CN1712068A - 二倍体细胞狂犬疫苗及纯化狂犬疫苗，剂型冻干及水针 - Google Patents

Abstract

本发明涉及二倍体细胞狂犬病纯化疫苗，其剂型为冻干注射剂及水针剂，该疫苗是在人用二倍体细胞上接种狂犬病毒毒种得到的狂犬病纯化疫苗。

Description

二倍体细胞狂犬疫苗及纯化狂犬疫苗，剂型冻干及水针

技术领域：

本发明涉及一种狂犬病纯化疫苗，特别是在人用二倍体细胞上接种狂犬病毒毒种得到的狂犬病纯化疫苗。

背景技术：

目前世界大量生产的狂犬疫苗有四种：第一种以美国为代表的二倍体细胞，经过浓缩超离制备的狂犬疫苗；第二种以法国为代表的Vero细胞为培养基质的，生产冻干灭活疫苗，但不能保证细胞基质的致瘤和细胞的DNA。第三种和第四种以中国为代表的地鼠肾和日本的鸡胚、鸭胚这几种疫苗细胞来源于普通动物无法保证细胞不携带外源因子也不能保证细胞基质的致瘤性和细胞的DNA。

人二倍体细胞疫苗(HDCV)：

1964年Wiktor在Wistar研究所首次描述HDCV，并进一步通过比较度验最终将来源于Semple疫苗生产用PM狂犬病毒株适应到WI-38人二倍体细胞株(后来又适应到MRC-5细胞株)。培养病毒经澄清、加热和β-丙内酯灭活、冻干制备成疫苗。该疫苗于1974年首次获准生产，并于1978年开始商品化。HDCV不含任何神经毒因子，并不含任何外源动物杂质，因而可以解释它在重复注射后较好的耐受。采用NIH法检测疫苗的稳定性证实，疫苗在4℃和37℃放置一个月后，无明显差异。进一步将5批效价4.3～5.6的疫苗4℃存放3年半，所有批号滴度均大于2.5IU/剂。

早期调查发现，HDCV预防接种后1月或3月达到抗体峰值(10IU左右)，随后便逐渐降低，但1～2年内滴度始终大于0.5IU，通过1～3年内加强免疫后，抗体滴度迅速增加10～15倍，肌肉注射和皮下注射途径相近。

HDCV的问世使人们对传统疫苗免疫原性的评价有了根据。Shah等证实2～4针HDCV接种人体后获得的抗体反应与14针Semple疫苗相当，Cost-Berger通过志愿者分别注射3针HDCV和SMBV，发现前者诱生的抗体反应是后者的5倍。通过HDCV和DEV比较也证实后者仅具有限的效力。Bahmanyar在当时得出的结论是，在人体试验中所使用的任何疫苗的免疫原性都无法和HDCV相比。人二倍体细胞(HDC)为正常核型细胞，无致癌性，并且由于HDCV所具有的高免疫原性和良好的耐受性，目前在美国、加拿大、大多数欧洲国家和几个亚洲国家使用，这使其成为评价任何一种人用新疫苗的标准疫苗。

HDCV的缺点在于HDC不太容易培养，而且狂犬病毒在HDC上培养的病毒滴度相对较低，仅能在空间有限的细胞瓶内培养，这使得疫苗的价格非常昂贵。在美国，用HDCV暴露后处理一个疗程费用高达一千多美元；而在巴基斯坦，用Semple疫苗进行全疗程处理只需2.5美元，这样就限制了该疫苗在发展中国家的使用。同时用该方法制备狂犬病疫苗的详细描述未见报道。由于狂犬病疫苗的特殊性和复杂性，制备该疫苗具有相当的难度，特别是在分离和纯化方面。原代细胞培养疫苗：

地鼠肾细胞疫苗(PHKCV)：用地鼠肾细胞组织培养狂犬病毒发展灭活疫苗首先由Kissling提出并由Fenje进一步发展，将SAD狂犬病毒固定毒适应到地鼠肾细胞(PHKC)上生产灭活的疫苗，并获得成功。1968年该疫苗在加拿大批准用于人体加强和暴露前接种。

我国的PHKCV由卫生部武汉生物制品研究所林放涛领导的小组研制而成。开始实验所用毒种为北京株兔脑固定毒，经″混合细胞培养法″在PHKC上适应，连续传50～60代适应成功；再经豚鼠脑和PHKC交替3次传代的毒株称为aG株。aG株病毒在PHKC上培养收获，福尔马林灭活，加Al(OH)₃佐剂。疫苗规定效价为1.3～2.5IU，经超滤浓缩后，浓缩疫苗效价须≥2.5IU。经临床试验证明，各种剂型的PHKCV在人体中的抗体反应均优于羊脑Semple疫苗。

该疫苗于1980年在我国获得国家卫生部批准的生产文号，取代Semple疫苗。在过去的十多年里，我国生产的PHKCV是世界上累计生产量最大的狂犬病疫苗，高峰年份每年此类疫苗的产销量超过500万人份。目前，我国各生产单位正逐步采用改进的浓缩-精制PHKCV。

鸡胚细胞疫苗：Kando 1965年将Flay HEP株适应到鸡胚细胞，培养病毒经β-丙内酯灭活、浓缩、冻干(后采用区带离心纯化加以改进)制备成疫苗并在日本商品化生产。1983年Barth等从上述日本疫苗分化出一种用Flary LEP株适应到鸡胚细胞上的纯化鸡胚细胞疫苗(PCECV)。培养病毒采用β-丙内酯灭活、并经蔗糖梯度区带离心纯化和浓缩。该疫苗目前由德国Chiro Behring GmbH公司生产。人体暴露前后的临床试验结果表明，疫苗的免疫效果和HDCV相当，并且不会诱生针对鸡细胞蛋白的抗体，使用该疫苗仅产生轻微的局部反应。PCECV现已在欧、亚、非、南美20多个国家获准使用。1997年10月FDA批准该疫苗进入美国市场。

上述原代细胞培养疫苗具有的一个优点是不必冷冻保存细胞种。但每批疫苗检查培养器官源的杂质(细菌、支原体、病毒)，并且动物器官的可用量是限制工业化生产的因素。

传代细胞系疫苗：

Vero细胞疫苗：1984年由法国Merieun研究所研制成功。制备过程中采用了使细胞贴附在微载体上悬浮培养的微载体技术以便进行工业化大罐培养。该疫苗使用的病毒株与HDCV相同，为PM1503-3M。收获的病毒经超滤浓缩、密度梯度离心、β-丙内酯灭活制成冻干疫苗。早期研究证实，在100个接种的实验动物体内没有肿瘤和转移，每剂疫苗的残余细胞DNA量小于50pg，疫苗的稳定性极好，和HDCV相似。80年代和最近的大量实验证实无论用作暴露前人体免疫或暴露后处理，Vero疫苗均获得很好的免疫效果。

由于该疫苗进口价相对较高，因此，我国从1995年开始进行色谱纯化的人用Vero细胞疫苗的研制。制备过程中使用的病毒株是适应到Vero细胞的狂犬病毒(CTN-1V)。目前已有包括卫生部上海生物制品研究所在内的多家生物制品研究所研制成功，并得到生产文号，以逐步取代我国现行的PHKCV。

Vero细胞较HDC能生产较高的狂犬病毒滴度，并可利用微载体技术进行工业化大罐培养，因而其价格较HDCV便宜。目前使用Vero细胞已累积生产1亿剂脊髓灰质炎疫苗，2000万剂狂犬病疫苗和100万剂口服脊髓灰质炎疫苗，证实该细胞疫苗的安全性。但是用Vero细胞制备疫苗须在低细胞代数使用以确保无致瘤性，且残余细胞DNA量须小于100pg/剂。

在发展中国家常常发生停电或难以保证液氮供应，保存细胞种源比较困难。因而限制了这种疫苗的使用，发展新型的人用狂犬病疫苗以降低成本，特别是找到难以解决的纯化工艺，是一项重要课题，本发明经过研究，找到了一种在人用二倍体细胞上接种狂犬病毒毒种得到的狂犬病纯化疫苗，这些人用二倍体细胞是WI-38、CCC-HPF-1P5、MRC-5，所得到的疫苗，价格低廉，使用方便，纯度高，适合大规模生产和大规模应用。

发明内容：

本发明提供一种人用二倍体细胞狂犬病纯化疫苗，该疫苗是在人用二倍体细胞上接种狂犬病毒毒种得到的狂犬病纯化疫苗。

本发明还提供本发明的狂犬病纯化疫苗的制备方法及其应用。

本发明采用的人用二倍体细胞是WI-38、CCC-HPF-1P5、MRC-5，优选的是WI-38。经过全面的研究鉴定，WI-38、CCC-HPF-1P5、MRC-5细胞具有胞核学稳定，没有外源因子污染和致瘤性对病毒敏感的优点，符合中国药典2005版关于生物制品的传代细胞的规程要求。

本发明提供一种人用二倍体细胞狂犬病纯化疫苗，该疫苗是在人用二倍体细胞上接种狂犬病毒种，经分离纯化得到的狂犬疫苗。所述疫苗病毒毒种选自狂犬毒种SNK-CTN株或SNK-aG株，优选的是SNK-CTN株。本发明的疫苗是冻干注射剂或水针剂。

本发明的纯化疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)、人用二倍体细胞的复苏；

(2)、人用二倍体细胞的培养扩增；

(3)、在人用二倍体细胞上接种狂犬病毒毒种；

(4)、收获病毒液；

(5)、病毒液的灭活；

(6)、澄清超滤；

(7)、纯化；

(8)、稀释分装。

所述纯化可以包括以下步骤：病毒液先经过超滤纯化除去部分杂蛋白，再经过DEAE-SepharoseFF阴离子交换或区带超速离心，然后经过Sepharose4FF柱或其他凝胶柱层析。所述人用二倍体细胞的培养扩增是在细胞营养液中进行的，细胞营养液由199培养液加入2-10％牛血清配制而成。细胞营养液在必要时还可加入适量的卡那霉素和庆大霉素。所述人用二倍体细胞的培养扩增是在转瓶内培养。本发明的制备方法，还包括佐剂吸附步骤或/和加保护剂人血白蛋白的步骤。其中加入人血白蛋白的量优选的是使其浓度为0.2-0.5％。

本发明的狂犬病纯化疫苗的制备工艺中，细胞培养所用的培养基是199培养基，采用超滤纯化初步纯化，蔗糖密度梯度离心法和Sepharose4FF凝胶过滤层析进行更纯提纯。测试结果表明，经过本发明的三步提纯后，可使疫苗总蛋白含量减少约99％以上，牛血清残余量均符合中国药典2005版关于生物制品规程的要求，加入氢氧化铝佐剂后使疫苗的效价提高20％，稳定性同时大大提高，接种时减缓病毒释放的速度，保持良好的抗体水平。通过纯化疫苗加入佐剂能增加疫苗的持久性，疫苗能够持久刺激机体产生抗体。

纯化工艺包括以下步骤：

(1)、灭活病毒后制成粗疫苗；

(2)、澄清过滤；

(3)、超滤纯化；

(4)、蔗糖密度梯度离心；(或采用DEAE-SepharoseFF)阴离子交换)

(5)、Sepharose4FF柱层析纯化；

(6)、佐剂吸附加保护剂人血白蛋白(或不加佐剂吸附)；

(7)、稀释分装。

本工艺使用的人用二倍体细胞种来源于中国疾病预防控制中心，首先建立人用二倍体胞种子库和人用二倍体细胞工作库，并对细胞库细胞进行系统的检定。在制备疫苗之前，需先进行细胞的复苏、培养和扩增，以达到生产批量的需要。可使用动物细胞培养液加入牛血清配制而成的细胞营养液，所说的培养液可以选择199培养液、平恒盐培养液等，其中以使用199培养液效果较为理想，细胞营养液中最好含有2-10％的牛血清，PH7.0-7.6，在37±0.5℃进行培养扩增。

各种用于制备疫苗的哺乳动物细胞均为附着依赖性细胞，细胞在一定的载体上生长，本工艺中细胞的培养方式为转瓶培养。

为防止细菌污染，在配制细胞营养液的同时可加入适量的卡那霉素和庆大霉素。

培养过程中，细胞分种率根据生产批量的需要确定，一般可以是1∶2～1∶4当细胞长成致密单层后，即可接种狂犬病毒，细胞维持液中最好加入0.4～0.5％(W/W)的人血白蛋白，同时调整PH7.2～7.8，培养温度32～37℃，并可加入适量的氨基酸和抗生素，可供使用的培养液包括199液、平恒盐液等，接种过程包括先用培养液如Earle氏液等冲洗细胞表面，去除残留的牛血清，然后在已经生长成致密单层的人用二倍体细胞上接种狂犬病毒毒种MOL0.1～0.01及上述细胞维持液，培养72小时左右，即可收获病毒。

本工艺在人用二倍体细胞上接种的狂犬病毒为在传代的人用二倍体狂犬病毒种，实验结果显示，狂犬病毒在人用二倍体细胞上能够很好地生长繁殖，在人用二倍体细胞传代狂犬病毒10代以内很稳定，并且制备人用二倍体细胞狂犬疫苗方面，10代以内的细胞传代毒种的免疫原性没有明显改变，而10代以后的毒种的免疫原性则有明显的下降，也就是说，制备疫苗最好选用10代以内的传代毒种，10代以后的毒种不宜用于制备纯化疫苗。至于毒种则优选狂犬毒种SNK-CTN株在人用二倍体细胞的传代毒种。

狂犬病毒在人用二倍体细胞上的生长繁殖可维持较长时间，因此病毒的收获可采取多次收取的方式，最好是第3～4天收获一次，对收获的病毒液及时测定病毒滴度，要求每批所收获病毒液病毒滴度均应在10^5.0LD50/ml以上，因为只有高滴度的病毒液才能保证疫苗的高效力。

收获的病毒液用β-丙内酯灭活病毒得到的是粗疫苗。

灭活后的粗疫苗需要进行浓缩提纯制备成纯疫苗制品，本工艺选用超滤浓缩的方法对得到的粗疫苗进行浓缩，一般是用截留10万～30万分子量的超滤器浓缩疫苗，浓缩至20倍以上，然后纯化疫苗。

以人用二倍体细胞制备生物制品安全性的关键是残余牛血清残留量的含量。按中国药典2005版有关生物制品的规程要求，疫苗的牛血清残留量必须小于50ng/ml。有关疫苗的纯化方法包括化学方法和物理方法等可以有多种，经反复试验和研究，本工艺提出纯化方法：超滤纯化、超离纯化和Sepharose 4FF柱层析纯化。另外采用无血清培养基培养可以直接排除血清对制品的影响。

超滤纯化疫苗即把疫苗超滤浓缩到一定倍数，然后加入适量的PBS冲洗，再浓缩到原倍数，再加入适量的PBS冲洗如此反复5～6次，牛血清残留量可以去除93％以上，再经过蔗糖密度梯度离心法参考石慧颖1998年发表的大规模区带离心纯化的方法纯化人用二倍体细胞乙脑疫苗的方法，用36％和45％(W/W)的蔗糖密度梯度，23000rpm超速离心4小时，经过对紫外吸收峰的抗原含量，蛋白浓度的分析，确定了病毒所在的位置。然后再经过Sepharose 4FF纯化，而凝胶过滤层析是层析技术中最简单，条件最温和，对保持生物大分子的活性最有利的方法，适合分离分子量悬殊的物质，狂犬病毒的分子量在400万以上，与疫苗中的杂蛋白分子量相差较大，故使用凝胶柱层析可以非常方便有效地去除浓缩疫苗中残留的小分子杂质，该凝胶过滤柱可以是Sepharose 4FF柱或其他凝胶，而检测结果表明，经三步层析柱纯化后，疫苗总蛋白含量减少约99％以上，牛血清的残余量均符合中华人民共和国药典的有关规程要求，而且比规程所要求的含量更低。纯化疫苗制成成品(即水针剂型)，加入保护剂人血白蛋白和氢氧化铝佐剂。用人用二倍体细胞作为疫苗的生产基质，并且以人用二倍体细胞的传代毒种代替现有的地鼠肾细胞和Vero细胞毒种，通过相应的工艺方法生产制备出高质量的狂犬疫苗。用本工艺制备的狂犬病纯化疫苗中不含外源因子，纯度高，免疫效果大大提高，使用安全性高，并能实现狂犬疫苗的大规模工业化生产。

本工艺与目前使用的来自地鼠肾细胞或Vero细胞疫苗相比，最主要的优点如下：(1)人用二倍体细胞已被证明不含任何污染因子和致瘤性，作为生产疫苗的基质，明显优于现行疫苗的地鼠肾细胞和Vero细胞；(2)人用二倍体细胞狂犬疫苗的毒种是人用二倍体细胞培养的毒种，从根本上更新了地鼠肾提纯疫苗和Vero细胞疫苗；(3)用人用二倍体细胞生产疫苗工艺，适用于工业化生产批量的均质疫苗，这是现行的地鼠肾细胞疫苗和Vero细胞疫苗办不到的，(4)本工艺制备的疫苗经提纯后抗原活性明显提高，杂蛋白减少99％以上，疫苗的纯度大大提高。

附图说明：

图1为本发明制备方法的方框流程图。

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明。

实施例1

二倍体细胞来自中国疾病预防控制中心，细胞营养液为199培养基中含有2-10％牛血清和25IU/ml庆大霉素和25IU/ml卡那霉素，并调整PH到7.2，用3L转瓶37℃培养成致密单层后按照1：2分种率扩增，扩增到生产批量时，经过4天左右，当细胞长成致密单层，弃去细胞营养液，用PH7.2的Earl’s液冲洗细胞面，接种二倍体细胞狂犬病毒，使用狂犬毒种SNK-CTN株在二倍体细胞上传代的第二代工作毒种，毒种浓度MOI0.05，细胞维持液为含0.4-0.5％(W/W)人血白蛋白的199培养液，PH7.6，35℃下培养，24小时后换以新鲜细胞维持液继续培养2天，开始收获病毒，每3-4天收获一次，共收3次，每批病毒液均取样进行病毒滴定和无菌试验，要求收获病毒液的病毒液的病毒滴度达到10^5.0LD50/ml以上；合并病毒液加入β-丙内酯(终浓度1/4000)置于4±1℃，24小时灭活病毒，得到粗疫苗，用截留30万分子量的超滤器浓缩成60倍浓缩疫苗。

超滤纯化的浓缩疫苗过蔗糖密度梯度离心法和凝胶过滤柱Sepharose4FF，经三步纯化，得到纯化疫苗，加入人血蛋白保护剂和氢氧化铝佐剂制成纯化疫苗成品，分装，制成狂犬病纯化疫苗为水针剂型5ml规格。

检定疫苗效力达到了中国狂犬疫苗参考品和美国狂犬疫苗参考品要求，其他各项检定均合中华人民共和国药典2005版生物制品规程的疫苗要求。

实施例2

二倍体细胞来自中国疾病预防控制中心，细胞营养液为199培养基中含有2-10％牛血清和25IU/ml庆大霉素和25IU/ml卡那霉素，并调整PH到7.2，用3L转瓶37℃培养成致密单层后按照1∶2分种率扩增，扩增到生产批量时，经过4天左右，当细胞长成致密单层，弃去细胞营养液，用PH7.2的Earl’s液冲洗细胞面，接种二倍体细胞狂犬病毒，使用狂犬毒种SNK-CTN株在二倍体细胞上传代的第二代工作毒种，毒种浓度MOI0.05，细胞维持液为含0.4-0.5％(W/W)人白蛋白的199培养液，PH7.6，35℃下培养，24小时后换以新鲜细胞维持液继续培养2天，开始收获病毒，每3-4天收获一次，共收3次，每批病毒液均取样进行病毒滴定和无菌试验，要求收获病毒液的病毒液的病毒滴度达到10^5.0LD50/ml以上；合并病毒液加入β-丙内酯(终浓度1/4000)置于4±1℃，24小时灭活病毒，得到粗疫苗，用截留30万分子量的超滤器浓缩成60倍浓缩疫苗。

超滤纯化的浓缩疫苗过蔗糖密度梯度离心法和凝胶过滤柱Sepharose4FF，经三步纯化，得到纯化疫苗，加入人血蛋白保护剂和氢氧化铝佐剂制成纯化疫苗成品，分装，制成狂犬纯化疫苗为水针剂型0.5ml规格。

检定疫苗效力达到了中国狂犬疫苗参考品和美国狂犬疫苗参考品要求，其他各项检定均合中华人民共和国药典2005版生物制品规程的疫苗要求。

实施例3

用权利要求1方法制备的狂犬灭活疫苗，给未接种过狂犬疫苗者接种狂犬病纯化疫苗14天后，中和抗体阳转率高于95.0％，且无副反应发生。

Claims (10)

1、一种人用二倍体细胞狂犬病纯化疫苗，其特征是，该疫苗是在人用二倍体细胞上接种SNK-CTN毒种，经分离纯化得到的狂犬疫苗。

2、权利要求1的纯化疫苗，其特征在于，所述狂犬病毒毒种选自狂犬毒种CTN株或aG株，所述人用二倍体细胞是WI-38、CCC-HPF-1P5、MRC-5。

3、权利要求1的纯化疫苗，其特征在于，是冻干注射剂或水针剂。

4、权利要求1的纯化疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、人用二倍体细胞的复苏；

(2)、人用二倍体细胞的培养扩增；

(3)、在人用二倍体细胞上接种狂犬病毒毒种；

(4)、收获病毒液；

(5)、病毒液的灭活；

(6)、纯化。

5、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述纯化包括以下步骤：

(1)、灭活病毒后制成粗疫苗；

(2)、澄清过滤；

(3)、超滤纯化；

(4)、蔗糖密度梯度离心或采用DEAE-SepharoseFF阴离子交换；

(5)、Sepharose4FF柱层析纯化；

(6)、佐剂吸附，加保护剂人血白蛋白。

6、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述人用二倍体细胞的培养扩增是在细胞营养液中进行的，细胞营养液由199培养液加入2-10％牛血清配制而成。

7、根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，细胞培养液中还加入适量的卡那霉素和庆大霉素。

8、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述人用二倍体细胞的培养扩增是在转瓶内培养。

9、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，还包括佐剂吸附步骤或/和加保护剂人血白蛋白的步骤。

10、根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，加入人血白蛋白使其浓度为0.2--0.5％。

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