CN1070381C - 犬用口服狂犬病疫苗及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株犬用口服狂犬病疫苗病毒株，其分离和培育的方法，以及利用该毒株作为疫苗毒种大规模工业化生产犬用口服狂犬病疫苗的方法。该疫苗经口服途径免疫家犬后，可有效地防止家犬染患狂犬病，借以阻断犬－人之间的感染途径，进而阻止狂犬病的大面积流行。

Description

犬用口服狂犬病疫苗及其生产方法

本发明涉及狂犬病疫苗，特别是涉及采用口服途径免疫犬的狂犬病疫苗，制备该疫苗的病毒株的方法，及以该病毒株为毒种，生产犬用口服狂犬病疫苗的方法。

狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的人畜共患的烈性病毒性疾病，目前尚无特效治疗措施，一经感染发病，死亡率几乎达百分之百。

中国自本世纪六十年代以来，狂犬病的发病率不断上升，三十年来累计死亡总数已达15万人。家畜(马、牛、羊、猪、梅花鹿等)患狂犬病死亡，每年以千计。狂犬病不仅威胁人民健康，危及生命，而且给国际往来、旅游开发、农牧业发展以及公共卫生等带来严重影响。

世界上很多国家，如瑞典、葡萄牙、英国和日本等国已消灭了狂犬病，但在发展中国家(合中国)通过家犬传播而患狂犬病者占患病总人数的95％。狂犬越多，狂犬病患例也相应增加。瑞士、加拿大等国由于采取对动物接种疫苗等综合性防治措施，已基本控制了狂犬病的流行。据联合国粮农组织(FAO)报告，目前全世界有87个国家存在狂犬病，而且大部分属于发展中国家。这些国家的狂犬病死亡人数，占全球狂犬病例总数的99％。中国每年被狂犬咬伤及狂犬病死亡人数仅次于印度，居世界第二位。国外经验表明，当狂犬病在一特定地区连续流行时，强调以控制动物传染源作为基本预防措施。有人曾报道用口服疫苗免疫狐狸(参见G、M、Baer et al.,Deve1op.BioL.standar.33:417,1976)，但涉及家犬口服狂犬病疫苗的研究尚未见报道。

在中国，家犬注射狂犬病疫苗已收到一定成效(参见黑龙江省绥化地区卫生防疫站等：生物制品通讯9(2):59,1980：郭一德等：家畜传染病4:21、1984)，然而以胃肠道外途径(如肌肉注射)大量免疫家犬，需动员和组织大量人力，而且在实际操作中咬伤防疫人员的事例屡有发生。因此，迫切需要开发一种使用方便、能有效地预防犬的狂犬病病毒感染，以切断犬——人之间狂犬病传播途径，从而有效地预防人狂犬病的新型狂犬病疫苗。

本发明的一个目的是提供一种制备犬用口服狂犬病减毒活病毒株的方法，该方法包括从死于狂犬病患者尸体的新鲜脑组织中分离到狂犬病病毒，在小鼠脑内连续50-60代，获得毒力明显降低但免疫原性良好的疫苗毒株，然后将此毒株转移到人胚肺二倍体细胞株中连续传40-50代，再回传到小鼠脑内传2-10代，即得到本发明的犬用口服狂犬病疫苗毒株，该毒株定名为22号毒种。本发明属于利用上述一系列实验室微生物学方法获得毒株。

本发明的另一个目的是提供一株减毒的活狂犬病病毒株，该株已于1993年2月22日保藏在中国典型培养保中心(CCTCC)，其保藏登记号CCTCC NO V94001。

本发明的再一个目的的提供一种以本发明的22号毒种作为犬用口服狂犬病疫苗的毒种，大规模生产该疫苗的方法。该方法包括将毒种稀释后接种于小鼠脑内，体内培养5-7天，待小鼠典型发病后，以无菌手续解剖取脑，研磨成脑悬液，加入适当保护剂后，真空冷冻干燥。

本发明的再一个目的是提供一种经口服途径免疫犬，使之免于染患狂犬病的免疫方法。该方法包括将预防狂犬病有效量的本发明犬用口服狂犬病疫苗混入半流质食物中喂饲处于饥饿状态的被免疫犬。

I、犬用口服狂犬病疫苗毒株的制备

解剖典型狂犬病患者尸体，取脑组织以无菌手续研成组织匀浆，并以2％牛血清蒸馏水为稀释液，制成10％脑悬液。取上清液0.03ml脑内注射小鼠，待典型发病后，解剖取脑，制成脑悬液后，再次脑内注射小鼠，如此连续传50-60代。小白鼠脑内接种后至出现典型症状之间的潜伏期，由于传代数目的增加，潜伏期相应缩短，第1-5代为11-14天，传至第46-53代时，潜伏期缩短为5-6天。皮下接种毒力随着脑内传代数增加，由大约4.20递减至大约1.50，最终获得脑内毒力稳定在5.5至6.34(LogLD₆₀)的减弱毒株，(是指该毒株在培育适应过程中定名为“22号”毒株之前的毒力范围)。

为了进一步培育适合制备犬用口服狂犬病疫苗的毒株，将上述小鼠脑组织内适应的51-53代毒株，转移至人胚肺二倍体细胞株KMB-17(中国医学科学院医学生物学研究所，昆明)，传至第47代后，再回传小鼠脑组织内传2-10代，即得到定名为22号毒种的犬用口服狂犬病疫苗毒种。

将按上述方法获得的22号毒种，制成5％小鼠脑悬液，给1个月龄小狗一次口服4ml，口服前血清抗体为阴性，口服后1个月，抗体阳转率达到90％，抗体滴度达1∶16-1∶32。

Ⅱ、犬用口服狂犬病疫苗的工业化生产

首先取22号毒种，作为毒种种子液，用2％小牛血清蒸馏水稀释成1∶200，脑内接种体重11-13克小鼠，每只接种量0.03ml(相当5000LD₅₀病毒量)，体内培养5-7天。经潜伏期后选择出现典型狂犬病症状的小鼠，以1‰新洁尔灭浸泡洗涤3次，进行皮毛消毒，每次不少于15分钟。然后以无菌手续解剖小鼠取脑，用电动组织研磨器以每分钟1万转的速度将无菌小鼠脑研磨成匀浆，然后加入2％牛血清蒸馏水，制成5％小鼠脑悬液。取样滴定病毒毒力不得低于原病毒株LogLD₅₀≥6.0加入50％(V/V)脱脂牛乳作为冻干保护剂，分装后经冷冻真空干燥成品，于-10℃保存，有效期1年。

Ⅲ、口服免疫方式

向上述工业化生产的疫苗(冻干制品)内加入4ml灭菌蒸馏水，待疫苗充分均匀悬浮后，倒入已煮熟并冷却的糊状或半流质食物，如玉米粥或大米粥内搅拌，使疫苗与食物充分混匀后喂家犬，并须一次喂完。为了避免不能一次吃完，可在喂疫苗前一天，给家犬适当造成饥饿状态，以达到一次喂苗成功。

国外加拿大等国，研制的狐用口服狂犬病疫苗，将疫苗封熔于塑料片，插入熏鸡头内，或嵌入香肠内作为诱饵。为适合中国农村实际情况，必须寻找一种既方便又经济的喂食方式，我们经过反复摸索，最终确定为每只犬喂4ml(1.3亿LD₅₀)剂量及拌食为最佳方式。在服苗后1个月，家犬的血清抗体阳转率可达90％以上，1-6个月抗体滴度(GMT)保持在1∶42-1∶76，至免疫后15个月仍达1∶34以上。

迄今为止，我们已使用按本发明方法工业化生产的犬用口服狂犬病疫苗，在中国狂犬病流行地区(福建省莆田县、广西壮族自治区玉林县、吉林省农安县)1985-1986年连续2年共口服免疫家犬19196只，以进行流行病学效果观察。其中免疫组包括2个乡，对照组包括2个乡。免疫乡于口服免疫后83天，因一外来狂犬窜入，咬伤已口服免疫犬7只，观察1年7只被咬犬均未出现任何狂犬病症状，同期内咬伤未免疫猪1头，后来发生狂犬病导致死亡。所有免疫乡家犬在免疫后观察1年，未见狂犬病发生。相反，对照乡则发现染患狂犬病家犬20只。继续观察10个月，对照乡出现狂犬37只。上述观察结果表明用本发明的犬用口服狂犬病疫苗给家犬免疫可显著降低家犬狂犬病发病率。

Ⅳ、犬用口服狂犬病疫苗的安全性

上述流行病学的有效观察，为了检验该疫苗不同地域条件对疫苗效果的影响，效果观察的地区包括中国狂犬病流行区的东北吉林省及华南地区的广西、福建。合计观察19425只家犬除了证明其流行病学效果外，亦未发现不安全问题。服用本发明口服疫苗的家犬，在不圈不拴自由放养的情况下，服苗犬与其它犬、猪、羊等家畜、家禽(鸡、鸭、鹅)频繁接触中，如抢食猪的食物等，未发现疫苗毒株接触感染非服苗动物。对初生1月龄乳犬，口服疫苗后，7只乳犬观察6个月，所有被观察的乳犬全部安全存活，未发现任何狂犬病症状。10只成年家犬在口服本疫苗后1、2、3、天用棉拭从口腔取粘膜部位分泌物，未分离到病毒。

综上所述，用本发明的犬用口服狂犬病疫苗，在中国狂犬病流行地区，经1985-1987年三年观察结果表明，能降低当地犬间狂犬病发病率，从而阻断犬→人感染狂犬病，这对控制狂犬病的流行将起重要作用。

实施例：

1、1985年3月将22号毒种鼠脑，以无菌手续研磨后稀释成1∶2000(稀释液：2％牛血清灭菌蒸馏水)接种体重11-13克小鼠495只，脑内接种量0.03ml。5-7天选择发病症状典型、濒死的小鼠，以无菌手续取脑，共收获无菌鼠脑450个，电动组织研磨器研磨后加入稀释液1800ml，再加入无菌脱脂牛乳1800ml，分装于青霉素小瓶，每瓶装4ml，共分装900瓶，即900头份犬用口服狂犬病疫苗。取样进行病毒滴度测定，结果为LogLD₅₀6.5/0.03ml。批号8503。

2、1985年6月18日在广西壮族自治区玉林市进行家犬口服免疫。免疫2个乡，对照观察2个乡。免疫家犬共4456只(含8503批)，对照乡观察家犬3080只。免疫乡于口服免疫后83天，一外来狂犬窜入，咬伤已免疫犬7只，观察1年未出现任何症状，同时咬伤猪1头，后发狂犬病。免疫乡在免疫后一年内，无狂犬病发生。免疫后1年，内对照乡及外对照乡分别发生狂犬11只、9只，说明口服免疫对犬起到降低狂犬病发病率作用。

Claims (6)

1、制备犬用口服狂犬病疫菌毒种的方法，该方法包括从死于狂犬病患者尸体的新鲜脑组织中分离到狂犬病毒，通过小鼠脑内连续传50-60代，然后将此毒株转移到人胚肺二倍体细胞株KMB-17中连续传至40-50代，再回传小鼠脑内传2-10代。

2、一株按权利要求1所述方法制得的命名为“22号毒种”的犬用口服狂犬病减毒活病毒株，其保藏登记号为CCTCCNOV94001。

3、根据权利要求1的犬用口服狂犬病病毒株，其脑内毒力稳定在LogLD₅₀5.5至6.0。

4、生产犬用口服狂犬病疫苗的方法，该方法包括将按权利要求1所述方法制备的犬用口服狂犬病毒毒种稀释后接种于小鼠脑内，体内培养5-7天，典型发病后解剖取脑，研磨成脑悬液，加入适当保护剂后真空冷冻干燥。

5、根据权利要求4的方法，其中所得小鼠脑组织悬液的病毒应不低于原病毒株的毒力LogLD₅₀≥6.0。

6、根据权利要求4的方法，其中所说的保护剂50％(V/V)脱脂牛乳。