CN101897963B - 一种手足口病病毒疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种手足口病病毒疫苗的制备及其应用方法，属于预防人类传染病的新型疫苗，本发明疫苗的主要成分为高度纯化的灭活人肠道病毒71型(EV71)病毒、铝佐剂，采用本发明的方法制备的疫苗具有优良的免疫原性，免疫后可使机体选择性的产生高效价的血清中和抗体，预防人肠道病毒71型引起的传染性疾病。

Description

一种手足口病病毒疫苗

技术领域

本发明属于人用疫苗的技术领域。本发明公开了一种能预防手足口病病毒EV71感染的灭活疫苗的制备及应用方法。

技术背景

手足口病(Hand-foot-mouth disease，HFMD)是肠道病毒引起的儿童期常见传染病之一，多发生于5岁以下的婴幼儿，可引起发热和手足、口腔等部位的皮疹、溃疡，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、脑炎等致命性并发症。可引发手足口病的肠道病毒有20多种，柯萨奇病毒(CoxAsckie virus)A16型(CoxA16)和EV71是最常见的两种。

已知引起手足口病(HFMD)的病毒型别很多，均属于小核糖核酸病毒科(Picorna)人肠道病毒属的病毒，其型别有CoxA5、A10、A16、A19型及EV71型和新肠道病毒，最常见的型别为CoxA16及EV71型。有关资料表明，HFMD的病原体经历了较大的变迁。1957年在加拿大流行时首次分离出CoxA16，1959年英国、美国加利福尼亚也发生流行，数年后的报导几乎都是由CoxA16引起HFMD流行。1972年肠道病毒71型(EV 71)在美国被首次确认，此后EV71感染与CoxA16感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。日本从1968-1974年散发HFMD病人仍以CoxA16分离阳性率最高，病原学研究证实日本HFMD的流行是由CoxA16及其变异株和EV71型交替出现造成的，有时也可同时出现，但以其中1个型为主。实验室研究证明，各地分离的CoxA16野病毒与实验室保存的标准毒株在血清学上有一定差异，而每次大流行中分离的病毒株其性状也不完全一致，说明病毒在传播过程中出现了变异。1972-1973年、1986年和1999年澳大利亚均发生过EV71流行，重症病人大多伴有中枢神经系统症状，一些病人还有严重的呼吸系统症状。

20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利相继爆发以中枢神经系统症状为主要临床特征的EV71流行，仅保加利亚就超过750例发病，149人致瘫，44人死亡。英国1994年4季度爆发了一起遍布英格兰威尔士由CoxAl6引起的手足口病流行，监测哨点共观察到952个病例，为该国有记录以来的最大一次。患者大多1-4岁。该国1963年以来的流行病资料数据显示，该病流行的间隔为2-3年。意大利、法国、荷兰、西班牙、罗马尼亚、巴西、加拿大、德国等国家也经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒和EV71引起的手足口病。

20世纪90年代后期，EV71开始肆虐东亚地区。1997年以来，EV71感染为主的手足口病在马来西亚、台湾、新加坡等地大规模爆发流行，并发中枢神经系统症状而导致死亡病例增多，引起世界各国关注和警惕。1997年4-8月马来西亚共有2628例发病，4～6月死亡29例。

1998年EV71感染在我国台湾省引发大量手足口病和疱疹性咽峡炎，在6月和10月两次流行中，共监测到129106例病例，重症病人405例，死亡78例，大多为5岁以下的儿童，并发症包括脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿或肺出血、急性软瘫和心肌炎。

我国大陆地区自1981年在上海始见本病，以后北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、西宁、广东等十几个省市均有报导。

1983年厦门市曾发生手足口病流行，用猴肾细胞等从患者标本中分离出柯萨奇A16病毒。同年天津也发生7000余病例，经过2年散发流行，1986年又出现爆发，在托儿所和幼儿园2次爆发的发病率分别达2.3％和1.9％。1995年3月至9月，丹东地区暴发手足口病，幼儿园中发病较多，家庭中亦有散在发病。门诊患者368例，5月及7月两个发病高峰期，每个高峰期持续半个月左右。此外，1995年中国科学院武汉病毒学研究所从手足口病人中分离出EV71病毒，1998年深圳市卫生防疫站也从手足口病患者中分离出2株EV71病毒。

2000年5--8月山东省招远市暴发了小儿手足口病大流行。在3个多月里，招远市人民医院接诊患儿1698例。其中男1025例，女673例，男女之比为1.5∶1。年龄最小5个月，最大14岁。首例发生于5月10日，7月份达高峰，末例发生于8月28日。128例住院治疗患儿，平均住院天数5.1天。其中3例合并急性心肌炎死亡。

2007年山东省临沂市、济宁市发生大面积的手足口病流行，未波及到全国，2008年3月份安徽阜阳市开始大量出现EV71引起的手足口病病人，累计发病人数4000多人，截至到2008年5月份，全国各省市均有大规模的流行，累计发病人数超过17万人，卫生部于2008年的5月份已将手足口病列为丙类法定上报的传染病，足见手足口病的危害日渐严重，已经引起了我国各级政府的高度重视。

尽管手足口病在我国很多省份及亚洲各国频繁的流行肆虐，但到目前为止仍没有可用于预防该病的疫苗供应。

发明内容

本发明提供一种手足口病病毒疫苗。

该疫苗是由手足口病的主要病毒——人肠道病毒71型的一种病毒株H-9，经灭活后制备而成的。

本发明所使用的人肠道病毒EV71病毒株分离自手足口病病人的粪便标本命名为：人肠道病毒71型，H-9株；该毒株已经在2010年3月10日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，登记编号CGMCC 3650，拉丁名称为：Picornavirus，Human Enterovirus71，经血清学中和试验、RT-PCR试验、及VP1区核酸序列测定证明是EV71病毒。该病毒在人二倍体细胞MRC-5、WI-38及非洲绿猴肾细胞系VERO细胞上能够持续传代培养增殖，接种细胞后约在12小时左右开始出现细胞病变，根据接种病毒量的不同，细胞病变可以在24～96小时之间达到高峰，病变达到高峰时约90％以上的细胞出现病变，此时收获病毒，病毒的滴度可以达到6.5～7.6lgCCID₅₀/ml。

使用H-9株病毒对2007年秋季采集的800多份1-5岁儿童血清样品进行病毒中和试验的结果表明，地处亚热带的我国广西及地处北温带的我国内蒙古北部居民中4-5岁儿童的血清中约90％以上含有EV71病毒中和抗体，说明在4-5岁的儿童中，发生EV71病毒感染十分常见，2-4岁的儿童血清抗体阳性率约60％左右，我国南方、北方儿童血清中和抗体的阳性率无显著性差异，血清中和抗体的几何平均滴度(GMT)也无显著性差异；1-2岁的儿童中EV71病毒血清中和抗体的阳性率则较低，大约只有20％左右。从出生到学龄前阶段，随着儿童年龄的增加，其遭受EV71病毒感染的几率也在增加，2岁至4岁年龄段的儿童发病率最高，至5岁时，儿童血清中EV71病毒中和抗体的阳性率已超过90％。这与近4年来我国各地发生手足口的高发年龄相符。1-5岁健康儿童血清中和H-9病毒株试验的结果表明，我国南北方儿童自然感染的EV71病毒与本发明所使用的H-9株病毒具有相同的中和位点。

本发明的手足口病疫苗是由上述病毒株H-9经灭活后制备而成的，本发明的疫苗，可以以VERO细胞、人胚肺二倍体细胞为细胞基质，大量增殖H-9株病毒后再进行一系列的纯化、灭活工艺等处理步骤而获得的。细胞的培养可以利用转瓶或微载体生物反应器，在细胞传代培养的同时或是稍后一段时间接种EV71病毒，培养到显微镜下观察病变细胞数达到70-85％时，终止细胞培养，收获含病毒的细胞培养液，4℃放置过夜使病毒从细胞内释放到培养液中，高速离心除掉细胞碎片，300KD/500KD超滤膜浓缩病毒液，液相色谱(Sepharose 4FF、Sephacryl S400 HR、DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF，也可以使用其它品牌的分离性能相似的色谱产品)纯化病毒颗粒，加入甲醛或β-丙内酯对病毒进行灭活。测定病毒液中的蛋白含量，调整病毒颗粒的蛋白浓度，加入佐剂，配制成疫苗。将试验疫苗免疫家兔及小鼠，获得免疫血清，该免疫血清能中和从临床手足口病病人中分离的EV71病毒。

本发明还提供一种疫苗配方，每剂人用疫苗中含有：

灭活EV71病毒(按蛋白质计算)       5-50μg

铝佐剂(按Al离子计算)             0.2-1.0mg

硫柳汞(可以不加)                 30-70μg

本发明的优选配方为：

灭活EV71病毒(按蛋白质计算)       5-30μg

铝佐剂(按Al离子计算)             0.2-0.8mg

硫柳汞(可以不加)                 30-70μg

本发明的最优选配方为：

灭活EV71病毒(按蛋白质计算)       10-20μg

铝佐剂(按Al离子计算)    0.2-0.6mg

硫柳汞(可以不加)        30-70μg

本发明的疫苗配方根据需要可以加入注射用溶剂或缓冲溶液按照制剂学常规技术进行配制。

本发明的新疫苗属于安全性极高的灭活病毒疫苗，不会引起疫苗相关病例，最大限度的保证了使用者的安全性。同属于肠道小RNA病毒的脊髓灰质炎病毒Salk灭活疫苗已在欧美国家使用了近50年，已消灭了脊髓灰质炎病例，历史的经验告诉及动物试验的结果表明采用灭活疫苗预防手足口病是可行的。该疫苗的使用可以参照Salk灭活疫苗的使用程序，即1岁之内的儿童基础免疫3次，预计有较好的免疫效果。

与Salk灭活脊髓灰质炎疫苗不同的是本发明的疫苗使用了纳米滤膜过滤及液相色谱等工艺对病毒进行了高度的纯化，疫苗的纯度很高。

与目前广泛使用的狂犬病毒灭活疫苗、日本脑炎病毒灭活疫苗、季节性流行性感冒病毒灭活疫苗等多种灭活病毒疫苗不同，本发明的疫苗必须使用铝佐剂，不使用铝佐剂的EV71病毒疫苗其免疫原性明显低于含铝佐剂的疫苗。

采用本发明所述的方法灭活EV71病毒，并经一系列的步骤纯化、吸附所制备的疫苗免疫原性好，能刺激机体产生高效价的血清中和抗体，免疫后的血清中非中和抗体的产生量远远低于同剂量的未灭活的EV71病毒疫苗。

本领域的研究人员均能认识到，根据本发明所制备的铝佐剂吸附灭活EV71病毒疫苗中，还可以加入目前已知的能显著增强蛋白类抗原免疫原性的各种免疫增强剂，如单磷脂A(MPL)、MF-59、ISCOMs、胞壁酰二肽及其衍生物、BCG多糖等。

附图说明

图1、VERO细胞感染EV71病毒后的照片。

图2、微载体表面培养的VERO细胞感染EV71病毒的显微镜照片。

图3、EV71病毒(H-9株)VP1区序列测定结果

图4、灭活EV71病毒浓缩液Sepharose 4FF柱纯化液相色谱图

图5、精制灭活EV71病毒原液HPLC-TSK5000色谱图

图6、铝佐剂吸附灭活EV71疫苗、非灭活EV71疫苗的血清中和抗体效价

图7、铝佐剂吸附灭活EV71疫苗、非灭活EV71疫苗的EV71-VP1结合抗体效价

具体实施方式

以下我们将通过实施例对本发明进行阐明。

实施例1

EV71病毒的分离及检定

收集手足口病病人粪便标本约1克，加入无菌生理盐水溶液9ml，青霉素钠、链霉素各10mg，三氯甲烷0.1ml，用玻璃棒搅拌10分钟制成混悬液，然后在4℃、10000转/分的条件下离心20分钟，小心吸取离心管中的上清液5ml，用0.2μ的一次性无菌滤膜过滤除菌。

取上述方法获得的无菌滤液1ml，加入到已培养2天的VERO细胞培养瓶中，旋紧瓶盖，置36℃培育，1小时后用无菌吸管吸出细胞培养瓶中的液体，再加入含3％新生牛血清的199培养液，放置在36℃培养箱内继续培养，15小时后细胞开始出现病变，36小时细胞完全病变。取0.1ml病毒液继续在VERO细胞上传代，余下的病毒液放置于-70℃冰箱保存备用。

取病毒液0.1ml，提取病毒RNA，RT-PCR扩增特异性的EV71病毒基因片段及肠道病毒特异性基因片段，扩增产物经3％琼脂糖凝胶电泳，结果显示肠道病毒特异性条带、EV71特异性条带阳性，CoxA16条带阴性，证实为含有EV71病毒。对病毒VP1区的序列进行克隆测定，证明所分离的病毒为C4型EV71病毒。用1∶30的兔抗EV71病毒血清与经1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000稀释后的病毒液在36℃中和反应1小时，再接种VERO细胞，放置在36℃、5％C0₂培养箱中培养，7天后观察结果显示经1∶30稀释的抗血清可以中和经1∶1000以上稀释的病毒(相应的病毒滴度约为500CCID₅₀/50μl、50CCID₅₀/50μl)，正常对照兔血清试验的各稀释度的病毒均出现完全病变。

将该病毒(人肠道病毒71型，H-9株，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记编号CGMCC 3650)在VERO细胞上连续传代至18代，第3-18代的病毒滴度在6.8-7.6lg CCID₅₀/ml之间。

将H-9病毒株(CGMCC 3650)在VERO细胞上连续传代，按照2005年版《中国药典》三部中的相关规定建立H-9株病毒原始种子库、主代种子库、生产用种子库，并将其保存于-70℃冰箱中。

实施例2

病毒的增殖

1、转瓶细胞培养增殖病毒：取生长成单层的VERO细胞(或MRC-5细胞、WI-38细胞)，吸出培养瓶内的培养液，加入0.25％胰酶消化细胞，吸出胰酶溶液，加入199细胞培养液，反复吹打，分散细胞，然后按1∶8-1∶10的比例传代，36℃转瓶培养5-7天后接种EV71病毒，所加入的病毒量以接种病毒后36-48小时致使VERO细胞总数的75-90％出现病变为宜。然后在4℃放置12小时以上，但不应超过48小时，收获病毒。4℃离心(7000-12000转/分)30分钟除去细胞碎片，之后用0.45μ的滤器过滤，收集滤出液，放置在-20℃。对收获的病毒液进行滴度测定，其滴度应不低于6.5lgCCID₅₀/ml。

2、混种法转瓶细胞培养增殖病毒：取生长成单层的VERO细胞(或MRC-5细胞、WI-38细胞)，吸出培养瓶内的培养液，加入0.25％胰酶消化细胞，吸出胰酶溶液，加入199细胞培养液，反复吹打，分散细胞，将细胞浓度调整为约10⁵/ml，加入病毒，36℃转瓶培养4-5天后收获病毒，所加入的病毒量以接种病毒后100-120小时致使VERO细胞出现完全病变为宜。然后在4℃放置12小时以上，但不应超过48小时，收获病毒。4℃离心(7000-12000转/分)30分钟除去细胞碎片，之后用0.45μ的滤器过滤，收集滤出液，放置在-20℃。对收获的病毒液进行滴度测定，其滴度应不低于6.5lgCCID₅₀/ml。

3、发酵罐细胞培养增殖病毒：取生长成单层的VERO细胞(或MRC-5细胞、WI-38细胞)，吸出培养瓶内的培养液，加入0.25％胰酶消化细胞数分钟，吸出胰酶溶液，加入199细胞培养液，反复吹打，分散细胞，将细胞浓度调整为约10⁶/ml，然后转移到含Cytodex^TMl微载体(2-8克/L)及199细胞培养液的细胞培养罐中，细胞培养罐中每毫升液体含VERO细胞5-10万个，维持罐内培养液温度在36±0.5℃、pH 7.0±0.3、DO 20-40％、转速50-100RPM，逐日显微镜检查微载体表面细胞生长情况，当微载体表面细胞覆盖约80％时(约3-4天)，接种病毒毒种，继续培养，24小时后每4小时显微镜镜检1次，观察细胞病变情况，直到约90％的细胞出现病变(约36-48小时)，然后关闭细胞培养罐的温度、PH、DO控制，夹套内通入4℃冷却水降温，维持12-24小时，之后用0.45μ的滤器过滤除掉微载体及细胞碎片，收集滤出液，放置在-20℃。对收获的病毒液进行滴度测定，其滴度应不低于6.5lgCCID₅₀/ml。

实施例3

病毒的灭活及纯化

自4℃或-20℃取出已收获的病毒液，加入1/2500至1/4000的甲醛(或β-丙内酯)，35-37℃灭活72小时(3天)，取样3ml装入经高压蒸汽灭菌的透析袋内，对200倍体积的磷酸盐缓冲液(40mM PBS，pH7.4)透析24小时，期间换透析液2次，除甲醛后的病毒样品接种VERO细胞，培养7天未出现细胞病变，证明在上述条件下可以有效的灭活EV71病毒。

上述已灭活的EV71病毒液，经Pall(或Millipore)公司生产的300KD截流分子量的超滤膜浓缩至原体积的1/5，然后用40mM PBS(含0.3-1.0M NaCl，pH 7.4)恢复到原体积，继续超滤至原体积的1/5，再加入40mM PBS(含0.3-1.0MNaCl，pH 7.4)恢复到原体积，继续超滤到原体积的1/5，如此操作，反复5-7次，最后一次浓缩到原体积的1/10，收集浓缩液。

将浓缩的病毒液通过蠕动泵加到已用40mM PBS(含0.3M NaCl，pH 7.4)平衡好的Sepharose 4Fast Flow(或Sephacryl S 400HR，Φ5×100cm，柱床高度85-90cm)色谱柱上，加样量约100-150ml，然后用40mM PBS(含0.3M NaCl，pH 7.4)流洗，液体流速约500ml/小时，用检测波长为280nm的紫外检测器在线检测流出液的吸光值变化，分段收集第一峰的流出液，HPLC及ELISA试验检测表明第一峰的前2/3部分为灭活的病毒颗粒。之后将收集的病毒样品再经DEAE-Sepharose FF柱纯化，除掉残留的微量细胞核酸污染物，收集含病毒颗粒的洗脱液，然后用0.2μ一次性无菌物热原滤器过滤除菌，即为精制灭活EV71病毒原液，-20℃存放。

精制灭活病毒原液的检定：对已经收获的精制灭活病毒原液进行下列主要指标的检定，以确定所收获的精制灭活病毒原液是否符合相关人用疫苗的标准：

1.蛋白质含量的测定：采用Lowry法测定(2005年版《中国药典》第三部附录)，蛋白含量一般在100μg/ml以上。

2.病毒纯度的检定：HPLC-TSK5000液相色谱柱测定，病毒粒子所对应的色谱峰的位置所占的峰面积不低于90％。SDS-PAGE电泳图谱上可以清晰地看到病毒粒子裂解后VP1蛋白所形成的条带。

3.外源DNA含量的测定：当采用VERO细胞作为基质培养EV71病毒时，应测定精制灭活病毒疫苗原液中宿主DNA的残留含量，采用DNA杂交法进行半定量，每50μg蛋白中宿主细胞DNA的残留量不应高于100pg。

实施例4

手足口病病毒灭活疫苗的配制

1、吸附EV71病毒灭活疫苗的配制

将已纯化的EV71病毒原液的蛋白浓度用磷酸盐缓冲液调整到100μg/ml，以下为配制1000ml疫苗的实例：

EV71病毒原液                      400ml

氢氧化铝佐剂(2.0mg/ml)            500ml

磷酸盐缓冲液(pH7.4)               90ml

硫柳汞溶液(1％，也可以不加)       10ml

按每剂疫苗0.5ml计算，每剂疫苗中含EV71病毒蛋白抗原20μg，氢氧化铝佐剂0.5mg。

2、吸附EV71病毒灭活疫苗的配制

将已纯化的EV71病毒原液的蛋白浓度用磷酸盐缓冲液调整到100μg/ml，以下为配制1000ml含硫柳汞疫苗的实例：

EV71病毒原液                      200ml

氢氧化铝佐剂(2.0mg/ml)            500ml

磷酸盐缓冲液(pH7.4)            290ml

硫柳汞溶液(1％，也可以不加)    10ml

按每剂疫苗0.5ml计算，每剂疫苗中含EV71病毒蛋白抗原10μg，氢氧化铝佐剂0.5mg。

3、EV71病毒灭活疫苗的配制

将已纯化的EV71病毒原液的蛋白浓度用磷酸盐缓冲液调整到100μg/ml，以下为配制1000ml疫苗的实例：

EV71病毒原液                   400ml

磷酸盐缓冲液(pH7.4)            590ml

硫柳汞溶液(1％，也可以不加)    10ml

按每剂疫苗0.5ml计算，每剂疫苗中含EV71病毒蛋白抗原20μg。

实施例5

灭活对EV71病毒免疫原性的影响

试验动物BALB/C小鼠购自北京维通利华试验动物科技有限公司，随机分成5组，每组10只。免疫程序为第0、14、28、42天于小鼠腹腔注射，第1组、第2组采用氢氧化铝吸附的25μg、10μg灭活EV71病毒免疫，第3组、第4组采用氢氧化铝吸附的25μg、10μg未灭活EV71病毒免疫，第5组仅用氢氧化铝佐剂免疫，每只试验小鼠每次免疫注射的试验疫苗中含相同剂量的氢氧化铝佐剂，按Al离子计算约0.3mg，第3次、第4次免疫后7天采集血液，分离血清，-20℃冻存备用。

自-20℃冰箱内取出已免疫的小鼠血清，56℃灭活30分钟；取96孔细胞培养板，除1、7列各孔加入90μl 199培养液外，其他孔内加入199细胞培养液各50μl；各取血清10μl加入到含90μl 199细胞培养液的96孔细胞培养板内，混合均匀，血清起始稀释度为1∶10，每个稀释度做2孔；另取一支8通道可调节移液器，将可调移液器调整为50μl，然后自第1列各孔向第2列各孔移50μl液体，混合均匀后再向第3列转移50μl，依次类推直到第6列各孔，自第6列各孔吸出50μl废弃；第7-12列采用同样的稀释方法稀释；向各孔加入50μlEV71病毒(含100CCID₅₀病毒)；另取一块96孔细胞培养板，进行中和试验用病毒液滴度的测定，将病毒液进行10倍系列的稀释，各稀释度每孔加样100μl，细胞对照孔中加入细胞培养液100μl。微量振荡器上混合30秒钟，然后置36℃培养箱内中和反应1小时。之后每孔加入VERO细胞100μl，微量振荡器上混合30秒钟，置5％CO₂培养箱内36℃培养7天后观察结果。

以基因工程表达的可溶性EV71-VP1纯蛋白包被96孔酶标板(COSTAR，中等吸附能力)，37℃包被2小时，4℃放置过夜，吸出包被液后用磷酸盐缓冲液(含TWEEN-20)洗3遍后，每孔加入2％牛血清白蛋白200μl，37℃封闭1小时；吸出封闭液后用磷酸盐缓冲液(含TWEEN-20)洗涤3遍。加入第4次免疫后的小鼠血清，起始为1∶100，倍比稀释，最高稀释度为1∶102400；之后以1∶100的正常小鼠血清A450/600值的2.1倍作为界值，判定各试验组、对照组小鼠血清的效价。

1、血清中和抗体效价测定结果

BALB/C小鼠经铝佐剂吸附的EV71病毒免疫3次后，各试验组小鼠均产生了较高效价的中和抗体，血清中和抗体阳性率均达到了100％，铝佐剂对照组未产生中和抗体，血清中和抗体阳转率0％；两个经甲醛灭活的EV71病毒试验组产生的血清中和抗体效价较高，GMT达到了400以上，两个剂量组间相比GMT没有显著性的差别；甲醛灭活病毒后产生的血清中和抗体效价显著性的高于未经甲醛灭活组的。

小鼠经第4次免疫后，甲醛灭活EV71病毒组血清中和抗体效价增长约1倍，未灭活组血清抗体效价基本上未增加。另外一个值得关注的结果是甲醛灭活EV71病毒10μg剂量组产生的血清中和抗体效价明显高于25μg剂量组的；甲醛灭活病毒组的血清中和抗体效价明显高于未灭活病毒组。此试验结果表明，甲醛灭活EV71病毒的过程中可能使EV71病毒表面的中和抗原位点暴露的更好，更有利于刺激小鼠体内的免疫系统产生中和抗体，结果见图6。

2、酶联免疫抗体效价测定(EV71-VP1)

EV71-VP1基因工程抗原ELISA试验的结果表明，小鼠经4次免疫之后，血清中产生了较高效价的EV71-VP1结合抗体，尤其是未经甲醛灭活的EV71病毒免疫的小鼠，产生的结合抗体效价很高，明显高于甲醛灭活病毒组小鼠产生的抗体效价。未灭活EV71病毒10μg剂量组产生的EV71-VP1结合抗体的效价最高，明显高于其他几个试验组的血清抗体效价。同剂量的甲醛灭活疫苗与非灭活疫苗相比，血清抗体效价的差别具有显著性，甲醛灭活疫苗的效价较低；两个不同剂量的甲醛灭活疫苗组相比，EV71-VP1结合抗体效价的差别无显著性；两个不同剂量的未灭活疫苗组相比，10μg剂量组产生的EV71-VP1抗体效价显著性的高于25μg剂量组，结果见图7。

对比图6、图7血清中和试验和基因工程EV71-VP1抗体结合试验的结果，可以发现甲醛灭活EV71病毒的过程不止是简单的使病毒丧失感染的过程，它很可能改变了病毒表面蛋白质的立体构象，使病毒表面的中和抗体结合位点(即能刺激机体的免疫系统产生中和抗体的抗原决定簇)更加容易的暴露给机体内的抗原呈递细胞。甲醛灭活EV71病毒疫苗在刺激机体的免疫系统产生高效价的中和抗体的同时也抑制了非中和抗体的产生，因此灭活对EV71病毒疫苗是极为重要的。

实施例6

铝佐剂对灭活EV71病毒疫苗免疫原性的作用

试验动物BALB/C小鼠购自北京维通利华试验动物科技有限公司，随机分成10组，每组5只，依照实施例4所述的方法配制的疫苗，每毫升疫苗中含灭活EV71病毒抗原20μg，对照为氢氧化铝佐剂(1.0mg/ml)。用氢氧化铝佐剂悬液(铝离子含量1mg/ml)将灭活EV71病毒量为20μg/ml的试验疫苗再稀释成含灭活EV71病毒量为10、5、2.5、1.25μg/ml的试验疫苗；用磷酸盐缓冲液将灭活EV71病毒量为20μg/ml的试验疫苗再稀释成含灭活EV71病毒量为10、5、2.5、1.25μg/ml的试验疫苗(不含佐剂组)。

第1-4组动物分别用铝佐剂吸附的10、5、2.5、1.25μg的灭活EV71病毒免疫，第5-8组动物分别用含10、5、2.5、1.25μg灭活EV71病毒免疫，第9组动物为铝佐剂对照组，第10组动物只注射生理盐水。共免疫4次，间隔2周，第2、3、4次免疫后7天采集血液，分离血清后-20℃冻存。

自-20℃冰箱内取出冻存的小鼠血清，56℃灭活30分钟；取96孔细胞培养板，除1、7列各孔加入95μl 199培养液外，其他孔内加入199细胞培养液各50μl；各取血清5μl加入到含95μl 199细胞培养液的96孔细胞培养板内，混合均匀，血清起始稀释度为1∶20，每个稀释度做2孔；另取一支8通道可调节移液器，将可调移液器调整为50μl，然后自第1列各孔向第2列各孔移50μl液体，混合均匀后再向第3列转移50μl，依次类推直到第6列各孔，自第6列各孔吸出50μl废弃；第7-12列采用同样的稀释方法稀释；向各孔加入50μlEV71病毒(含100CCID₅₀病毒)；另取一块96孔细胞培养板，进行中和试验用病毒液滴度的测定，将病毒液进行10倍系列的稀释，各稀释度每孔加样100μl，细胞对照孔中加入细胞培养液100μl。微量振荡器上混合30秒钟，然后置36℃培养箱内中和反应1小时。之后每孔加入VERO细胞100μl，微量振荡器上混合30秒钟，置5％CO₂培养箱内36℃培养7天后观察结果。

以基因工程表达的可溶性EV71-VP1纯蛋白包被96孔酶标板(COSTAR，中等吸附能力)，37℃包被2小时，4℃放置过夜，吸出包被液后用磷酸盐缓冲液(含TWEEN-20)洗3遍后，每孔加入2％牛血清白蛋白200μl，37℃封闭1小时；吸出封闭液后用磷酸盐缓冲液(含TWEEN-20)洗涤3遍。加入1∶100稀释的免疫小鼠血清，倍比稀释至1∶25600；之后以1/100的正常小鼠血清A450/600值的2.1倍作为界值，判定各试验组、对照组小鼠血清的效价。

血清中和试验的检测结果见表1，检测的数据表明不使用铝佐剂的各试验组小鼠经第4次免疫后血清中和EV71病毒的抗体效价与第3次免疫后的相比，基本上无明显的改变，各试验剂量组间的差别也很小；1.25μg的剂量组2、3、4次免疫后中和抗体GMT基本上无改变；2.5、5、10μg剂量组免疫2、3、4次后的血清中和抗体效价基本一致，且血清中和抗体的效价较低。

铝佐剂吸附的灭活EV71病毒免疫的各剂量组，免疫4次后，血清中和抗体效价均较高，各剂量组的GMT均超过了100，对于10μg、5μg的免疫剂量而言，第4次免疫后血清EV71中和抗体GMT增加很少，说明3次免疫已足够。

对比含铝佐剂组、不含铝佐剂组两个高剂量组各次免疫后一周时所检测的中和抗体效价，我们可以看出，最初的两次免疫后，不含铝佐剂组与含铝佐剂组相比，中和抗体GMT无差别，尽管不含铝佐剂组的GMT稍高一些，但没有显著性的差别；第3次免疫后，铝佐剂吸附的EV71病毒疫苗组血清中和抗体效价激增，10μg剂量组较之前增长15倍，5μg剂量组较之前增长21倍以上，中和抗体效价增加十分明显，而同剂量的不含佐剂的单纯EV71灭活病毒组的小鼠血清中和抗体效价GMT仅仅增加1倍。

表1的结果显示出以5、10μg灭活EV71病毒铝佐剂吸附物免疫小鼠是可行的；而剂量(2.5、1.25μg)更低的铝佐剂吸附疫苗试验组，需要根多次数的加强免疫，第4次免疫能显著的提高血清中和抗体的效价，第4次免疫后的血清抗体效价(GMT)较第3次免疫后可增加2.5～3.5倍。对于EV71病毒疫苗而言，铝佐剂吸附对灭活EV71疫苗的免疫原性提高是毋庸置疑的，它可以极大地提高灭活EV71病毒的免疫原性。

表1、灭活EV71病毒免疫BALB/C小鼠2、3、4次后血清中和抗体效价的变化情况

第2、3、4次免疫后小鼠血清中EV71-VP1抗体检测的结果见表2，酶联免疫检测所使用的为基因工程重组VP1抗原，为大肠杆菌的表达产物，无糖基化。所检测的抗体为无中和病毒活性的抗体。从EV71-VP1抗原ELISA测定的的结果可以看出，免疫2次后小鼠血清中EV71-VP1抗体的效价仍然较低，疫苗中铝佐剂的有无与抗体效价的关系不大，同等剂量的灭活EV71病毒含铝佐剂与否GMT无显著的差别，但两个高剂量组的GMT明显高于两个低剂量组的GMT；3次免疫后1周，含铝佐剂的两个高剂量组(10μg、5μg)的GMT明显高于其它各组的GMT，且明显高于2次免疫后的GMT，10μg、5μg剂量组的GMT分别较免疫前增高14和28倍，4次免疫后，两个高剂量组GMT未再增加，两个低剂量组有增高，但增长幅度不大。

不含铝佐剂的两个高剂量组(10μg、5μg)3次免疫后抗体滴度有轻微的增加，增长幅度约1倍，4次免疫后血清抗体效价GMT未再继续增加；两个低剂量组血清抗体GMT增加的不明显。

ELISA试验测定的结果所反映的趋势与血清中和抗体试验的结果趋势是一致的；第4次免疫后铝佐剂吸附的两个高剂量组的抗体效价未能进一步的提高，但两个低剂量组的抗体效价仍保持了同样的增长幅度。

表2、BALB/C小鼠免疫2、3、4次后血清EV71-VP1抗体效价的变化情况

Claims (4)

1.一种手足口病病毒疫苗，其特征在于，由保藏编号为CGMCC：3650的人肠道病毒71型H-9病毒株(Picornavirus，Human Enterovirus 71)经过灭活后制备而成，每人用剂量的疫苗含纯化的灭活EV71病毒10～20μg，铝佐剂0.2～0.6mg。

2.权利要求1的疫苗，其特征在于，所述病毒株经过感染细胞、培养、收集病毒液、灭活、分离、纯化步骤，制备出纯的病毒原液，进一步制备成疫苗。

3.权利要求1-2任一所述疫苗在制备预防人肠道病毒71型的感染的药物中应用。

4.一种制备权利要求1手足口病病毒疫苗的病毒毒株，其特征在于，为保藏编号为CGMCC：3650的人肠道病毒71型H-9病毒株(Picornavirus，HumanEnterovirus 71)。

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