CN1178674C - 沙门菌属抑制组合物 - Google Patents
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Abstract
沙门菌抑制组合物，其有效成分为：用含有蔗糖的培养基使属于明串珠菌(Leuconostoc)属、链球菌(Streptococcus)属、链杆菌(Streptobacterium)属的乳酸菌发酵，得到的发酵液自身，或者是用水混合性有机溶剂进行分级沉淀处理后，由所得上清而来的制备物。
Description
技术领域
本发明涉及包含以来自乳酸菌发酵液的成分作为有效成份的沙门菌属抑制组合物。更具体地讲，本发明涉及可作为用于预防或治疗沙门菌属感染的饲料添加剂、医药或保健食品的组合物。
背景技术
动物出生后至幼年期，甚至到成体，常由于环境的变化而造成沙门菌属感染。作为对策，人们试着用抗生素等药品，疫苗，各种生菌剂[例如，链球菌(Streptococcus)、乳酸杆菌(Lactobacillus)属菌球的增殖物，沙门菌属的竞争性排除法(competitiveexclusion：CE剂)等]，使病原菌凝集而抑制其附着于肠壁的甘露糖(糖的一种)或保健食品寡糖等进行预防。
但是，这些方法中，抗生素有这样一些问题：容易产生抗菌性，清除生物体内发挥有利作用的正常菌群，抗生素移行、残留到加工的畜产物中等问题(《饲料添加物在畜产物中的残留》畜产手册，姬野健太郎等编著，讲谈社，1984，pp.484-485)。
疫苗的问题是：只对特定的病原菌有效，并且效果的持续时间也有限(《日本的畜产业》，预测日本畜产业的最新手册，チクサン出版，1989，pp.21～35)。
各种生菌剂要冷藏保存，保存时间也短，价格高，除此之外，有必要大量施用给要建立肠内菌群的动物。
使病原菌凝集而抑制其附着于肠壁的甘露寡糖能使48％的病原性沙门菌属凝集，抑制其肠壁附着，但问题是对残余的病原性沙门菌属无效。[清水干夫：甘露寡糖的特征和有用性，养鸡之友，6月，14～18(1996)]。
寡糖生息于动物的大肠，与其它细菌一起促进形成肠内菌群的双尾菌的增殖，虽然有抑制沙门菌属的效果，但价格高，且效果不确定。[例如，深田恒夫等，寡糖对鸡沙门氏菌的感染抑制效果，鸡病研报31，113～117(1995)]。
此外，这些抗生素，疫苗，各种生菌剂，凝集病原菌抑制其肠壁附着的甘露寡糖等寡糖，与其说它们自身不含有动物喜欢的香料成分，倒不如说由于它们含有动物讨厌的臭味，作为饲料添加剂有其不利之处。
如上所述，以往的技术中涉及沙门菌属抑制目的物质，起到一定的作用，但有异臭，不能提高动物对它们自身的嗜好性。所以，在作为饲料添加剂使用时，很难增大饲料的摄取量，增进动物的自身状态。
因此本发明的目的是提供具有沙门菌属抑制效果，同时提高动物嗜好的组合物。
发明的公开
本发明者们为了提供能改善或消除以往技术中所伴随的缺点的组合物，也就是说，提供对于沙门菌属感染的预防或治疗有效，且能提高动物嗜好性的组合物，进行了深入研究。结果发现从乳酸菌属的一定菌发酵液而来的制备物能达到上述目的，由此完成了本发明。
本发明提供沙门菌属抑制组合物，其有效成分是从明串珠菌(
Leuconostoc)属、链球菌(
Streptococcus)属及链杆菌(
Streptobacterium)属选择至少1种乳酸菌属的菌株，在含有蔗糖的营养培养基中发酵，由发酵液而来的制备物。
另外，本发明的其它方案是提供沙门菌属感染性疾病预防或治疗的方法，该方法包括将有效量的预防或治疗沙门菌属感染性疾病的上述发酵液来源的制备物施与受试动物。
再者，本发明的其它方案提供上述发酵液来源的制备物在制造动物沙门菌属感染症预防或治疗用组合物的有效成分中的使用。
附图简述
图1是实施例1中得到的本发明的制备物在所记载的液相色谱操作条件下所得到的色谱图。
实施本发明的最佳方式
本发明中用于发酵的乳酸菌，只要是遵从本发明的目的，上述菌属中任一种菌均可，具体而言，包括肠膜明串珠菌(
Leuconostoc mesenteroides)、葡聚糖明串珠菌(
Leuconostoc
dextranicum)、牛链球菌(
Streptococcus
bovis)、突变链球菌(
Streptococcus mutans)、血链球菌(
Streptococcus
sanguis)、及葡聚糖链杆菌(
Streptobacterium
dextranicum)。其中优选的菌是肠膜明串珠菌和牛链球菌。特别优选的菌是葡聚糖生产中应用的肠膜明串珠菌。可使用的具体菌株包括，例如可从美国模式培养库(ATCC)获得的肠膜明串珠菌(
Leuconostoc
mesenteroides)ATCC 10830(NRRLB-512)、葡聚糖明串珠菌(
Leuconostoc
dextranicum)ATCC 19255(NRRL B-3469)、牛链球菌(
Streptococcus
bovis)ATCC 33317(NCDO 597)、突变链球菌(
Streptococcus
mutans)ATCC 25175(NCTC 10449)、血链球菌(
Streptococcus
sanguis)ATCC 10556及葡聚糖链杆菌(
Streptobacterium
dextranicum)ATCC 13134(NRRL B-1254)等。上数菌株，在对多个菌株增殖及生理功能相互间不带来负面影响的情况下，可同时使用多种菌，但通常使用1种菌较适合。
能使上述菌发酵的含有蔗糖的营养培养基包含单独形式的蔗糖或者蔗糖作为一成分而包含在内的甘蔗属，甜菜榨汁后的渣，或者从甘蔗属、甜菜中制备砂糖时所产生的副产物-糖蜜、甜菜浆、甘蔗渣等作为蔗糖来源。除蔗糖以外向培养基中添加的成分是对动物基本上无害的物质或化合物，例如啤酒酵母提取物，蛋白胨，玉米浆，大豆蛋白，食盐，HCl，K2HPO4等。
本发明的发酵通常是在上述培养基灭菌后接种适当的乳酸菌，25℃左右，厌氧条件下进行培养。培养时间要根据所使用的菌、温度或培养基的组成有所变动，所以没有限定，但是乳酸菌有必要选择至少从对数增殖期到静止期时间段的时间，培养时间过短有可能获得对动物的沙门菌效果低的组合物。
如此从发酵液获得的本发明的沙门菌抑制组合物含有的有效成份是发酵液自身，或者是用水混和的有机溶剂对该发酵液进行沉淀，除去沉淀物后的上清或由之而来的制备物作为有效成分。因而本发明中所说的制备物就是前面所讲的发酵液自身或由发酵液而来的上清的浓缩物，后面所述的菌体去除物、及喷雾干燥物和冷冻干燥物等。得到上述的上清的通常适宜进行分级沉淀处理。进行分级沉淀处理时所应用的有机溶剂包括乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇等。进行分级沉淀处理时对应发酵液所应用的有机溶剂的量要根据所应用的有机溶剂的种类而进行最适量的变动，但使用乙醇时，通常1体积的发酵液对应0.7-4体积的有机溶剂。处理温度为15～35℃，优选环境温度。
进行上述分级沉淀处理的前后或同时可从发酵液中去除菌体，包含去除菌体的制备物的沙门菌属抑制组合物也由本发明提供。菌体的去除可通过过滤或离心进行。如此所得的制备物的优点是便于作为药品或保健食品使用，作为饲料添加剂使用时也使用容易(例如，有效成分的均质配合等容易)。
如从上面的叙述可理解的，在本发明的组合物中作为有效成分所使用的来自上清的制备物是葡聚糖发酵副产物本身，或必要时除去菌体，再进行脱盐，除去有机溶剂后，浓缩为7～17倍的纯化浓缩物形式的物质，而以往制备葡聚糖时，不可避免的是它们作为副产物不被利用而直接被废弃，所以该物质极为廉价。上述上清按使用的有机溶剂的种类或使用量，可提供基本上不含葡聚糖的物质，这样的上清也可达到本发明所预期的目的。
本发明可提供，例如将上述制备物以液状或浆状(浓缩物)单独溶解于水、生理盐水溶液中的溶剂，或者与药用赋形剂或载体或饲料原料配合的组合物。另外也可提供将液状或浆状制备物与医药领域和饲料领域常用的颗粒化或固形化试剂，如与颗粒状葡萄糖、无水硅酸、壳物渣、面包屑、大豆渣、麸皮、可可豆皮等，配合的固形组合物。固形组合物的制备是将上述液状或浆状制备物进行冷冻干燥或喷雾干燥，或者将这样制备的干燥物与上述颗粒化试剂或者其它在医药、饲料领域内常用的赋形剂混合，制成本发明的沙门菌属抑制组合物。以上的调配、配合及混合法可根据剂型使用本身已知的方法。
依照本发明，不受什么拘束，按照下面的作用程序就可推测出能达到目的效果的物质。将上述乳酸菌接种到蔗糖含有组合物中，培养时，蔗糖的构成糖葡萄糖和果糖中，葡萄糖聚合形成葡聚糖，另一方面，产生果糖的情况是在不同情况下，果糖在果糖基转移酶的作用下聚合，以寡聚或多聚果糖的形式存在。此外，菌产生以乳酸、香味成分物质为代表的各种物质，所以能形成含有多种成分的发酵汤，推测多种成分中包含乳酸、果糖、甘露糖醇、明串珠菌二糖、用于发酵的乳酸菌菌体、及其它成分。该发酵液如上用有机溶剂进行分级沉淀处理后，上清部分中估测含有上述乳酸和香味成分，果糖、甘露糖醇、明串珠菌二糖、葡聚糖、寡聚多聚果糖、其它的培养液成分、以及不同情况下发酵中应用的乳酸菌菌体，所以可很便利地提供本发明的制备物。可以推测，这些成分组合起来无害，提高动物的嗜好性，并且在鸡的沙门菌属攻击试验中降低粪便的pH、有肠粘膜侵袭的抑制效果及沙门菌属定居抑制效果，并且在热应激中通过死亡率的抑制作用和降低粪便pH作用，增加动物的体格状态，发挥生产出无沙门菌的鸡蛋、肉、牛奶的优良效果。
本发明的沙门菌属抑制组合物中所包含的作为有效成分的制备物的使用比率要根据使用目的进行变动，例如按药用、保健食品用或饲料添加物用时最适量有所变动，其量不能限定，但是该领域的专业人员可参照后述的实施例中的作用效果进行决定。一般情况下，例如用作配合饲料添加物，使用浓缩了12倍的浓缩物时，占总组合物重量的0.01～10.0％重量，优选0.05-5.0％。
所讲沙门菌属抑制组合物可用于鸡及火鸡等家禽，以及牛、马、猪、狗、猫等家畜或宠物，其它动物、人中沙门菌属感染的预防或治疗，并且有增进饲料摄取量的作用。
以下通过实施例对本发明的沙门菌属抑制组合物进行更具体地说明，但本发明并不限定于此。
实施例1：以蔗糖为主原料时上清液浓缩物的制备
将乳酸菌中的肠膜明串珠菌(
Leuconostoc
mesenteroides)ATCC10830(NRRL B-512)接种到以蔗糖为主原料的具有下述组成的培养基中，25℃、24小时，厌氧条件下发酵后，向1体积的发酵液加入1体积的乙醇，收集其上层澄清液。将上清液过滤，除去菌体，约80℃、减压下(540～580mmHg)下除去乙醇，将液量浓缩到约1/12，制备出上清液的浓缩物。所制备的浓缩物的性状和液相色谱图(参照图1)如下。
培养基的组成：
蔗糖 15.01％
磷酸氢二钾 0.5％
啤酒酵母提取物 0.2％
pH 7.0
浓缩物的性状：
外观 淡褐色至褐色粘稠液
香味 有酸甜香味，无异味臭味
糖度(Bx) 65°
pH 5.4
干燥减重 31.6％
果糖 42.0％
寡糖* 23.2％
*从图1的结果预测包含明串珠菌二糖、甘露糖醇、寡聚至多聚果糖及葡聚糖。
液相色谱的操作条件(对应图1)：
上样量：2.0(重量/体积)％液80μl
柱：G2000PW×2(东ン一社)
洗脱液：0.1M NaCl水溶液
流速：1.0ml/分
温度：25℃
压力：90kg/cm2
检测器：RI×1
纸速：0.5cm/分
实施例2：以糖蜜为主原料时上清液浓缩物的制备
将乳酸菌中的一种牛链球菌(
Streptococcus
bovis)ATCC 33317(NCDO 597)接种到向1体积糖蜜中加入2体积蒸馏水的如下组成的培养基中，25℃、24小时，厌氧条件下发酵后，向1体积发酵液中加入1体积乙醇，收集其上层澄清液。将上清液过滤除去菌体，80℃、减压下(540-580mmHg)去除乙醇，将液量浓缩到1/12左右，制备出上清液的浓缩物。所制备的浓缩物的性状和用液相色谱进行的测定值如下。
培养基的组成：
糖蜜： 15.0％
磷酸氢二钾： 0.1％
pH 6.2
浓缩物的性状：
外观 淡褐色至褐色粘稠液
香味 有酸甜香味，无异味臭味
糖度(Bx) 62°
pH 5.2
干燥减重 33.5％
果糖 39.6％
寡糖 22.9％
实施例3：以上清液的浓缩物为原材料制备混合饲料
使用颗粒状葡萄糖(グルフアイナル、日本资粮工业社)作为粉末化试剂，向其9kg中加入1kg实施例1中制备的浓缩物，用横形浆式混合机混合5分钟，制备出混合饲料。所制备的混合饲料(也叫做组合物)的性状如下。
外观 淡黄色粉末
香味 有甜酸香味、无异味臭味
干燥减重 9.5％
葡萄糖 79.0％
果糖 4.0％
寡糖 2.5％
实施例4：以上清液的浓缩物为原材料制备混合饲料
使用硅酸(和光纯药工业社制)作为粉末化的赋形剂，向其9kg中加入1kg实施例2中制备的浓缩物，用横型浆式混合机混合5分钟，制备成混合饲料。所制备的混合饲料(也叫做组合物)的性状如下。
外观 淡黄色粉末
香味 有甜酸香味、无异味臭味
干燥减重 9.1％
硅酸 80.5％
果糖 4.2％
寡糖 2.8％
实施例5：采卵鸡种·沙门菌属定居抑制试验方法：用初日龄的白色来享鸡(♂)，30只一组分3组。
1)对照组：给予实验用幼雏饲料，直到实验终了
2)组合物组：从孵化日开始到实验终了，给予添加了0.3％实施例3组合物的饲料
3)CE剂组：按说明书溶解生菌剂中的CE剂*，于初日龄强制给予0.2ml
*鸡盲肠内容物培养饲料
1周龄时给所有的鸡经口施予肠炎沙门氏菌(S.enteritidis食物中毒由来的噬菌体型ファ一ジタイプ4型)约107个。
施用肠炎沙门氏菌的第2天、1周后和2周后进行解剖检查，检查1g盲肠内容物中的肠炎沙门氏菌数。
结果：1g盲肠内容物中肠炎沙门氏菌数(表-1)
给予肠炎沙门氏菌的第2天，组合物组与对照组相比，肠炎沙门氏菌的数目约减少2级(オ一ダ一)，统计学上有显著性差异。
给予肠炎沙门氏菌后第7天，组合物组与对照组相比，肠炎沙门氏菌数目显著性减少。
给予肠炎沙门氏菌后第14天，各组中分离出的菌数均减少。
表-1 给1周龄的雏鸡施用肠炎沙门氏菌时1g
盲肠内容物中的肠炎沙门氏菌数
| 处置方法 | 肠炎沙门氏菌施予后的天数 | ||
| 1日 | 7日 | 14日 | |
| 对照组 | 5.20±0.33a)(10/10)b) | 3.86±0.68(8/10) | 2.19±0.91(5/10) |
| 组合物组 | 3.53±0.80(9/10) | 1.42±0.73*(3/10) | 0.49±0.49(1/10) |
| CE剂组 | 4.63±0.40(10/10) | 3.69±0.70(8/10) | 1.55±0.68(4/10) |
*P＜0.05
a)：肠炎沙门氏菌数对数值均值±标准误差
b)：肠炎沙门氏菌阳性鸡数/所用鸡数
*：5％的显著水平，与对照组比有显著的差异
实施例6：肉用仔鸡·沙门菌属攻击试验
方法：1周龄的肉用仔鸡(Arbor Acres)，1组30只，准备2组，进行如下分组、处置。
1)对照组：给予肉用仔鸡用饲料，直到实验终了
2)组合物组：给予添加了0.3％实施例3中组合物的肉用仔鸡用饲料，直到实验终了
两组从1日龄～19日龄，均是自由摄取配合饲料和水，分别于第13日、第18日经口给予肠炎沙门氏菌，次日解剖，测定肠粘膜的侵袭程序和盲肠粪的pH。
结果：1)肠粘膜的侵袭(表-2)
14日龄，经肠炎沙门氏菌攻击后，对照组中26/30只(86.6％)、组合物组中15/30只(50％)。
19日龄，经肠炎沙门氏菌攻击后，对照组25/30只(83.3％)，组合物组16/30只(53.3％)。
14日龄，19日龄时，与对照组相比组合物组均能显著性抑制肠粘膜的侵袭。
2)盲肠粪的pH(表-3)
14日龄，经肠炎沙门氏菌攻击，对照组为6.5±0.3，组合物组为5.6±0.2。
19日龄时，经肠炎沙门氏菌攻击，对照组为6.6±0.5，组合物组为5.7±0.3。
与对照组相比，组合物组于14日、19日龄均能显著性降低盲肠粪pH。
表-2 肠粘膜的侵袭
| 投与组 | 攻击菌 | 14日龄 | 19日龄 |
| 对照组 | 肠炎沙门氏菌 | 26/30只(86.6％) | 25/30只(83.3％) |
| 组合物组 | 肠炎沙门氏菌 | 15/30只*(50.0％) | 16/30只*(53.3％) |
*P＜0.05
表-3 盲肠粪的pH
| 投与组 | 攻击菌 | 14日龄 | 19日龄 |
| 对照组 | 肠炎沙门氏菌 | 6.5±0.3 | 6.6±0.5 |
| 组合物组 | 肠炎沙门氏菌 | 5.6±0.2* | 5.7±0.3* |
*P＜0.05
实施例7：鸡·沙门菌属攻击时死亡率的改善效果方法：体重40g左右的鸡，1组45只，用3组，进行如下分组、处置。
1)对照组： 给予鸡用饮料直至实验终了
2)组合物组： 给予添加了0.1％实施例3中组合物
(添加0.1％) 的鸡用饲料，直至实验终了
3)组合物组： 给予添加了0.3％实施例3中组合物
(添加0.3％) 的鸡用饲料，直至实验终了
3组是在实验开始10日后经口给予2.7×1011CFU的肠炎沙门氏菌，2、4、6周后检测粪便中的沙门菌数。
观察6周后的死亡率及便的pH(6只)。
另外，从实验开始到结束的6周期间，3组均是自由摄取上述饲料和水。
结果：1)粪便中的沙门菌数：
6周后粪便中的沙门菌数是：对照组2、4、6周后为0.95、0.34、0.20×10，组合物组(0.1％添加)2、4、6周后为0.6、0.29、0.10×10，组合物组(0.3％添加)2、4、6周后为0.48、0.21、0.00×10，具有抑制倾向。
2)死亡率：
6周后的死亡率，对照组为17.78％，组合物组(0.1％添加)11.11％，组合物组(0.3％添加)为6.67％，具有抑制倾向。
3)便pH：
表-4 沙门菌菌数、死亡率及便pH
| 处置方法 | サルモネラ菌数(×10) | 死亡率(％) | 便pH | ||
| 2周后 | 4周后 | 6周后 | |||
| コントロ-ル群 | 0.95 | 0.34 | 0.20 | 17.78 | 7.17 |
| 组合物群(0.1％添加) | 0.60 | 0.29 | 0.10 | 11.11 | 6.22* |
| 组合物群(0.3％添加) | 0.48 | 0.21 | 0.00 | 6.67 | 6.05* |
*有显著性差异
6周
后的便pH，对照组为7.17，组合物组(0.1％添加)为6.22，组合物组(0.3％添加)为6.05，有显著性差异。
实施例8 热应激死亡率的改善效果
方法：体重40g左右的鸡，1组45只，准备3组，进行如下分组、处置。
1)对照组： 给予鸡用饲料直到实验终了
2)组合物组： 给予添加了0.1％实施例3中组合物的鸡
(0.1％添加) 用饲料，直到实验结束
3)组合物组： 给予添加了0.3％实施例3中组合物的鸡
(0.3％添加) 饲料，饲料直到实验结束
从实验开始到结束6周期间，3组的热应激饲养均是1天内12小时的温度为40±1℃ ，湿度75±5％，剩余的12小时在24～26℃饲养。
另外，从实验开始到结束6周间，3组均是自由摄取水和上述饲料。
检测6周后的死亡率和便pH(表-5)
结果：1)死亡率：
6周后的死亡率，对照组为33.33％，组合物组(0.1％添加)为17.78％，组合物组(添加0.3％)为11.11％，有这样的抑制倾向。
2)便pH：
6周后的便pH，对照组为7.12，组合物组(0.1％添加)为6.28，组合物组(0.3％添加)为6.23，有显著性差异。
表-5 死亡率和便pH
| 处置方法 | 死亡率(％) | 便pH |
| 对照组 | 33.33 | 7.12 |
| 组合物组 | 17.78 | 6.28* |
| 组合物组 | 11.11 | 6.23* |
*有显著性差异
产业上利用的可能性。
向出生后至幼期、及成体动物的配合饲料中添加上述制备物0.01-10％，优选0.05-5.0％，经口给予后，可预防和治疗盲肠便中的沙门菌感染和肠粘膜侵袭，可以进行畜产物的无沙门菌属生产。因此，本发明可用于，如养鸡业。
Claims (4)
1.用于预防或治疗家禽或家畜沙门菌属疾病的组合物，在含有蔗糖的营养培养基中使至少1种选自明串珠菌属、链球菌属、链杆菌属的乳酸菌属菌株发酵，以由所得发酵液而来的制备物作为有效成分，其中由发酵液而来的制备物源自用水混合性有机溶剂对发酵液进行分级沉淀处理后而得到的上层澄清液，所说的制备物是经过去除菌体的物质。
2.权利要求1的组合物，其中明串珠菌属的乳酸菌为肠膜明串珠菌。
3.权利要求1的组合物，其中链球菌属的乳酸菌为牛链球菌。
4.权利要求1的组合物，它是通过与颗粒化剂组合而形成的固形化产物。
Applications Claiming Priority (2)
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