CN106834237A - 一种人二倍体细胞培养狂犬病毒的工艺 - Google Patents

一种人二倍体细胞培养狂犬病毒的工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人二倍体细胞培养狂犬病毒的工艺，包括以下步骤:S1，细胞消化传代；S2，病毒接种；S3，转种；S4，换液培养；S5，病毒表达培养；S6，病毒收获及抽样检定。本发明收获的狂犬病毒总量，突破了目前现有的人二倍体细胞狂犬病疫苗生产水平的单罐最大生产量，这在疫苗生产中具有明显的积极意义，可有效的降低人员操作强度，减少由于单罐产能较少带来的罐间差异，保证了疫苗生产的产品质量稳定性和均一性。

Description

一种人二倍体细胞培养狂犬病毒的工艺
技术领域
本发明具体涉及一种人二倍体细胞培养狂犬病毒的工艺。
背景技术
狂犬病又称“恐水病”、“疯狗病”，是人被带狂犬病毒的病兽(犬、猫、狼、狐狸)咬伤后由狂犬病毒感染引起的一种烈性传染病。该病目前无有效治疗方法，一旦发病，死亡率为100％被列为中国的一类传染病。一旦暴露，有效的方法就是接种狂犬病疫苗并注射狂犬病免疫球蛋白。狂犬病人二倍体疫苗是美国维斯塔研究所首创，具有较好的安全性和免疫原性，被公认为金标准疫苗。
目前，国内大部分疫苗企业仍采用传统的转瓶细胞培养工艺来培养细胞生产病毒疫苗，该方法具有培养细胞密度低、病毒滴度低、劳动强度大等缺点。20世纪70年代，建立了微载体生物反应器培养动物细胞的工艺，把贴壁培养和悬浮培养两种培养工艺融合在一起，兼有两者的优点，使得动物细胞工业化的大规模、高密度培养，以满足生物技术发展的需要，而细胞微载体放大培养就是其中的关键技术之一。由于单罐产能较少带来的罐间差异，单罐收获的狂犬病毒量较低，使得生产的狂犬病疫苗的稳定性和均一性较差，同时工作人员的操作强度较高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种人二倍体细胞培养狂犬病毒的工艺，以解决现有苦荞饮用茶营养成分单一、有添加剂以及口感欠佳的缺点。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
一种人二倍体细胞培养狂犬病毒的工艺，包括以下步骤,
S1，细胞消化传代：取50L达到生长致密的人二倍体细胞种子，以缓冲液洗涤去除残留的培养基，加入细胞消化液消化细胞，待细胞圆缩脱壁加入细胞生长液终止消化，高速搅拌以分散细胞，制成细胞悬液，然后将细胞悬液加入生物反应器A内；将经细胞生长液预处理过的无菌的细胞微载体加入生物反应器A内，与细胞悬液搅拌混匀以促使细胞贴壁，细胞传代比例为2-3PDL；
S2，病毒接种：以细胞病毒接种比例0.01-0.1MOI的标准，将狂犬病毒接种至生物反应器A内的细胞悬液中混匀，并吸附三十分钟，制成细胞病毒混合物；
S3，转种：将生物反应器A内的细胞病毒混合物导出转种至生物反应器B中，并补加细胞生长液继续培养细胞病毒混合物，培养体积为M，制成细胞病毒培养物；
S4，换液培养：对生物反应器B内的细胞病毒培养物每天置换细胞生长液30-50％，同时每天抽样观察细胞，直至细胞生长致密；
S5，病毒表达培养：待生物反应器B内的细胞生长致密后，停止生物反应器B的搅拌及控制，待长满细胞的微载体沉降，排出细胞生长液，添加病毒维持液至培养体积为M，并继续培养；
S6，病毒收获及抽样检定：每天观察微载体上的细胞脱落情况，每天收获培养物上清一次，具体操作如下，
停止生物反应器B的搅拌及控制，待长满细胞的微载体沉降后，收获70％-80％的培养物上清，继续补加病毒维持液至培养体积为M，同时抽样用于细胞计数、病毒滴度及病毒抗原检测。
作为优选，所述步骤S6中的细胞计数采用血细胞计数板进行：取5ml培养物，静置去除培养物上清，以缓冲液洗涤2次，加入适量的细胞消化液消化细胞，制备细胞悬液后，镜检计数。
作为优选，所述步骤S6中的病毒滴定以6孔板蚀斑法滴定：将收获的培养物以缓冲液稀释成10-4、10-5、10-6稀释度后接种生长致密的BHK21细胞，每个稀释度接种2孔，每孔0.1ml，滴定后覆盖甲基纤维素培养7-10天，结晶紫染板，计算病毒滴度。
作为优选，所述步骤S6中的病毒抗原检测：以免疫酶联法检测每天抽样的病毒培养物，确定抗原表达水平，监测病毒抗原含量变化。
作为优选，所述步骤S6中当细胞病变脱落，微载体表面剩余细胞不足接种狂犬病毒前细胞量的1/10时，结束培养。
作为优选，所述步骤S1和步骤S2中生物反应器A内的培养参数为pH7.2，温度37℃，转速60rpm。
作为优选，所述步骤S3中生物反应器B内的培养参数为pH 7.2，温度37℃，转速20rpm，DO控制50％。
作为优选，所述步骤S5中生物反应器B内继续培养的培养参数为pH 7.4，温度33℃，搅拌转速20rpm，DO控制50％。
作为优选，所述生物反应器A的容积为50L，生物反应器B的容积为500L，步骤S3、S5和S6中生物反应器B内的培养体积M为300L。
作为优选，所述缓冲液为PBS缓冲液，所述人二倍体细胞为MRC-5细胞，所述狂犬病毒为狂犬病毒PM株。
本发明的有益效果为
1、本发明收获的狂犬病毒总量，突破了目前现有的人二倍体细胞狂犬病疫苗生产水平的单罐最大生产量，这在疫苗生产中具有明显的积极意义，可有效的降低人员操作强度，减少由于单罐产能较少带来的罐间差异，保证了疫苗生产的产品质量稳定性和均一性。
附图说明
图1传代前生长致密的微载体培养MRC-5细胞；
图2微载体扩增培养后细胞贴壁情况；
图3生长阶段的MRC-5细胞；
图4接种病毒后生长致密表达初期的MRC-5细胞；
图5病毒表达中期MRC-5细胞；
图6病毒表达后期MRC-5细胞；
图7根据每天细胞计数结果描绘的细胞生长曲线；
图8根据每天病毒滴度结果描绘的病毒滴度曲线；
图9根据每天病毒抗原表达结果描绘的狂犬病毒抗原含量变化曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例及相应的附图对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1：
一种人二倍体细胞培养狂犬病毒的工艺，包括以下步骤，
S1，细胞消化传代：
取50L达到生长致密的MRC-5人胚肺二倍体细胞种子，以PBS缓冲液洗涤去除残留的培养基，加入细胞消化液消化细胞，镜检观察细胞，待细胞圆缩脱壁，加入细胞生长液终止消化，高速搅拌分散细胞，制备成细胞悬液，将细胞悬液加入50L生物反应器内；将一定量的新鲜制备的以细胞生长液预处理过的无菌微载体加入50L生物反应器内，继续搅拌混匀，促使细胞贴壁，细胞传代比例为2-3PDL。
50L生物反应器内的培养参数设置为pH7.2，温度37℃，转速控制60rpm。
S2，病毒接种：
按照设定的细胞病毒接种比例0.01-0.1MOI接种病毒至50L生物反应器内的细胞悬液中，混匀，吸附三十分钟。50L生物反应器内的培养参数设置与步骤S1中相同。
S3，转种至500L生物反应器：
将50L生物反应器内的细胞病毒混合物导出转种至500L生物反应器，并补加细胞生长液至300L，继续培养细胞病毒混合物，制得细胞病毒培养物。
500L生物反应器内设定的培养参数为pH 7.2，温度37℃，转速20rpm，DO控制50％。
S4，换液培养：
将细胞病毒培养物每天置换细胞生长液30-50％，同时每天抽样观察细胞，直至细胞生长致密。细胞生长前期可少量置换细胞生长液，但随着细胞生长，细胞数量增加，需增大细胞生长液置换比例。
S5，病毒表达培养：
待细胞生长致密后，停止500L生物反应器内的搅拌及控制，待长满细胞的微载体沉降，排除细胞生长液。添加病毒维持液至原培养体积300L，调整500L生物反应器内的培养参数为pH 7.4、温度33℃、搅拌转速20rpm、DO 50％，继续培养。
S6，病毒收获及抽样检定：
每天观察微载体上的细胞脱落情况，每天收获病毒培养物一次，操作如下，
停止500L生物反应器的搅拌及控制，待微载体沉降后，收获70％的培养物上清，继续补加病毒维持液至原培养体积300L，同时抽样用于细胞计数、病毒滴度及病毒抗原检测。
当细胞病变脱落，微载体表面剩余细胞不足接种病毒前细胞量的1/10时，结束培养。
S7，细胞计数：
采用血细胞计数板进行细胞计数，具体操作如下，
取5ml培养物，静置去除培养物上清，以PBS缓冲液洗涤2次，加入适量的细胞消化液消化细胞，制备细胞悬液后，镜检计数。
S8，病毒滴定：
以6孔板蚀斑法滴定，具体操作如下，
将收获的培养物上清以PBS缓冲液稀释成10-4、10-5、10-6稀释度后接种生长致密的BHK21细胞，每个稀释度接种2孔，每孔0.1ml，滴定后覆盖甲基纤维素培养7天，结晶紫染板，计算病毒滴度。
S9，病毒抗原检测：
以免疫酶联法法检测每天抽样的病毒培养物，确定抗原表达水平，监测病毒抗原含量变化。
实施例2：
一种人二倍体细胞培养狂犬病毒的工艺，包括以下步骤，
S1，细胞消化传代：
取50L达到生长致密的MRC-5人胚肺二倍体细胞种子，以PBS缓冲液洗涤去除残留的培养基，加入细胞消化液消化细胞，镜检观察细胞，待细胞圆缩脱壁，加入细胞生长液终止消化，高速搅拌分散细胞，制备成细胞悬液，将细胞悬液加入50L生物反应器内；将一定量的新鲜制备的以细胞生长液预处理过的无菌微载体加入50L生物反应器内，继续搅拌混匀，促使细胞贴壁，细胞传代比例为2-3PDL。
50L生物反应器内的培养参数设置为pH7.2，温度37℃，转速控制60rpm。
S2，病毒接种：
按照设定的细胞病毒接种比例0.01-0.1MOI接种病毒至50L生物反应器内的细胞悬液中，混匀，吸附三十分钟。50L生物反应器内的培养参数设置与步骤S1中相同。
S3，转种至500L生物反应器：
将50L生物反应器内的细胞病毒混合物导出转种至500L生物反应器，并补加细胞生长液至300L，继续培养细胞病毒混合物，制得细胞病毒培养物。
500L生物反应器内设定的培养参数为pH 7.2，温度37℃，转速20rpm，DO控制50％。
S4，换液培养：
将细胞病毒培养物每天置换细胞生长液30-50％，同时每天抽样观察细胞，直至细胞生长致密。细胞生长前期可少量置换细胞生长液，但随着细胞生长，细胞数量增加，需增大细胞生长液置换比例。
S5，病毒表达培养：
待细胞生长致密后，停止500L生物反应器内的搅拌及控制，待长满细胞的微载体沉降，排除细胞生长液。添加病毒维持液至原培养体积300L，调整500L生物反应器内的培养参数为pH 7.4、温度33℃、搅拌转速20rpm、DO 50％，继续培养。
S6，病毒收获及抽样检定：
每天观察微载体上的细胞脱落情况，每天收获病毒培养物一次，操作如下，
停止500L生物反应器的搅拌及控制，待微载体沉降后，收获80％的培养物上清，继续补加病毒维持液至原培养体积300L，同时抽样用于细胞计数、病毒滴度及病毒抗原检测。
当细胞病变脱落，微载体表面剩余细胞不足接种病毒前细胞量的1/10时，结束培养。
S7，细胞计数：
采用血细胞计数板进行细胞计数，具体操作如下，
取5ml培养物，静置去除培养物上清，以PBS缓冲液洗涤2次，加入适量的细胞消化液消化细胞，制备细胞悬液后，镜检计数。
S8，病毒滴定：
以6孔板蚀斑法滴定，具体操作如下，
将收获的培养物上清以PBS缓冲液稀释成10-4、10-5、10-6稀释度后接种生长致密的BHK21细胞，每个稀释度接种2孔，每孔0.1ml，滴定后覆盖甲基纤维素培养10天，结晶紫染板，计算病毒滴度。
S9，病毒抗原检测：
以免疫酶联法法检测每天抽样的病毒培养物，确定抗原表达水平，监测病毒抗原含量变化。
实施例3：
一种人二倍体细胞培养狂犬病毒的工艺，包括以下步骤，
S1，细胞消化传代：
取50L达到生长致密的MRC-5人胚肺二倍体细胞种子，以PBS缓冲液洗涤去除残留的培养基，加入细胞消化液消化细胞，镜检观察细胞，待细胞圆缩脱壁，加入细胞生长液终止消化，高速搅拌分散细胞，制备成细胞悬液，将细胞悬液加入50L生物反应器内；将一定量的新鲜制备的以细胞生长液预处理过的无菌微载体加入50L生物反应器内，继续搅拌混匀，促使细胞贴壁，细胞传代比例为2-3PDL。
50L生物反应器内的培养参数设置为pH7.2，温度37℃，转速控制60rpm。
S2，病毒接种：
按照设定的细胞病毒接种比例0.01-0.1MOI接种病毒至50L生物反应器内的细胞悬液中，混匀，吸附三十分钟。50L生物反应器内的培养参数设置与步骤S1中相同。
S3，转种至500L生物反应器：
将50L生物反应器内的细胞病毒混合物导出转种至500L生物反应器，并补加细胞生长液至300L，继续培养细胞病毒混合物，制得细胞病毒培养物。
500L生物反应器内设定的培养参数为pH 7.2，温度37℃，转速20rpm，DO控制50％。
S4，换液培养：
将细胞病毒培养物每天置换细胞生长液30-50％，同时每天抽样观察细胞，直至细胞生长致密。细胞生长前期可少量置换细胞生长液，但随着细胞生长，细胞数量增加，需增大细胞生长液置换比例。
S5，病毒表达培养：
待细胞生长致密后，停止500L生物反应器内的搅拌及控制，待长满细胞的微载体沉降，排除细胞生长液。添加病毒维持液至原培养体积300L，调整500L生物反应器内的培养参数为pH 7.4、温度33℃、搅拌转速20rpm、DO 50％，继续培养。
S6，病毒收获及抽样检定：
每天观察微载体上的细胞脱落情况，每天收获病毒培养物一次，操作如下，
停止500L生物反应器的搅拌及控制，待微载体沉降后，收获75％的培养物上清，继续补加病毒维持液至原培养体积300L，同时抽样用于细胞计数、病毒滴度及病毒抗原检测。
当细胞病变脱落，微载体表面剩余细胞不足接种病毒前细胞量的1/10时，结束培养。S7，细胞计数：
采用血细胞计数板进行细胞计数，具体操作如下，
取5ml培养物，静置去除培养物上清，以PBS缓冲液洗涤2次，加入适量的细胞消化液消化细胞，制备细胞悬液后，镜检计数。
S8，病毒滴定：
以6孔板蚀斑法滴定，具体操作如下，
将收获的培养物上清以PBS缓冲液稀释成10-4、10-5、10-6稀释度后接种生长致密的BHK21细胞，每个稀释度接种2孔，每孔0.1ml，滴定后覆盖甲基纤维素培养9天，结晶紫染板，计算病毒滴度。
S9，病毒抗原检测：
以免疫酶联法法检测每天抽样的病毒培养物，确定抗原表达水平，监测病毒抗原含量变化。
对实施例1-3的说明
细胞形态方面，通过取样观察，记录细胞生长情况，见图1至图6。
细胞计数，根据每天抽样计数结果，描绘细胞生长曲线，见图7。
病毒滴度检测，根据接种病毒后每天抽样的蚀斑法检测病毒滴度结果，描绘病毒滴度曲线，见图8。
病毒抗原表达检测，根据接种病毒后每天抽样的免疫酶联法检测狂犬病毒抗原含量检测结果，描绘病毒抗原含量变化曲线。
步骤S6中收获的培养物上清主要包含狂犬病毒和部分MRC-5细胞组织碎片，收获狂犬病毒经过纯化、灭火等步骤后制得狂犬病疫苗。
将50L达到生长致密程度的MRC-5细胞消化制备细胞悬液，按照0.01-0.1MOI的接种比例接种狂犬病毒PM株毒种后，细胞在6天后能重新生长达到致密状态，细胞形态良好，病毒滴度表达较高，当将细胞生长液置换成病毒维持液后，病毒培养物能维持一段时间的较高的病毒表达水平。
经过50L和500L生物反应器培养的MRC-5细胞，在接种狂犬病毒PM株毒种后，MRC-5细胞生长良好，细胞密度、病毒滴度表达水平及病毒抗原表达持续时间均能达到疫苗生产要求。该工艺收获的狂犬病毒总量，突破了目前现有的人二倍体细胞狂犬病疫苗生产水平的单罐最大生产量，这在疫苗生产中具有明显的积极意义，可有效的降低人员操作强度，减少由于单罐产能较少带来的罐间差异，保证了疫苗生产的产品质量稳定性和均一性。
上述实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种人二倍体细胞培养狂犬病毒的工艺，其特征在于，包括以下步骤,
S1，细胞消化传代：取50L达到生长致密的人二倍体细胞种子，以缓冲液洗涤去除残留的培养基，加入细胞消化液消化细胞，待细胞圆缩脱壁加入细胞生长液终止消化，高速搅拌以分散细胞，制成细胞悬液，然后将细胞悬液加入生物反应器A内；将经细胞生长液预处理过的无菌的细胞微载体加入生物反应器A内，与细胞悬液搅拌混匀以促使细胞贴壁，细胞传代比例为2-3PDL；
S2，病毒接种：以细胞病毒接种比例0.01-0.1MOI的标准，将狂犬病毒接种至生物反应器A内的细胞悬液中混匀，并吸附三十分钟，制成细胞病毒混合物；
S3，转种：将生物反应器A内的细胞病毒混合物导出转种至生物反应器B中，并补加细胞生长液继续培养细胞病毒混合物，培养体积为M，制成细胞病毒培养物；
S4，换液培养：对生物反应器B内的细胞病毒培养物每天置换细胞生长液30-50％，同时每天抽样观察细胞，直至细胞生长致密；
S5，病毒表达培养：待生物反应器B内的细胞生长致密后，停止生物反应器B的搅拌及控制，待长满细胞的微载体沉降，排出细胞生长液，添加病毒维持液至培养体积为M，并继续培养；
S6，病毒收获及抽样检定：每天观察微载体上的细胞脱落情况，每天收获培养物上清一次，具体操作如下，
停止生物反应器B的搅拌及控制，待长满细胞的微载体沉降后，收获70％-80％的培养物上清，继续补加病毒维持液至培养体积为M，同时抽样用于细胞计数、病毒滴度及病毒抗原检测。
2.如权利要求1的人二倍体细胞培养狂犬病毒的工艺，其特征为，所述步骤S6中的细胞计数采用血细胞计数板进行：取5ml培养物，静置去除培养物上清，以缓冲液洗涤2次，加入适量的细胞消化液消化细胞，制备细胞悬液后，镜检计数。
3.如权利要求1的人二倍体细胞培养狂犬病毒的工艺，其特征为，所述步骤S6中的病毒滴定以6孔板蚀斑法滴定：将收获的培养物以缓冲液稀释成10-4、10-5、10-6稀释度后接种生长致密的BHK21细胞，每个稀释度接种2孔，每孔0.1ml，滴定后覆盖甲基纤维素培养7-10天，结晶紫染板，计算病毒滴度。
4.如权利要求1的人二倍体细胞培养狂犬病毒的工艺，其特征为，所述步骤S6中的病毒抗原检测：以免疫酶联法检测每天抽样的病毒培养物，确定抗原表达水平，监测病毒抗原含量变化。
5.如权利要求1的人二倍体细胞培养狂犬病毒的工艺，其特征为，所述步骤S6中当细胞病变脱落，微载体表面剩余细胞不足接种狂犬病毒前细胞量的1/10时，结束培养。
6.如权利要求1的人二倍体细胞培养狂犬病毒的工艺，其特征为，所述步骤S1和步骤S2中生物反应器A内的培养参数为pH7.2，温度37℃，转速60rpm。
7.如权利要求1的人二倍体细胞培养狂犬病毒的工艺，其特征为，所述步骤S3中生物反应器B内的培养参数为pH 7.2，温度37℃，转速20rpm，DO控制50％。
8.如权利要求1的人二倍体细胞培养狂犬病毒的工艺，其特征为，所述步骤S5中生物反应器B内继续培养的培养参数为pH 7.4，温度33℃，搅拌转速20rpm，DO控制50％。
9.如权利要求1的人二倍体细胞培养狂犬病毒的工艺，其特征为，所述生物反应器A的容积为50L，生物反应器B的容积为500L，步骤S3、S5和S6中生物反应器B内的培养体积M为300L。
10.如权利要求1-3任一项的人二倍体细胞培养狂犬病毒的工艺，其特征为，所述缓冲液为PBS缓冲液，所述人二倍体细胞为MRC-5细胞，所述狂犬病毒为狂犬病毒PM株。
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