率和延长存活天数。小儿解感颗粒外临床抗流感病毒的机制还有待进一步研究，具有较好的应用发展前景。

Claims (1)

1.小儿解感颗粒在制备抗病毒药物中的应用，所述病毒为呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒1型和甲型H1N1流感病毒。
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