CN102286432B - 建立ca16病毒感染动物模型的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明成功筛选了适于建立CA16动物感染模型的病毒株VR18，并利用VR18病毒株感染乳鼠建立了CA16病毒感染的动物模型，同时本发明也涉及建立CA16动物感染模型的方法，所用的试剂盒，以及病毒株VR18在建立CA16动物感染模型中的用途等。本发明为CA16疫苗的研发提供了宝贵的实验资料。

Description

建立CA16病毒感染动物模型的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒学和免疫学技术领域，具体是涉及用于建立CA16病毒感染动物模型的病毒株、方法以及试剂盒等。

背景技术

柯萨奇病毒(Coxsackievirus，CV)属于小核糖核酸(RibonucleicAcid，RNA)病毒科(Picornaviridae)，肠道病毒属(Enterovirus)，是多种人类疾病的致病病原，致病谱广，可引起呼吸道感染、结膜炎、发热性皮疹、疱疹性咽峡炎、心肌炎、心肌病及无菌性脑膜炎、脑炎和急性弛缓性麻痹等疾病，CV不同于其他肠道病毒，自1948年Dalldorf首次在纽约成功分离时，即发现该病毒对新生小鼠具有很高的敏感性，根据病毒对乳鼠的致病力将其划分成A、B两组，共30个血清型。

CA16是人类最早发现的柯萨奇病毒A组病毒成员之一，为20面立体对称球形颗粒，直径约23～30nm，无包膜和突起，由衣壳和核酸组成。核酸为单股正链RNA，全长约7410个核苷酸，包含1个开放读码框架(Open Reading Frame，ORF)，可分为P1、P2、P3三个区，其中P2、P3区编码非结构蛋白；P1区编码病毒的结构蛋白VP1～VP4，该4个结构蛋白组成一个亚单位，60个亚单位组成病毒衣壳。

CA16可引起5岁以下婴幼儿手足口部疱疹，是除肠道病毒71型(EV71)以外的另一个导致手足口病(Hand，Foot and MouthDiszease，HFMD)的主要病原体。与EV71相比，CA16引起的HFMD多数症状较轻，不需特殊干预可自行痊愈，但在各地的流行中也不断出现少数CA16引发重症脑炎甚至引发死亡的报道。近几年亚洲地区HFMD发病和死亡人数的快速增长，经流行病调查显示多数流行呈EV71和CA16共同流行或交替流行的态势。由于EV71是引起重症HFMD的主要病原体，EV71疫苗和治疗药物的研究在国家多方面的重点支持下得到了快速的发展，而CA16疫苗和治疗药物的研究相对滞后，急需更多关注，以配合EV71防治工作共同构筑有效的HFMD防控体系。

理想的病毒性疾病动物模型是研究病毒在体内的入侵、复制、传导、致病、转归等机理以及评价疫苗预防效果和药物疗效等的重要工具，虽然50年代就已明确CA16可引起新生乳鼠出现全身性肌炎而导致死亡，但至今尚无CA16动物模型成功建立和应用的报道，成功的动物模型已成为直接影响疫苗保护效果评价和药物筛选的主要瓶颈。

发明内容

本发明成功筛选了适于建立CA16动物感染模型的病毒株，建立了稳定、有效的CA16感染乳鼠动物模型，为CA16防治疫苗和药物的研发奠定了基础。

具体地，本发明以21例2008年北京地区HFMD患儿的临床样本为研究对象，经vero细胞连续传代获得可稳定复制的病毒株一株，命名为VR18。对VR18采用终末稀释法进行2次噬斑纯化获得纯化病毒VR18-8ac。经WHO分发的肠道病毒组合血清检测，该病毒只能被CA16血清中和证实为CA16病毒，经全基因序列检测，VR18的基因全长为7410nt，构建VP1区进化树显示VR18为CA16病毒C1亚型，VR18-8ac的基因全长测序结果如序列表中SEQ ID NO：1所示。经挑选50个克隆，分别进行VP1区PCR扩增后基因序列检测，证实全部克隆均为VR18病毒。经外源因子检测，证实该病毒株无其他外源因子污染。经生物学特性分析，该病毒株病毒滴度为6.175lgCCID50/ml，在VERO细胞上可形成明显噬斑，噬斑滴度为5.984lgPFU/ml。

本发明从临床样本中成功分离纯化了用于建立CA16病毒感染动物模型的CA16C1亚型病毒株VR18。其中经vero细胞连续传代获得的病毒株VR18，第四代VR18，经连续2代噬斑纯化的VR18和经1代鼠脑纯化的VR18均于保藏日期在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京)进行了生物保藏，分别为：柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A Group 16type)，株：VR18，保藏号：CGMCC No.4851；柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A Group 16type)，株：VR18-4，保藏号：CGMCC No.4852；柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A Group 16type)，株：VR18-8ac，保藏号：CGMCC No.4853；柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A Group 16type)，株：VR18-J，保藏号：CGMCC No.4854。并且申请人已经提供了上述生物材料的保藏证明和存活证明。

除了上述进行生物保藏的VR18病毒株，由VR18病毒株连续传代，同时能够用于建立CA16病毒感染动物模型的病毒株，也是本发明保护的范围。一般来说，本发明涉及能够用于建立CA16病毒感染动物模型，并且基因序列与SEQ ID NO：1具有90％以上，95％以上，98％以上和99％以上同源性的CA16病毒株。本发明也涉及基因序列为由SEQ ID NO：1进行一个或几个核苷酸取代，并能用于建立CA16病毒感染动物模型的CA16病毒株。

本发明成功建立了一种CA16病毒感染动物模型的制备方法，其步骤包括使用上述CA16病毒株感染乳鼠。

本发明还涉及上述CA16病毒株在建立CA16病毒感染动物模型中的用途。

另外，本发明也涉及一种用于建立CA16病毒感染动物模型的试剂盒，所述试剂盒含有上述CA16病毒株。

在CA16动物模型的建立中，分别使用了不同代次和不同纯化方法的V18病毒株，包括VR18(CGMCC No.4851)，V18-4(CGMCC No.4852)，经连续2代噬斑纯化的VR18-8ac(CGMCC No.4853)和经1代鼠脑纯化的VR18-J(CGMCC No.4854)。结果显示不同代次的VR18和不同纯化方式获得的VR18(细胞培养噬斑纯化、鼠脑分离纯化)均可使模型动物出现不同程度的发病及死亡。根据病毒毒力和病毒纯度，优选VR18-8ac病毒株建立CA16动物感染模型。

本发明分别采用颅内、腹腔、口服方式感染1日龄以内新生ICR乳鼠。结果显示3种感染方式均不同程度使模型动物发病和死亡，其中颅内和腹腔方式均可在感染后短期内导致100％的死亡率。由于对于1日龄乳鼠颅内接种较腹腔接种更易操作，因此优选颅内接种方式构建CA16感染模型。

本发明使用病毒株分别接种新生1、3、5、7、14日龄的ICR小鼠。结果表明新生1-5日龄的ICR小鼠全部出现发病和死亡，发病和死亡时间随小鼠日龄的增长而延长；而对7日龄小鼠随可使其100％发病，但部分小鼠发病后逐渐恢复，病死率为67％；14-21日龄小鼠则不出现发病和死亡。因此感染乳鼠的日龄可以是1-7日，优选为1日龄。

本发明分别对VR18-8ac从1：16-1：524288进行8倍系列稀释后进行毒力研究，结果表明该模型临床症状鲜明、重现性良好，同时表现出明显的剂量依赖性、动物日龄依赖性。

本发明建立的CA16动物模型，所用攻击病毒背景清晰、无外源因子污染、攻毒后实验动物临床症状清晰、典型，重复性好、同时具有良好的剂量依赖性。通过应用研究显示，主动免疫CA16灭活病毒和被动免疫高效价CA16中和抗体均可保护实验动物免受致死量病毒攻击，可用于今后CA16疫苗或药物的免疫保护或疗效研究。

附图说明

图1不同代次、不同纯化方式CA16的乳鼠敏感性比较

图21000LD₅₀剂量CA16病毒感染乳鼠的发病和死亡情况

图3100LD₅₀剂量CA16病毒感染乳鼠的发病及死亡情况

图4CA16中和抗体保护试验

图5CA16灭活病毒免疫保护试验

生物材料保藏

菌种名称：柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A Group 16type)，株：VR18，保藏号：CGMCC No.4851；保藏日期：2011年5月11日，保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)；

菌种名称：柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A Group 16type)，株：VR18-4，保藏号：CGMCC No.4852；保藏日期：2011年5月11日，保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)；

菌种名称：柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A Group 16type)，株：VR18-8ac，保藏号：CGMCC No.4853；保藏日期：2011年5月11日，保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)；

菌种名称：柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A Group 16type)，株：VR18-J，保藏号：CGMCC No.4854，保藏日期：2011年5月11日，保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)；。

具体实施方式

实施例1CA16病毒的选择

根据文献报道，CA病毒通过颅内感染方式可使1日龄以内的新生乳鼠出现全身性肌炎而死亡，因此本研究选用1日龄ICR乳鼠作为模型动物，分别对相同剂量的不同代次的VR18(VR18、VR18-4)、经连续2代噬斑纯化VR18(VR18-8ac)和经1代鼠脑纯化VR18(VR18-J)进行颅内感染研究，结果VR18-4、VR18-8ac、VR18-J均使模型动物在感染后4d出现后肢麻痹，感染后5d全部死亡。而VR18感染动物症状相对较轻，在感染后4d陆续开始出现后肢麻痹，至感染后14d除2只动物发病后逐渐恢复外其余6只全部死亡，死亡率为75％(见图1)。结果显示不同代次VR18和不同纯化方式获得的VR18(细胞培养噬斑纯化、鼠脑分离纯化)均可使模型动物出现不同程度的发病及死亡。根据病毒毒力和病毒纯度，优选VR18-8ac采用颅内方式感染1日龄以内新生ICR乳鼠建立CA16动物模型。

实施例2感染方式的选择

用相同剂量VR18-8ac病毒株分别采用颅内、腹腔、口服方式感染1日龄以内新生ICR乳鼠。结果三种感染方式的动物死亡率分别为100％、100％、67％；开始发病时间分别为4d、4d和5d；全部死亡时间分别为5d、4d、12d(见表1)。显示3种感染方式均不同程度可使模型动物发病和死亡，其中颅内和腹腔方式均可在感染后短期内导致100％的死亡率。由于对于1日龄乳鼠颅内接种较腹腔接种更易操作，因此优选颅内接种构建CA16感染模型。

表1不同感染方式的比较

实施例3乳鼠日龄的选择

采用颅内感染方式，将相同剂量VR18-8ac病毒株分别接种新生1、3、5、7、14日龄的ICR小鼠。结果从表2可见VR18可使新生1-5日龄的ICR小鼠全部出现发病和死亡，发病和死亡时间随小鼠日龄的增长而延长；而对7日龄小鼠随可使其100％发病，但部分小鼠发病后逐渐恢复，病死率为67％；14-21日龄小鼠则不出现发病和死亡。因此优选1日龄乳鼠构建CA16感染模型。

表2不同感染日龄的比较

实施例4攻毒剂量的确定

为了确定VR18-8ac在本模型中的攻毒剂量，本发明分别对VR18-8ac从1：16-1：524288进行8倍系列稀释后分别进行毒力研究，结果见表3，LD₅₀为65000倍稀释。选择100LD₅₀和1000LD₅₀剂量病毒分别进行3次重复试验(3次重复试验的结果数据分别标记为试验1、试验2、试验3，并以不含病毒剂量的试验作为对照组)，结果见图2、3，显示100LD₅₀剂量可使100％动物在感染后4-13d日出现死亡；1000LD₅₀剂量除一次试验中有10％动物发病后逐渐康复外，其他动物均在感染后12-15d死亡。为了更加客观、细致地反映动物发病情况，我们根据动物发病情况建立了一套动物临床症状分级标准(见表4)，可见100LD₅₀和1000LD₅₀剂量组动物分别于感染后3d和7d后先后出现拒食、体重减轻、四肢颤抖、麻痹和瘫痪等症状后死亡，仅1000LD₅₀剂量组中的1只乳鼠在发病7天后(感染15天后)症状逐渐减轻，最终完全恢复。显示100LD₅₀和1000LD₅₀的VR18通过颅内途径接种1日龄ICR乳鼠可使100％实验动物出现瘦小、四肢颤抖和麻痹等典型症状，病死率可达90％以上，该模型临床症状鲜明、重现性良好，同时表现出明显的剂量依赖性、动物日龄依赖性。

表3不同感染剂量的比较

实施例5CA16中和抗体保护试验

为了解CA16种和抗体的保护能力，将CA16中和抗体(1∶1024)分别用DMEM培养液进行10倍和100倍稀释，将特异性高效价EV71中和抗体(1∶2048)进行10倍稀释后，应用本发明构建的乳鼠模型(VR18-8ac感染模型)，在给予实验动物100LD₅₀剂量VR18-8ac病毒感染的同时，分别用10倍稀释的EV71中和抗体(EV71抗体*10)、10倍和100倍稀释的CA16中和抗体(CA16抗体*10和CA16抗体*100)和DMEM稀释液腹腔注射被感染动物。结果DMEM和EV71中和抗体组分别在病毒感染后2d和4d开始发病，3d至11d间即相继100％死亡；100倍稀释CA16中和抗体组在病毒感染后7d开始发病，8d开始死亡，其中50％动物在出现四肢无力或颤抖等症状后5d逐渐恢复，最终近50％动物死亡；而10倍稀释CA16中和抗体组动物在病毒攻击后的21d观察期内全部建存，健康状态良好(见图4)。研究显示CA16中和抗体可保护新生乳鼠免受致死剂量的CA16病毒攻击，保护能力呈CA16中和抗体含量依赖性，而与CA16具有高度基因同源性的EV71无明显的抗体交叉保护能力。

实施例6母传抗体保护试验

由于本发明构建的乳鼠模型动物感染日龄小，难以进行疫苗等物质的免疫保护研究，为克服这一问题，本研究根据EV71动物模型中母传抗体保护评价模式，利用新生乳鼠携带有其母亲的母传抗体这一特点，采用先免疫母鼠后使其交配、产仔，再攻击其新生乳鼠的方式，评价疫苗等物质诱导母鼠产生的抗体通过垂直传递给新生乳鼠后的保护能力，间接评价疫苗等物质的保护效果。

将CA16标准病毒(G10)灭活后与生理盐水分别免疫ICR雌鼠各一只，免疫当天分别与雄鼠合笼令其交配，14天后两只雌鼠分别采用相应抗原加强免疫一针，待雌鼠生产后24内，记录所生乳鼠健康状况，挑选健康状况良好的乳鼠分别采用100LD₅₀剂量的VR18-8ac病毒进行颅内感染，后每天观察并记录乳鼠情况。结果CA16免疫组所生乳鼠在病毒攻击后3d，50％实验动物逐渐出现消瘦、后肢麻痹等症状，至病毒攻击后14d陆续死亡，另50％动物在21d观察期内健康状况良好，未出现明显临床症状；而对照组在相同条件下，3d即开始出现明显临床症状，并在攻毒8d后全部死亡(见图5)。显示CA16灭活病毒可诱导机体产生保护性抗体，为CA16疫苗的研发提供了宝贵的实验资料。

序列表

<110>中国食品药品检定研究院

<120>建立CA16病毒感染动物模型的方法和试剂盒

<160>33

<170>Patentin version 3.5

<210>1

<212>DNA

<213>VR18病毒株序列

<400>1

TTAAAACAGCCTGTGGGTTGTTCCCACCCAGGGCCCACTGGGCGCTAGCACACTGATTCTACGGGATCTTTGTGCGCCTG

TTTTATAACCCTTCCCCTAAGCAGCAACTTAGAAGCTTTGTACAATCACGACCAGTAGTGGGCGTGGCGGCGCCAGTCAC

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TGAGAAGAAATTGGCTCGAGTTATTT

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AATAGC

Claims (6)

1.一株可以稳定复制和传代的CA16病毒株VR18，其特征在于其保藏号为CGMCCNo.4851；于2011年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.一株可以稳定复制和传代的CA16病毒株VR18-4，保藏号为CGMCCNo.4852；于2011年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

3.一株可以稳定复制和传代的CA16病毒株VR18-8ac,保藏号为CGMCCNo.4853；于2011年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

4.一株可以稳定复制和传代的CA16病毒株VR18-J，保藏号为CGMCCNo.4854；于2011年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

5.一种用于建立CA16病毒感染动物模型的试剂盒，其特征在于包含权利要求1-4中任一所述的CA16病毒株。

6.根据权利要求1-4中任一所述的CA16病毒株在制备用于建立CA16病毒感染动物模型的试剂盒中的用途。

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