CN103555653B - 一种红鳍东方魨卵巢细胞系体外构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种红鳍东方魨卵巢细胞系体外构建方法及应用，构建方法步骤有：（1）原代细胞培养液的制备；（2）原代培养；（3）传代培养；（4）不同形态细胞系的分离，其应用包括有：红鳍东方魨卵巢细胞系在两种典型鱼类病毒增殖和扩繁中的应用及红鳍东方魨卵巢细胞系在转基因研究中的应用。本发明选择卵巢作为培养和建系对象旨在为研究河豚毒素的提取利用和养殖河豚鱼的安全脱毒处理搭建一个生物平台，更好的服务于传统的水产养殖业及新兴的生物医药行业。

Description

一种红鳍东方魨卵巢细胞系体外构建方法及其应用

技术领域

本发明属于海洋生物细胞培养技术领域，尤其是一种红鳍东方魨卵巢细胞系体外构建方法及其应用。

背景技术

红鳍东方鲀隶属于辐鳍鱼纲，鲀形目，四齿鲀科（Tetraodontidae），东方鲀属（Takifugu），是大形鲀类，体型似“豚”，常见于河口，又被称为“河豚”。作为我国重要海水养殖鱼类，红鳍东方魨不仅肉质口感鲜美，含蛋白质丰富，营养价值高，而且是重要的模式鱼类。值得关注的是，其内脏、血、卵巢及皮等含河鲀毒素(Tetrodonine)，尤以卵巢及肝最毒，因此提取河鲀毒素的主要原料为河鲀的卵巢和肝脏。河鲀毒素(tetrodotoxin,TTX)是一种氨基全氢喹唑啉化合物属于生物碱，曾一度被认为是自然界中毒性最强的非蛋白类毒素，其毒力相当于氰化钠的1250倍。河鲀毒素是一种神经毒素，化学性质稳定，盐腌、日晒亦均不能破坏毒素，耐高温，100℃高温下加热8小时都不被破坏，130℃高温下加热11个小时也只能分解30%左右，一般烹调手段难以破坏，中毒后也缺乏有效的解救措施。

自1990年11月《水产品卫生管理办法》颁布实施以来，我国的法律规定禁止鲜河鲀流入市场，这是基于生长在深海的剧毒河鲀鱼肌肉有毒而作出的防范规定。但同时也该看到，河豚也具有极高的营养价值，无毒或者低毒的全人工养殖河豚具有极高的市场价值，通过国内近年河豚的淡水养殖的摸索，再辅以技术手段，河豚的毒素已经基本没有了，只要去除其血液、眼睛、内脏等有毒物质，经过有资质的专业厨师烹饪就将是一道佳肴，由于有市场需求，目前市场价每公斤高达几百元。

河鲀毒素还具有极高的药用价值，可作为局部麻醉药，其局部麻醉作用比一般麻药强。国外已有将河鲀毒素与普通麻药配伍作为局部麻药的专利出售。河鲀毒素对癌痛的镇痛也很有效。研究人员发现癌症病人24h持续杜冷丁治疗收效甚微，而注射河鲀毒素，每天2次，连续3天疼痛便缓解。河鲀毒素不仅可以有效缓解晚期癌症引起的剧烈痛楚，还可治疗顽固性哮喘等。中国研究人员发现，河鲀毒素还是一种戒毒良药。研究人员对吸毒者进行试验，在注射极微量的河鲀毒素后，所有各种“戒毒综合症”在30min后全部消失。连续注射5d后可完全戒除毒瘾，且没有副作用。1998年，加拿大国际韦克斯技术公司利用河鲀毒素成功研制成一种名为tetrodin的戒毒新药。利用河鲀毒素来戒除毒瘾，可谓“以毒攻毒”的一大创举。目前国际市场价每克河豚毒素约达6万美元，具有极高商业价值。

鱼类细胞系作为良好的表达载体和体外平台，在研究病毒分离、环境毒理、基因功能探索、转基因研究等方面具有重要意义。而目前为止，国内外尚未有关于红鳍东方鲀细胞培养的相关报道，也未能建立起一个红鳍东方鲀细胞系来开展养殖脱毒河豚以及河豚毒素产生的毒理学研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种红鳍东方魨卵巢细胞系体外构建方法及其应用。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种红鳍东方魨卵巢细胞系体外构建方法，步骤如下：

（1）原代细胞培养液的制备：具体步骤包括：

①基础培养基制备：1000ml MEM和L-15培养基以2:1混合后的基础培养基，称取2.38gHepes，溶解于超纯去离子水中，磁力搅拌混匀后，调节pH在7.5，然后抽滤灭菌后，为基础培养基；

②红鳍东方鲀卵巢细胞完全培养基的制备：将占总体积20%的胎牛血清、1%的大菱鲆血清、占总体积0.1%的2-巯基乙醇、2ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子、1ng/ml白血病抑制因子、1nmol/L的丙酮酸钠及1nmol/L的谷氨酰胺加入到基础培养基中，由此制成红鳍东方鲀卵巢细胞完全培养基；

（2）原代培养：具体步骤包括：

①试验鱼选取：选取鱼龄为一年的体重约500g的健康雌性红鳍东方鲀；

②试验鱼暂养：用含1000单位/毫升的青霉素和1000单位/毫升链霉素过滤消毒海水，用无菌海水暂养停止投喂的实验鱼，待实验鱼停止排遗达24h以上时，用捞网迅速将红鳍东方鲀取出置于75%酒精中浸泡2min；

③卵巢获取及接种：将昏迷后的试验鱼在超净工作台中无菌解剖，取出卵巢，置于一次性的3.5cm培养皿中，PBS冲洗一次，70%酒精浸泡消毒3min后，PBS冲洗两次，用无菌眼科剪将性腺组织剪成大约1cm³及以下的小块；然后用0.75%的胰酶将剪碎组织块消化15分钟，PBS冲洗，过滤组织块，用无菌的200ul移液器吸头轻轻的吸取组织块，接种在25cm²的培养瓶中，接种时要均匀，尽量使多的组织块布满瓶底，平均每瓶中接种数量为5×6=30块；

④原代培养：将培养瓶翻转，加入完全培养基2ml，倒置于24℃培养箱中培养，3h组织块贴壁后，轻轻翻转培养瓶，将培养瓶正置，轻晃培养瓶，使各组织块浸到培养液中，24h后补加完全培养液至4ml，隔天观察细胞贴壁及生长状态，每隔5天更换完全培养基的2/3，每次更换时吸出脱壁的组织块，约两周迁出的细胞长满瓶底后，进行传代培养；

（3）传代培养：原代培养细胞以组织块为中心形成细胞集落，从而使整个瓶底细胞连成单层的一片，以0.25%的胰酶短暂消化细胞，迅速吸出，加入培养基吹打使细胞悬浮，以一瓶传两瓶的方式进行传代；根据细胞生长状态，5-7天可传代一次；传至第30代时，细胞基本生长稳定，可以进行相关生理数据的测定；

（4）不同形态细胞系的分离：组织块接种时，随着细胞贴壁扩繁，逐步呈现出两种形态的细胞：一种为梭形上皮样细胞，另一种为鹅卵石形上皮样细胞，依据二者不同的贴壁附着特性，通过消化时间差异化处理，逐步将两种细胞分离，至第三代完全分离完成，形成两个红鳍东方鲀雌性卵巢细胞系，即TSOC1和TSOC2。

而且，所述步骤（1）中③卵巢获取及接种的剪组织过程中滴加一滴完全培养基润湿组织块，防止组织在培养皿中干涸。

而且，所述步骤（3）传代培养中如果不需要细胞继续快速繁殖，可以将完全培养基中血清含量减为总体积的15%。

一种红鳍东方魨卵巢细胞系在鱼类病毒增殖中的应用，步骤如下，

（1）首先检测如上所述构建的两个红鳍东方鲀雌性卵巢细胞系，即TSOC1和TSOC2对牙鲆淋巴囊肿病毒和大菱鲆虹彩病毒的敏感性；

（2）将上所述构建的两个红鳍东方鲀雌性卵巢细胞系TSOC1和TSOC2细胞系应用于鱼类病毒增殖及扩繁技术领域中。

一种红鳍东方魨卵巢细胞系在转基因中的应用，步骤如下，

（1）首先检测如上所述构建的两个红鳍东方鲀雌性卵巢细胞系，即TSOC1和TSOC2对转染pEGFP-N3的表达；

（2）将上所述构建的两个红鳍东方鲀雌性卵巢细胞系TSOC1和TSOC2应用于转基因技术领域。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明经过多次实验和摸索探明了红鳍东方鲀雌鱼卵巢细胞体外培养的条件，构建了卵巢细胞系体外培养方法，并得到两种形态和特性不同的细胞，经过此方法构建的细胞系具有生长快、增殖和传代能力强的优点，作为红鳍东方鲀的首个细胞系为未来的相关研究构筑了良好的体外表达平台，在病毒学研究、基因组学研究、环境毒理学研究方面都有潜在的应用价值。

2、本专利选择卵巢作为培养和建系对象旨在为研究河豚毒素的提取利用和养殖河豚鱼的安全脱毒处理搭建一个生物平台，更好的服务于传统的水产养殖业及新兴的生物医药行业。

附图说明

图1是相差显微镜下传代培养的红鳍东方鲀卵巢细胞；

其中，A是红鳍东方鲀卵巢细胞TSOC1第10代；B是红鳍东方鲀卵巢细胞TSOC2第8代（A，B标尺=50um；）；

图2是红鳍东方鲀卵巢细胞TSOC1和TSOC2的生长状况图，

其中，A和a分别是红鳍东方鲀卵巢细胞TSOC1和TSOC2在不同温度下的扩繁计数柱形统计图；

其中，B和b分别是红鳍东方鲀卵巢细胞TSOC1和TSOC2在不同胎牛血清浓度下的生长趋势；

其中，C和c分别红鳍东方鲀卵巢细胞TSOC1和TSOC2在不同pH下的生长趋势；

图3是光学显微镜观察牙鲆淋巴囊肿病毒（LCDV）和大菱鲆虹彩病毒（TRBIV）感染TSOC1和TSOC2细胞后的细胞病理效应图，标尺=50um；

其中，A,a,D,d为未感染病毒的阴性对照图；

其中，B,C是TSOC1感染牙鲆淋巴囊肿病毒（LCDV）图；

其中，b,c是TSOC1感染大菱鲆虹彩病毒（TRBIV）图；

其中，E,F是TSOC2感染牙鲆淋巴囊肿病毒（LCDV）图；

其中，e,f是TSOC2感染大菱鲆虹彩病毒（TRBIV）图。

图4是病毒侵入到TSOC1细胞和TSOC2细胞的透射电镜图及两种病毒颗粒PCR扩增电泳条带图，标尺=400nm；

其中，A，a分别是15,000倍透射电镜观察牙鲆淋巴囊肿病毒（LCDV）病毒颗粒侵入到TSOC1细胞中和TSOC2细胞中的图；

其中，B，b分别是15,000倍透射电镜观察大菱鲆虹彩病毒（TRBIV）病毒颗粒侵入到TSOC1细胞和TSOC2细胞中的图；

其中，C是利用两种病毒颗粒蛋白外被的特异引物进行PCR扩增表示大菱鲆虹彩病毒电泳条带及牙鲆淋巴囊肿病毒电泳条带图；

图5是红鳍东方鲀卵巢细胞转染pEGFP-N3质粒图，

其中，a为TSOC1表达GFP报告基因图；

其中，b为TSOC2表达GFP报告基因图；

其中，c为高倍镜下TSOC1表达GFP报告基因图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明实施例做进一步详述，需要强调的是，以下实施方式是说明性的，而不是限定性的，不能以此实施方式作为对本发明的限定。

一种红鳍东方魨卵巢细胞系体外构建方法，步骤方法如下：

（1）原代细胞培养液的制备：具体步骤包括：

①基础培养基制备：1000ml MEM和L-15培养基以2:1混合后的基础培养基（GIBCO标准品），精确称取2.38g Hepes，溶解于超纯去离子水中，磁力搅拌混匀后，调节pH在7.5左右，然后抽滤灭菌后，作为基础培养基可以长期4℃保存（3个月）；

②红鳍东方鲀卵巢细胞完全培养基的制备：将占总体积20%的胎牛血清(FBS)、1%的大菱鲆血清(SMS)、占总体积0.1%的2-巯基乙醇、2ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子、1ng/ml白血病抑制因子、1nmol/L的丙酮酸钠及1nmol/L的谷氨酰胺加入到基础培养基中，由此制成红鳍东方鲀卵巢细胞完全培养基。

（2）原代培养：具体步骤分为：

①试验鱼选取：选取鱼龄为一年的体重约500g的健康雌性红鳍东方鲀（成年鱼性腺分化程度高，细胞分裂增殖能力弱，而过小的鱼苗性腺组织小较难获得，易混入其他不明组织造成细胞交叉污染）；

②试验鱼暂养：用含1000单位/毫升的青霉素和1000单位/毫升链霉素的过滤消毒的无菌海水暂养停止投喂的实验鱼，待到实验鱼停止排遗达24h以上时，用捞网迅速将红鳍东方鲀取出（尽量避免红鳍东方鲀受刺激时体腔蓬起，将周围环境中海水吸入腹腔，增加污染的几率）置于75%酒精中浸泡2min；

③卵巢获取及接种：将昏迷后的试验鱼在超净工作台中无菌解剖，取出卵巢，置于一次性的3.5cm培养皿中，PBS冲洗一次，70%酒精浸泡消毒3min，PBS冲洗两次，用无菌眼科剪将性腺组织剪成大约1cm³及以下的小块，若剪组织过程需要较长时间，则适量的滴加一滴完全培养基润湿组织块，防止其干涸在培养皿中；然后用0.75%的胰酶将剪碎组织块消化15分钟，PBS冲洗，过滤组织块，用无菌的200ul移液器吸头轻轻的吸取组织块，接种在25cm²的培养瓶中，接种时要均匀，尽量使多的组织块布满瓶底，平均每瓶中接种数量约为5×6=30块；

④原代培养：将培养瓶翻转，加入完全培养基2ml，倒置于24℃培养箱中培养，大约3h组织块贴壁后，轻轻翻转培养瓶，将培养瓶正置，轻晃培养瓶，使各组织块浸到培养液中，24h后补加完全培养液至4ml，补加时注意缓慢加入，避免将刚贴壁的组织块吹起，隔天观察细胞贴壁及生长状态，每隔5天更换完全培养基的2/3，每次更换时吸出脱壁的组织块，约两周迁出的细胞长满瓶底后，进行传代培养；

（3）传代培养：原代培养细胞以组织块为中心形成细胞集落，充分增殖、细胞数目增多后，各个组织块间的细胞集落相互接触相连，从而使整个瓶底细胞连成单层的一片，以0.25%的胰酶短暂消化细胞，迅速吸出，加入培养基吹打使细胞悬浮，以一瓶传两瓶的方式进行传代；根据细胞生长状态，5-7天可传代一次；传至第30代时，细胞基本生长稳定，可以进行相关生理数据的测定；如果不需要细胞继续快速繁殖，那么可以将完全培养基中血清含量减为总体积的15%；

（4）不同形态细胞系的分离：组织块接种时，各种类型和形态的细胞接种在同一环境中，随着细胞贴壁扩繁，逐步呈现出两种形态的细胞：一种为梭形上皮样细胞，细胞增殖快，贴壁能力较弱；一种为鹅卵石形上皮样细胞，细胞增殖相对慢，但贴壁能力强，附着相对牢固，依据二者的不同的贴壁附着特性，通过消化时间差异化处理，逐步将两种细胞分离，至第三代已经完全分离，至此，形成了两个红鳍东方鲀雌性卵巢细胞系，即TSOC1和TSOC2。

以构建红鳍东方魨卵巢细胞系的冻存、复苏及细胞生长曲线绘制：

（1）细胞的冻存：细胞培养传代过程中时刻警惕污染，为防止污染传递造成的前功尽弃，要及时的冻存细胞。取处于指数生长期的、细胞密度大于80%，传代20代以上的各代细胞进行冻存，加入1.5ml0.25%胰蛋白酶使其能够完全覆盖25cm²的细胞培养瓶底，短暂消化45s-1min，吸去消化液，用完全培养基将细胞吹打悬起，可轻轻振荡敲打培养瓶，使细胞脱壁。15ml离心管收集细胞，2000g,离心2min，用预冷约4℃的冻存液（含10%二甲基亚砜的性腺细胞完全培养基）悬浮细胞，使细胞密度达到约3×10⁶个/ml，移至冻存管，4℃放置1h，-80℃放置8h，然后移至液氮中保存，并做好相关记录。

（2）细胞的复苏：自液氮中取出保存的冻存管迅速置于37℃水浴中融化，2000g离心5min，弃上清，加10倍体积的细胞培养基清洗冻存液，离心，弃上清，用完全培养基悬起细胞，转移至培养瓶中，放置于培养箱中24℃培养，待细胞贴壁后及时更换新的细胞培养基，避免残留冻存保护液对细胞的慢性伤害。

（3）细胞生长曲线绘制：为了监测红鳍东方鲀卵巢细胞系TSOC1和TSOC2的生长情况，确定红鳍东方鲀卵巢细胞系的最适生长条件取第30代细胞接种于12孔板，每板6孔，每孔2×10⁵个细胞，将12孔板分别置于10℃，20℃，25℃，30℃的培养箱中培养，另四个同在24℃下，但分别在添加5%、15%、20%、25%胎牛血清的完全培养液中培养。第三组在24℃培养温度，15%的胎牛血清浓度下，分别在培养基pH为6.5,7.0,7.6,8.0的环境下培养，在接种后的第1，2，3，4天，取各12孔板的任意3孔以0.25%胰蛋白酶消化，将细胞悬起，细胞计数板计数，制成如图2所示的图。

一种红鳍东方魨卵巢细胞系在鱼类病毒增殖方面的应用，其具体步骤方法如下，

（1）首先检测如上所述构建的两个红鳍东方鲀雌性卵巢细胞系，即TSOC1和TSOC2对牙鲆淋巴囊肿病毒（LCDV）和大菱鲆虹彩病毒（TRBIV）的敏感性，

用分离出的牙鲆淋巴囊肿病毒（LCDV）和大菱鲆虹彩病毒（TRBIV）分别感染传代45代的TSOC1和TSOC2细胞,将病毒悬液注入细胞培养基中作用1h，之后将含病毒的培养基吸出，更换新的培养基。感染后每隔12h观察细胞病变效应（CPE），并用NikoneclipseTE2000-U显微镜观察照相。从照片可以看出，牙鲆淋巴囊肿病毒（LCDV）和大菱鲆虹彩病毒（TRBIV）在感染TSOC1和TSOC2细胞后均表现出明显的细胞病变效应（CPE），大菱鲆虹彩病毒（TRBIV）对TSOC1和TSOC2更为敏感，如图3所示；36h后，部分细胞开始脱壁，此时收集感染的TSOC1和TSOC2细胞，一份用来提取DNA，通过大菱鲆虹彩病毒（TRBIV）主要衣壳蛋白的特异性引物：MCPTRBIVF(5’-CGTGTTAAGATCCCCTCC-3’)和MCPTRBIVR(5’-TCTCGTAAATGAGTGACACC-3’)，以及牙鲆淋巴囊肿病毒（LCDV）主要衣壳蛋白特异性引物(F：5’-CCGTTGATTCCAATGGTCA-3’；R：5’-CACCGTCAAAGATTACAGGAG-3’)进行PCR扩增，并用琼脂糖电泳检测特异性表达的条带。感染牙鲆淋巴囊肿病毒的扩增产物中特异性的条带大小为490bp，而感染大菱鲆虹彩病毒（TRBIV）的特异性条带出现在780bp，如图4所示；这二个结果都间接证明了病毒颗粒侵入到了TSOC1和TSOC2细胞中。另一份感染的TSOC1和TSOC2细胞经2.5%的戊二醛和锇酸固定，用酒精脱水，环氧树脂812包埋，超薄切片后，醋酸铀染色，透射电镜观察并照相，通过照片可以清楚的看到两种病毒颗粒出现在TSOC1和TSOC2细胞胞质中，检测两种病毒颗粒的存在，从而间接证明病毒颗粒侵入两种细胞中，短箭头表示大菱鲆虹彩病毒电泳条带，长箭头表示牙鲆淋巴囊肿病毒电泳条带，如图4所示，直接的证明了TSOC1和TSOC2细胞对两种病毒是敏感的；

（2）将已被证明对牙鲆淋巴囊肿病毒（LCDV）和大菱鲆虹彩病毒（TRBIV）敏感的TSOC1和TSOC2细胞应用于两种鱼类病毒增殖及扩繁的技术领域中，通过TSOC1和TSOC2细胞对牙鲆淋巴囊肿病毒（LCDV）和大菱鲆虹彩病毒（TRBIV）敏感的特性，两种鱼类病毒在两种细胞中的大量增殖直接证明了两种细胞系在病毒增殖和扩繁中的应用价值，同时也为探寻两种鱼类病毒与宿主细胞间相互作用的分子机制奠定基础。

一种红鳍东方魨卵巢细胞系在转基因研究中的应用，其具体步骤方法如下，

（1）首先检测如上所述构建的两个红鳍东方鲀雌性卵巢细胞系，即TSOC1和TSOC2是否可转染pEGFP-N3并表达，

将第30代的TSOC1和TSOC2细胞以2×10⁵/孔的密度接种于六孔板中，25℃培养。细胞贴壁稳定，密度达到70%以上时可以转染。尝试以Invitrogen公司的Lipofectamine2000转染pEGFP-N3。具体步骤：将10ul Lipofectamine2000加入到包含240ul基础MEM培养基（不含血清）的1.5ml的离心管中，另一个离心管中加入20ulpEGFP-N3（100ng/ul）和230ul不含血清的MEM。静置一刻钟后，将上述两管溶液混合，室温放置30min。500ul混合液加入到包含2.5ml MEM（不含血清）的六孔板之一孔中，24℃培养8h，然后，将培养基替换为正常包含血清的培养基。24h后，通过Nikon ECLIPSE TE2000-U荧光显微镜可以观察到绿色荧光的表达，如图5所示。

（2）根据TSOC1和TSOC2可转染pEGFP-N3并表达的特性，将上所述构建的两个红鳍东方鲀雌性卵巢细胞系TSOC1和TSOC2应用于转基因技术领域，GFP基因在两种细胞中的表达揭示了细胞两种的可转染性，对未来相关功能基因的在两种细胞中的转染表达具有重要意义。

Claims (5)

1.一种红鳍东方魨卵巢细胞系体外构建方法，其特征在于步骤如下： 

(1)原代细胞培养液的制备：具体步骤包括： 

①基础培养基制备：1000mlMEM和L-15培养基以2:1混合后的基础培养基，称取2.38gHepes，溶解于超纯去离子水中，磁力搅拌混匀后，调节pH在7.5，然后抽滤灭菌后，为基础培养基； 

②红鳍东方鲀卵巢细胞完全培养基的制备：将占总体积20％的胎牛血清、1％的大菱鲆血清、占总体积0.1％的2-巯基乙醇、2ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子、1ng/ml白血病抑制因子、1nmol/L的丙酮酸钠及1nmol/L的谷氨酰胺加入到基础培养基中，由此制成红鳍东方鲀卵巢细胞完全培养基； 

(2)原代培养：具体步骤包括： 

①试验鱼选取：选取鱼龄为一年的体重约500g的健康雌性红鳍东方鲀； 

②试验鱼暂养：用含1000单位/毫升的青霉素和1000单位/毫升链霉素过滤消毒海水，用无菌海水暂养停止投喂的实验鱼，待实验鱼停止排遗达24h以上时，用捞网迅速将红鳍东方鲀取出置于75％酒精中浸泡2min； 

③卵巢获取及接种：将昏迷后的试验鱼在超净工作台中无菌解剖，取出卵巢，置于一次性的3.5cm培养皿中，PBS冲洗一次，70％酒精浸泡消毒3min后，PBS冲洗两次，用无菌眼科剪将性腺组织剪成大约1cm³及以下的小块；然后用0.75％的胰酶将剪碎组织块消化15分钟，PBS冲洗，过滤组织块，用无菌的200ul移液器吸头轻轻的吸取组织块，接种在25cm²的培养瓶中，接种时要均匀，尽量使多的组织块布满瓶底，平均每瓶中接种数量为5×6＝30块； 

④原代培养：将培养瓶翻转，加入完全培养基2ml，倒置于24℃培养箱中培养，3h组织块贴壁后，轻轻翻转培养瓶，将培养瓶正置，轻晃培养瓶，使各组织块浸到培养液中，24h后补加完全培养液至4ml，隔天观察细胞贴壁及生长状态，每隔5天更换完全培养基的2/3，每次更换时吸出脱壁的组织块，约两周迁出的细胞长满瓶底后，进行传代培养； 

(3)传代培养：原代培养细胞以组织块为中心形成细胞集落，从而使整个瓶底细胞连成单层的一片，以0.25％的胰酶短暂消化细胞，迅速吸出，加入培养基吹打使细胞悬浮，以一瓶传两瓶的方式进行传代；根据细胞生长状态，5-7天可传代一次；传至第30代时，细胞基本生长稳定，进行相关生理数据的测定； 

(4)不同形态细胞系的分离：组织块接种时，随着细胞贴壁扩繁，逐步呈现出两种形态 的细胞：一种为梭形上皮样细胞，另一种为鹅卵石形上皮样细胞，依据二者不同的贴壁附着特性，通过消化时间差异化处理，逐步将两种细胞分离，至第三代完全分离完成，形成两个红鳍东方鲀雌性卵巢细胞系，即TSOC1和TSOC2。 

2.根据权利要求1所述的红鳍东方魨卵巢细胞系体外构建方法，其特征在于：所述步骤 (2)中③卵巢获取及接种的剪组织过程中滴加一滴完全培养基润湿组织块，防止组织在培养皿中干涸。 

3.根据权利要求1所述的红鳍东方魨卵巢细胞系体外构建方法，其特征在于：所述步骤(3)传代培养中如果不需要细胞继续快速繁殖，可以将完全培养基中血清含量减为总体积的15％。 

4.一种红鳍东方魨卵巢细胞系在鱼类病毒增殖方面的应用，其特征在于步骤如下， 

(1)首先检测上述权利要求1中第(4)步所述的两个红鳍东方鲀雌性卵巢细胞系，即TSOC1和TSOC2对牙鲆淋巴囊肿病毒和大菱鲆虹彩病毒的敏感性； 

(2)将上述权利要求1中第(4)步所述的两个红鳍东方鲀雌性卵巢细胞系TSOC1和TSOC2细胞系应用于鱼类病毒增殖及扩繁技术领域中。 

5.一种红鳍东方魨卵巢细胞系在转基因研究中的应用，其特征在于步骤如下， 

(1)首先检测上述权利要求1中第(4)步所述的两个红鳍东方鲀雌性卵巢细胞系，即TSOC1和TSOC2对转染pEGFP-N3的表达； 

(2)将上述权利要求1中第(4)步所述的两个红鳍东方鲀雌性卵巢细胞系TSOC1和TSOC2应用于转基因研究技术领域。