WO2000030661A1 - Compositions bacteriostatiques contre les salmonelles - Google Patents

Compositions bacteriostatiques contre les salmonelles

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WO2000030661A1
WO2000030661A1 PCT/JP1999/006574 JP9906574W WO0030661A1 WO 2000030661 A1 WO2000030661 A1 WO 2000030661A1 JP 9906574 W JP9906574 W JP 9906574W WO 0030661 A1 WO0030661 A1 WO 0030661A1
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WO
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composition
group
salmonella
genus
lactic acid
Prior art date
Application number
PCT/JP1999/006574
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English (en)
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Inventor
Tsuneo Fukata
Takao Ogawa
Kimio Hirose
Kyoji Kito
Original Assignee
Meito Sangyo Kabushiki Kaisha
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    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74Bacteria
    • A61K35/741Probiotics
    • A61K35/744Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04Antibacterial agents

Definitions

  • the present invention relates to a Salmonella-inhibiting composition
  • a Salmonella-inhibiting composition comprising, as an active ingredient, a component derived from a fermentation broth of lactic acid bacteria. More specifically, the present invention relates to a composition that can be used as a feed additive for preventing or treating Salmonella infection, or a pharmaceutical or health food.
  • Salmonella infections can be seen in animals at an early age or when they become adults due to changes in the environment, etc.
  • antibiotics eg Streptococcus
  • vaccines eg., a type of sugar
  • various live bacteria eg Streptococcus
  • Mannose a type of sugar
  • colony mesentery adhesion such as the growth of a strain belonging to Lactobacillus, a competitive exclusion method for salmonella (CE agent)
  • CE agent competitive exclusion method for salmonella
  • Vaccines can only be effective against specific pathogenic bacteria and have a limited duration of effect ("Japanese livestock industry", Chixan, the latest databank for predicting livestock in Japan) Publishing, 1989, pp. 21 to 35.) Some probiotic agents need to be stored in a cold place, and the storage period is short and high. In addition, large doses had to be administered to animals with established intestinal flora.
  • Mannan oligosaccharide which agglutinates pathogens and suppresses intestinal wall adhesion, agglutinates 48% of pathogenic Salmonella and inhibits intestinal wall adhesion, but has no effect on the remaining pathogenic Salmonella and has no problem. Remains.
  • Mahimizu Characteristics and Usefulness of Mannan Oligosaccharides, Poultry Farming Friends, June, 14-18 (1996)
  • Oligosaccharides inhabit the large intestine of animals and form intestinal flora with other bacteria. It is said to promote the growth of Bifidobacteria and suppress Salmonella, but it is expensive and its effect is uncertain.
  • Tsuneo Fukada et al . Effect of oligosaccharides on Salmonella infection in chickens, Chicken's Disease Research Report 31, 113-117 (1995)]
  • Oligosaccharides such as these antibiotics, vaccines, various probiotic agents, and mannan oligosaccharides that agglutinate pathogens and suppress intestinal lining adhesion, themselves contain fragrance components preferred by animals. On the contrary, some of them smelled unpleasant for animals, which made them unsuitable as feed additives.
  • the conventional technology has a certain effect for the purpose of suppressing Salmonella, it does not exhibit an unpleasant odor or does not show itself an effect of enhancing the palatability in animals. Therefore, for example, when used as a feed additive, it has been difficult to increase the feed intake and improve the physical condition of the animal.
  • an object of the present invention is to provide a composition which has an effect of suppressing Salmonella and can enhance the palatability of animals.
  • the present inventors have developed a composition that can improve or eliminate disadvantages associated with the prior art, That is, intensive research has been conducted to provide a composition that is effective in preventing or treating Salmonella infection and that can enhance the palatability in animals. As a result, it has been found that a preparation derived from fermentation broth of certain bacteria belonging to lactic acid bacteria can achieve the above object, and the present invention has been completed.
  • At least one strain belonging to a lactic acid bacterium selected from the group consisting of the genus Leuconostoc, the genus Streptococcus, and the genus Streptococcus eotobacterium is used to sucrose-containing nutrients.
  • a Salmonella-inhibiting composition comprising a preparation derived from a fermentation broth obtained by fermentation in a medium as an active ingredient is provided.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating Salmonella infection comprising administering to a test animal an effective amount of a preparation derived from the fermentation broth for preventing or treating Salmonella infection. Is done.
  • a preparation derived from said fermentation broth as an active ingredient for producing a composition for the prevention or treatment of Salmonella infection in an animal.
  • FIG. 1 is a mouth chromatogram obtained under the operating conditions of liquid chromatography described for the preparation according to the invention obtained in Example 1.
  • the lactic acid bacterium used in the fermentation according to the present invention may be any bacterium belonging to the above genus, as long as it meets the purpose of the present invention, and specific examples thereof include Leuconostoc mesenteroides (Leuconostoc raesente).
  • More particularly preferred bacteria include M. iconococcus mesenteroides used in the production of dextran.
  • Specific strains that can be used include, for example, Leuconostoc mesenteroides ATC C 10830 (NRR LB-512) and Leuconostoc dextranicum ATC C 19255 (NRRLB-) available from the American Type Culture 'Collection (ATC C). 3469), Streptococcus bovis, ATC C 33317 (NCD 0 597), Streptococcus mutans ATC C 25175 (NCTC 10449), Streptococcus sanguis ATC C 10556, and Streptobacterium dextranicum ATC C 13134 (NRRL B-1254).
  • the above-mentioned bacteria may be used simultaneously if they do not adversely affect each other in their growth and physiological functions. It is convenient to use
  • the nutrient medium containing sucrose for fermenting the above bacteria can be produced when producing sugar from isolated forms of sucrose or sugarcane or sugar beet containing sugar as a component, or sugar cane or sugar beet. Contains by-products, molasses, beet pulp, bagasse, etc. as sucrose sources. In addition to sucrose, other ingredients or compounds that are substantially harmless to animals, such as brewer's yeast extract, peptone, corn steep liquor, Soy protein, salt, HC 1, K 2 HP 0 4 , and the like.
  • the fermentation according to the present invention can be usually carried out by sterilizing the above medium, inoculating an appropriate lactic acid bacterium, and culturing at about 25 ° C under anaerobic conditions.
  • the cultivation time is not limited since it varies depending on the bacterium used, the temperature, and the medium composition, but it is necessary to select at least the time from the logarithmic growth phase to the stationary phase of the lactic acid bacteria. If the culture time is too short, it may result in a composition having a low Salmonella effect on the animal.
  • the composition for suppressing salmonella of the present invention comprises subjecting the fermentation broth itself or the fermentation broth to, for example, a fractional precipitation treatment using a water-miscible organic solvent to remove the precipitate.
  • the supernatant thus prepared or a preparation derived therefrom is contained as an active ingredient. Therefore, the preparations referred to in the present invention include the fermentation broth itself or a supernatant concentrate derived from the fermentation broth, a cell-removed product described later, and a spray-dried product or a lyophilized product. In order to obtain the supernatant, it is usually convenient to carry out a fractional precipitation treatment.
  • examples of the organic solvent used for such a fractional precipitation treatment include ethanol, methanol, acetate, isopropyl alcohol and the like. Is given.
  • the optimal amount of the organic solvent used for the broth varies depending on the type of the organic solvent used.
  • the processing temperature is 15 to 35 ° C, preferably ambient temperature.
  • the present invention also provides a Salmonella-inhibiting composition
  • a Salmonella-inhibiting composition comprising a preparation obtained by removing cells from a fermentation broth before or after the above-mentioned fractional precipitation treatment or at the same time.
  • the cells can be removed by filtration or centrifugation.
  • the resulting preparation can be conveniently used when used as a pharmaceutical or health food, but it is also easy to use (for example, easy blending of active ingredients) when used as a feed additive. preferable.
  • the preparation derived from the supernatant used as the active ingredient in the composition of the present invention is conventionally discarded or omitted as unused by-product in the production of dextran.
  • Such a supernatant can be provided in a state substantially free of dextran depending on the type or amount of the organic solvent to be used. You can achieve your goals.
  • a composition in which the above-mentioned preparation is in the form of a liquid or syrup (concentrate), which is simply dissolved in water or physiological saline, or a pharmaceutical excipient or carrier, or a feed material.
  • Liquid or syrupy preparations can be converted into granulating or solidifying agents commonly used in the pharmaceutical and feed fields, such as granulated glucose, anhydrous silicic acid, cereal kashiwa, bread crumbs, soybean meal, bran, cacao It can also be provided as a solid composition mixed with beans and the like.
  • the solid composition may be produced by freeze-drying or spray-drying the above liquid or syrup-like preparation, or the dried substance thus produced is commonly used in the above-mentioned granulating agent or other pharmaceutical or feed fields.
  • the salmonella-inhibiting composition of the present invention can be produced by mixing with the excipients.
  • blending and mixing methods methods known per se can be used depending on the dosage form. Further, according to the present invention, although not restricted, it can be assumed that the desired effect can be achieved by the following mechanism of action.
  • lactic acid bacteria described above When the lactic acid bacteria described above are inoculated into a sucrose-containing composition and cultured, glucose, out of glucose and fructose, which are constituent sugars of sucrose, is polymerized into dextran, and on the other hand, fructose is produced. It may exist in the form of oligo- or polyfructose polymerized by the action of fructosyltransferase.
  • fructose since various substances such as lactic acid and flavor components are produced by bacteria, lactic acid, fructose, mannite, leucrose, lactic acid bacteria cells used for fermentation, and other components may be contained. A fermentation broth consisting of the putative multi-components is formed.
  • the proportion of the preparation to be included as an active ingredient in the Salmonella-inhibiting composition of the present invention is not limited because the optimum amount varies depending on the purpose of use, for example, for pharmaceuticals, health foods or feed additives. However, those skilled in the art can determine with reference to the effects described in the examples described below. There will be.
  • a concentrate concentrated up to 12 times when used as a feed additive for a compound feed, it should be included in an amount of 0.01 to 10.0% by weight, preferably 0.05 to 5.0% by weight, based on the total weight of the composition.
  • Such salmonella-inhibiting compositions are useful for preventing or treating salmonella infections in poultry such as chickens and turkeys, as well as livestock or companion animals such as cattle, horses, pigs, dogs and cats, and other humans. It can be used effectively to increase intake.
  • Salmonella suppressing composition of the present invention will be described more specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
  • Example 1 Production of a supernatant concentrate using sucrose as a main raw material
  • a medium containing sucrose as the main ingredient and having the following composition is inoculated with a lactic acid bacterium, Leuconostoc mesenteroides ATCC 10830 (NRRL B-512), and fermented at 25 ° C for 24 hours under anaerobic conditions. After the reaction, 1 volume of ethanol was added to 1 volume of the fermentation solution, and the supernatant was collected. The supernatant is filtered to remove the cells, and then ethanol is distilled off at about 80 ° C under reduced pressure (540-580 mmHg) until the liquid volume becomes about 1/12. Concentration provided a supernatant concentrate.
  • the properties and liquid chromatograph (see Fig. 1) of the prepared concentrate were as follows.
  • Medium composition :
  • Example 2 Production of a supernatant concentrate using molasses as a main raw material
  • a medium with the following composition consisting of 1 volume of molasses and 2 volumes of distilled water is inoculated with Streptococcus bovis ATCC 33317 (NCDO 597), a kind of lactic acid bacteria, at 25 ° C for 24 hours. After fermentation under anaerobic conditions, add 1 volume of ethanol to 1 volume of fermentation broth and collect the supernatant. I did. The supernatant is filtered to remove the cells, ethanol is distilled off at about 80 ° C under reduced pressure (540-58 OmmHg), and the solution is concentrated until the liquid volume becomes about 112. A concentrate of the supernatant was prepared. The properties of the prepared concentrate and the values measured by liquid chromatography were as follows.
  • Example 3 Preparation of a mixed feed from a supernatant concentrate as a raw material
  • Granulated glucose (Glufinal, manufactured by Honshu Shokuhin Kogyo Co., Ltd.) was used as a powdering agent. To 9 kg, 1 kg of the concentrate prepared in Example 1 was added.- A horizontal paddle mixer was used for 5 minutes. Mix well to produce a mixed feed. The produced mixed feed (also described as composition) had the following properties.
  • Example 4 Production of mixed feed from concentrate of supernatant as raw material
  • silicic acid manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • silicic acid manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • a mixed feed was manufactured.
  • the produced mixed feed (also described as composition) had the following properties.
  • Example 5 Chicken breeds ⁇ Salmonella colonization inhibition test
  • Control group A group that receives experimental chick diet until the end of the experiment
  • CE agent group The group in which 0.2 ml was forcibly administered to the first day when the CE agent * in the live bacterial agent was dissolved according to the instructions * Culture feed for chicken cecum contents
  • composition group On the day after S. enteritidis administration, the composition group was compared with the control group.
  • the number of S. enteri ti ids decreased by about 2 orders, but no statistically significant difference was observed.
  • Example 6 Broiler 'Salmonella attack test Method: One day old broiler (Arbor Acres) 1 group 30 animals, 2 groups were prepared. They were grouped and treated as follows.
  • Control group A group to receive broiler feed until the end of the experiment
  • Composition group A group fed with a broiler feed supplemented with 0.3% of the composition of Example 3 until the end of the experiment. Both groups were allowed to freely take the feed mixture and water from 1 day to 19 years of age. . On the 13th and 18th days, 10 or 8 Salmonella enteritidis were orally administered, respectively, and dissected the following day to measure the extent of invasion of the intestinal mucosa and the pH of cecal feces.
  • composition group significantly suppressed invasion of the intestinal mucosa by any of the bacteria compared to the control group.
  • Composition group Chicken containing 0.3% of the composition of Example 3 (0.3% added)
  • Salmonella enteritidis 2.7 10 11 CFU was orally administered 10 days after the start of the experiment, and the number of Salmonella bacteria in feces was measured 2, 4, and 6 weeks later.
  • the fecal salmonella count after 6 weeks was 0.95, 0.34, 0.20 x 10 after 2, 4, and 6 weeks in the control group, and 0.6 after 2, 4, and 6 weeks in the composition group (0.1% added). , 0.29, 0.10 x 10 and 0.48, 0.21, 0.00X10 after 2, 4 and 6 weeks of the composition group (0.3% added), indicating a tendency to suppress.
  • the mortality after 6 weeks was 17.78% in the control group, 11.1% in the composition group (0.1% added), and 6.67% in the composition group (0.3% added), indicating a tendency of suppression.
  • Method Prepare chickens weighing around 40 g, 45 groups per group, 3 groups, and And treated.
  • Control group A group that receives chicken feed until the end of the experiment
  • Composition group Chicken containing 0.3% of the composition of Example 3 (0.3% added)
  • the mortality rate after 6 weeks was 33.33% in the control group, 17.78% in the composition group (0.1% added), and 11.11% in the composition group (0.3% added), indicating a tendency of suppression. .
  • the above-described preparation is preferably used in a feed mixture of 0.01 to 10%, preferably 0.05 to 5%, in a mixed feed fed to a young child or an adult animal.
  • a feed mixture 0.01 to 10%, preferably 0.05 to 5%
  • it is effective in preventing and treating Salmonella infection in the cecal stool and invasion of the intestinal mucosa, enabling the production of the livestock product Salmonella free. Therefore, the present invention can be used, for example, in the poultry industry.

Description

明 細 書
サルモネラ抑制組成物
技術分野
本発明は、 乳酸菌の発酵ブロス由来の成分を有効成分として含んでな るサルモネラ抑制組成物に関する。 より具体的には、 本発明は、 サルモ ネラ感染の予防又は治療用の飼料添加物、 或いは医薬もしくは健康食品 として利用できる組成物に関する。
背景技術
動物は、 生後間もない幼少時や、 成体になっても環境の変化等により サルモネラ感染が見られるが、 この対策として、 医薬品として抗生物質、 ワクチン、 各種生菌剤 [例えば、 ストレプトコッカス(Streptococcus)、 ラク トバチルス (Lactobacillus) に属する菌株の増殖物、 サルモネラ の競合的排除法 (competitive exclusion: C E剤) ] 等、 病原菌を凝 集し腸間壁付着を抑制するマンノース (糖の一種) 或いは、 健康食品と してオリゴ糖等の投与による予防が試みられている。
しかし、 これらの方法の内、 抗生物質は、 耐性菌を生じ易いこと、 生 体に有利に働く正常細菌叢をも排除してしまうこと、 加工畜産物への抗 生物質の移行、 残留するおそれがあることなどの問題がある ( "飼料添 加物の畜産物中への残留" 畜産ハンドブック、 姫野健太郎ら編者、 講談 社、 1 9 8 4、 P P . 4 8 4〜 4 8 5。 )
ワクチンは、 特定の病原細菌にしか効果が望めず、 又、 効果の持続期 間も限定される等の問題がある ( "日本の畜産業" 、 日本の畜産を予測 する最新のデータバンク、 チクサン出版、 1 9 8 9、 pp. 2 1〜3 5。) 各種生菌剤は、 冷所保存が必要なものもあり、 保存期間も、 短く、 高 価なうえに、 腸内細菌叢が確立されている動物には多量に投与する必要 があった。
病原菌を凝集し腸間壁付着を抑制するマンナンオリゴ糖は、 病原性サ ルモネラの 48%を凝集させ腸間壁付着を抑制するが、 残りの病原性サ ルモネラについては効果が認められず問題が残る。 [清水幹夫: マンナ ンオリゴ糖の特徴と有用性、 養鶏の友、 6月号、 14〜 18(1996)] オリゴ糖は、 動物の大腸に生息し、 他の菌とともに、 腸内細菌叢を形 成しているビフィズス菌の増殖を促進し、 サルモネラの抑制効果も有る とされているが、 高価である上、 効果が不確実である。 [例えば、 深田 恒夫ら :鶏におけるオリゴ糖のサルモネラ感染抑制効果について、 鶏病 研報 31、 113〜 117 (1995) ]
また、 これらの抗生物質、 ワクチン、 各種生菌剤、 病原菌を凝集し腸 間壁付着を抑制するマンナンオリゴ糖等の、 オリゴ糖には、 それ自体に は動物の好む香成分は含まれておらず、 むしろ、 動物の嫌がる臭いがす る物もあるので飼料添加物としては不向きの点もあった。
上述のように、 従来技術はサルモネラ抑制の目的に関しては一定の作 用効果を奏するものの、 異臭を呈するものや、 それら自体に動物におけ る嗜好性を高める作用を示さない。 そのため、 例えば飼料添加物として 使用する場合には、 飼料摂取量を増進させて動物の体調を増進させるこ とは困難であった。
従って本発明の目的は、 サルモネラ抑制効果を有するとともに、 動物 の嗜好性をも高めうる組成物を提供することにある。
発明の開示
本発明者らは、 従来技術に随伴する短所を改善又は解消できる組成物、 すなわちサルモネラ感染の予防もしくは治療に有効であり、 かつ動物に おける嗜好性を高めうる組成物を提供すべく、 鋭意研究を行ってきた。 その結果、 乳酸菌に属する一定の菌の発酵ブロス由来の調製物が、 上記 目的を達成できることを見出だし本発明が完成された。
従って本発明によれば、 ロイコノストック (Leuconostoc) 属、 スト レプトコッカス (Streptococcus) 属及びストレプトバクテリゥム eotobacterium) 属からなる群より選ばれる乳酸菌に属する少なく とも 1種の菌株をショ糖含有栄養培地で発酵させて得られた発酵ブロスに由 来する調製物を、 有効成分とするサルモネラ抑制組成物が提供される。 また、 別の態様としては、 前記発酵ブロスに由来する調製物のサルモ ネラ感染症の予防または治療上の有効量を被験動物に投与することを含 んでなるサルモネラ感染症の予防または治療方法も提供される。
さらにまた、 別の態様としては、 動物のサルモネラ感染症の予防また は治療用組成物を製造するための有効成分としての前記発酵ブロスに由 来する調製物の使用も提供される。
図面の簡単な説明
図 1は実施例 1で得られた本発明に従う調製物の記載の液体クロマト グラフィ一の操作条件で得られたク口マトグラムである。
発明を実施するための好適な態様
本発明に従う発酵に使用する乳酸菌は、 本発明の目的に沿うものであ るかぎり、 上記属に属するいずれの菌であってもよいが、 具体的なもの としては、 ロイコノストック メセンテロイデス (Leuconostoc raesente roides) ヽ ロづ コノス 卜 ック デ干ス 卜ラニカム (Leuconostoc dextran icum) 、 ス 卜プ卜コッカス ボヒス (Streptococcus bovis) 、 ス 卜 レ プトコッカス ミ ユタンス (Streptococcus mutans) 、 ス ト レプトコッ カス サンギス (Streptococcus sanguis) 及びス卜レプ卜ノくクテリウ ム デキス卜ラニカム (Streptobacterium dextranicum) が挙けられる 0 これらのうち、 好ましい菌は、 ロイコノストック メセンテロイデス及 びストレプトコッカス ボビスである。 さらに特に好ましい菌としては、 デキストランの生産に使用されている口ィコノストック メセンテロィ デスが挙げられる。 使用できる具体的な菌株としては、 例えば、 ァメ リ カン . タイプカルチャー ' コレクション (ATC C) から入手すること ができる Leuconostoc mesenteroides ATC C 10830 (NRR L B— 512 ) 、 Leuconostoc dextranicum ATC C 19255 (N R R L B— 3469) 、 Streptococcus bovis、 ATC C 33317 (N C D 0 597 ) 、 Streptococcus mutans ATC C 25175 (NCTC 10449) Streptococcus sanguis ATC C 10 556及び Streptobacterium dextranicum ATC C 13134 (N RRL B— 1254) を挙げることができる。 さらに、 上記菌は、 複 数種の菌がそれらの增殖や生理機能に対して相互に悪影響を及ぼさない 場合には、 複数種の菌を同時に使用してもよいが、 通常、 1種の菌を使 用するのが好都合である。
上記菌を発酵するためのショ糖含有栄養培地は、 単離された形態のショ 糖もしくは一成分としてショ糖を含むサトウキビ、 甜菜の絞り柏、 或い はサトウキビ、 甜菜より砂糖を製造する時にできる副産物である、 糖蜜、 ビー トパルプ、 バガス等をショ糖源として含有する。 ショ糖以外に培地 に加えられる成分としては、 動物に対して、 実質的に無害の物質もしく は化合物、 例えばビール酵母エキス、 ペプトン、 コーンスチープリカー、 大豆蛋白、 食塩、 H C 1、 K 2 H P 0 4 等が挙げられる。
本発明に従う発酵は、 通常、 上記培地を滅菌した後、 適当な乳酸菌を 接種し、 2 5 °C付近で嫌気性条件下にて培養することにより行うことが できる。 培養時間は、 使用する菌、 温度もしくは培地組成によって変動 するので限定されないが、 乳酸菌が少なく とも対数増殖期から静止期に 到る時間を選ぶ必要がある。 培養時間が短すぎると、 動物に対するサル モネラ効果が低い組成物をもたらす可能性があるからである。
こうして、 発酵ブロスが得られるが、 本発明のサルモネラ抑制組成物 は、 かかる発酵ブロスそれ自体、 あるいは該発酵ブロスを、 例えば、 水 混和性の有機溶媒を用いる分別沈殿処理に供し、 沈殿物を除去した上澄 それ自体またはそれに由来する調製物を有効成分として含む。 従って、 本発明にいう調製物は、 前記発酵ブロスそれ自体または発酵ブロスに由 来する上澄の濃縮物、 後述する菌体除去物、 及び噴霧乾燥物や凍結乾燥 物等である。 なお、 前記上澄を得るには、 通常、 分別沈殿処理によるの が好都合であるが、 かような分別沈殿処理に用いる有機溶媒としては、 エタノール、 メ タノール、 アセ ト ン、 イソプロピルアルコール等が挙が られる。 また、 分別沈殿処理において、 ブロスに対して使用される有機 溶媒の量は使用される有機溶媒の種類によって最適量が変動するが、 ェ タノールを使用場合には、 通常、 ブロス 1容量部に対して有機溶媒 0 . 了〜 4容量部とする。 処理温度は、 1 5〜3 5 °C、 好ましくは周囲温度 である。
上記分別沈殿処理に前後し、 或いは同時に、 発酵ブロスから菌体を除 去した調製物を含んでなるサルモネラ抑制組成物も、 本発明により提供 される。 菌体の除去は、 濾過又は遠心分離により実施できる。 こうして、 得られる調製物は、 医薬もしくは健康食品に利用する場合に都合よく使 用できるが、 飼料添加物として使用する場合にも、 使用容易 (例えば、 有効成分の均質配合等が容易) である点で好ましい。
なお、 上記から理解できるように、 本発明の組成物において有効成分 として使用する上澄由来の調製物は、 従来、 デキス トランの製造に際し、 副産物として未利用のまま廃棄されるか省みられることのなかった、 デ キストラン発酵副産物そのまま、 或いは、 必要により菌体を除去し、 さ らに脱塩、 有機溶媒を除去した後、 7〜 1 7倍に濃縮し、 精製濃厚物の 形態とすることができるので、 極めて安価に製造できる。 かような上澄 は、 使用する有機溶媒の種類または使用量に応じて、 実質的にデキス ト ランを含まない状態で提供できるが、 そのような上澄であっても本発明 の所期の目的を達成できる。
本発明によれば、 例えば上記調製物を液状もしくはシロップ (濃厚物) 状で単に水、 生理食塩液に溶解した液剤、 或いは医薬用賦形剤もしくは 担体、 或いは飼料原料と配合した組成物が提供される。 また、 液状もし くはシロップ状の調製物を、 医薬分野や飼料分野で常用されている顆粒 化もしくは固形化剤、 例えば顆粒状ブドウ糖、 無水珪酸、 穀物柏、 パン 屑、 大豆粕、 ふすま、 カカオ豆穀等と配合した固形組成物として提供す ることもできる。 固形組成物は、 また、 上記液状もしくはシロップ状調 製物を、 凍結乾燥もしくは噴霧乾燥して製造するか、 或いはこうして製 造した乾燥物を上記顆粒化剤またはその他の医薬、 飼料分野で常用され ている賦形剤と混合して、 本発明のサルモネラ抑制組成物を製造するこ ともできる。 以上の調製、 配合及び混合法は、 剤形に応じてそれ自体既 知の方法が使用できる。 さらに本発明に従えば、 拘束されるものでないが、 次の作用機序によ り目的の効果が達成できるものと推測できる。 ショ糖含有組成物に上記 乳酸菌を接種し、 培養したとき、 ショ糖の構成糖のグルコースと果糖の うち、 グルコースは重合してデキストランとなり、 一方、 果糖が産生す るが、 場合によって、 果糖はフルク トシルトランスフヱラーゼの作用に より重合されたオリゴ一ないしポリフラク トースの形態で存在すること もある。 また、 この他に、 乳酸、 香味成分物質をはじめ、 種々の物質が 菌より産生されるので、 乳酸、 果糖、 マンニッ ト、 ロイクロース、 発酵 に用いた乳酸菌の菌体、 その他の成分を含むことが推測される多成分か らなる発酵ブロスが形成される。 従来、 この発酵ブロスは、 仮りに、 上 記のごとく有機溶媒による分別沈殿処理した後も、 上澄画分に、 上記乳 酸や香味成分、 果糖、 マンニッ ト、 ロイクロース、 デキス トラン、 オリ ゴ一ないしポリフラク トース、 その他の培養液成分、 ならびに場合によつ て発酵に用いた乳酸菌の菌体を含むことが推測されるので、 本発明の調 製物を提供するのに都合よく用いることができる。 そして、 これらの成 分が組み合わさって、 無害で動物において嗜好性を高め、 かつ鶏のサル モネラ攻撃試験における、 盲腸糞の p Hの低下、 腸粘膜の侵襲の抑制効 果及びサルモネラ定着抑制効果、 並びにヒートストレスにおける死亡率 の抑制及び糞 P Hの低下作用により、 動物の体調を増進させ、 サルモネ ラフリーの鶏卵、 肉、 牛乳の生産に優れ効果を奏するものと推測できる。 本発明のサルモネラ抑制組成物中に有効成分として含められる調製物 の使用割合は、 使用目的、 例えば、 医薬や健康食品用又は飼料添加物用、 に応じて最適量が変動するので限定できるものでないが、 当業者であれ ば、 後述する実施例に記載の作用効果を参考に決定することができるで あろう。 一般に、 例えば配合飼料の飼料添加物として、 12倍まで濃縮 した濃厚物を使用する場合には、 総組成物重量当り 0.01〜10.0重 量%、 好ましくは 0.05〜 5.0重量%となるように含めることができ
Ό o
かかるサルモネラ抑制組成物は、 鶏および七面鳥などの家禽、 ならび に牛、 うま、 豚、 犬及び猫などの家畜もしくは愛玩動物、 その他、 ヒ ト、 において、 サルモネラ感染の予防もしくは洽療、 さらには飼料摂取量の 増進用として有効に利用することができる。
以下、 本発明のサルモネラ抑制組成物を実施例によって更に具体的に 説明するが、 本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例 1 : ショ糖を主原料とした場合の上澄液濃厚物の製造
ショ糖を主原料とした下記組成の培地に乳酸菌の一種であるロイコノ ス卜ック メセンテロイデス CLeuconostoc mesenteroides) A T C C 10830 (NRRL B— 512) を接種し、 25°C、 24時間、 嫌 気性下で発酵させた後、 発酵液 1容にエタノール 1容を加えて、 その上 澄液を集めた。 この上澄液を濾過して菌体を除去してから、 約 80°Cに て減圧下 (540〜580mmH g) 下でエタノ一ルを留去し、 液量が 約 1/12になるまで濃縮して上澄液の濃厚物を調製した。 調製した濃 厚物の性状と液体クロマトグラフ (図 1参照) は下記のとおりであった。 培地の組成:
ショ糖 15.0%
リン酸一水素二カリウム 0.5%
ビール酵母エキス 0.2%
H 7.0 濃厚物の性状:
外観 淡褐色、 ないし褐色粘凋液
香味 甘酸っぱい香味を有し、 異味異臭がない 糖度 (B X) 65°
PH 5.4
乾燥減量 31.6%
42.0%
ォリゴ糖 * 23.2%
* 図 1の結果から、 ロイクロース、 マンニッ ト、 オリゴ一ないしポリ フラク トースおよびデキストランが含まれることが予想される。
液体クロマ トグラフィーの操作条件 (図 1に対応) :
サンプル量: 2.0 (重量 容量) %液 80 n 1
カラム : G 2000 PWx 2 (東ソ一社製)
溶出液: 0. 1 M N a C 1水溶液
流速 : 1.0 m 1 Z分
温度 : 25°C
圧力 : 90 k c m2
検出器 : R I x 1
チヤ一ト速度: 0.5 c m/分
実施例 2 :糖蜜を主原料とした場合の上澄液濃厚物の製造
糖蜜 1容に蒸留水 2容を加えた下記組成の培地に、 乳酸菌の一種であ るス トレプトコッカス ボビス ( reptococcus bovis) A T C C 33 31 7 (NCDO 597) を接種し、 25°C、 24時間、 嫌気性下で 発酵させた後、 発酵液 1容にエタノール 1容を加えて、 その上澄液を集 めた。 この上澄液を濾過して菌体を除去してから、 約 80°Cにて減圧下 (540-58 OmmH g) でエタノールを留去し、 液量が約 1 12 になるまで濃縮して上澄液の濃厚物を調製した。 調製した濃厚物の性状 と液体クロマトグラフィ一による測定値は下記のとおりであった。
培地の組成:
糖蜜 15.0%
リン酸一水素二力リウム 0. 1%
P H 6.2
濃厚物の性状:
外観 淡褐色、 ないし褐色粘凋液
香味 甘酸っぱい香味を有し、 異味異臭がない 糖度 (B X) 62°
P H 5.2
乾燥減量 33.5%
果糖 39.6%
ォリゴ糖 22.9%
実施例 3 :上澄液の濃厚物を原材料とする混合飼料の調製
粉末化剤として、 顆粒状ブドウ糖 (グルファイナル、 曰本資糧工業社 製) を使用しこれを 9 k gに、 実施例 1で調製した濃厚物 1 k gを加え- 横形パドル式混合機で 5分間よく混合し、 混合飼料を製造した。 製造し た混合飼料 (組成物とも記述する) は下記の性状であった。
外観 淡黄色の粉末
香味 甘酸っぱい香味を有し、 異味異臭がない 乾燥減量 9.5% ブドウ糖 79.0%
果糖 4.0%
ォリゴ糖 2.5%
実施例 4 :上澄液の濃厚物を原材料とする混合飼料の製造
粉末化の賦形剤として、 珪酸 (和光純薬工業社製) を使用し、 その 9 k gに、 実施例 2で調製した濃厚物 1 k gを加え、 横型バドル式混合機 で 5分間よく混合し、 混合飼料を製造した。 製造した混合飼料 (組成物 とも記述する) は下記の性状であった。
外観 淡黄色の粉末
香味 甘酸っぱい香味を有し、 異味異臭がない 乾燥減量 9. 1%
珪酸 80.5%
果糖 4.2%
オリゴ糖 2.8%
実施例 5 :採卵鶏種 ·サルモネラ定着抑制試験
方法:初日令の白色レグホン ( ) を 1群 30羽、 3群に分けた。
1) コントロール群: 実験用幼雛飼料を実験終了時まで与える群
2) 組成物群: 孵化曰から実験終了まで、 実施例 3の組成物 を 0. 3%添加した飼料を与える群
3 ) C E剤群: 生菌剤中の C E剤 *を説明書に従って溶解さ せた初日令に 0. 2m lを強制投与した群 *鶏盲腸内容物培養飼料
1週令時にすべての鶏に Salmonella enteritidis (S. enteriti dis食中毒由来ファージタイプ 4型) 約 107個を経口投与した。 S. enteritidis投与翌日、 1および 2週間後に剖検を行い、 盲腸 内容中 l g当たりの S. enteritidis数を検査した。 結果:盲腸内容中 1 g当たりの S. enteritidis数 (表— 1 )
S. enteritidis投与翌日では、 組成物群において、 コントロール 群と比べて
S. en teri t id i s数が約 2オーダー減少したが統計上の有意差はみ られなかった。
S. enteritidis投与後、 7日目において組成物群は、 コントロー ル群と比べて有意に S. enteritidis数の減少がみられた。 S. enteritidis投与後、 1 4日目においては、 すべての群におい て分離される菌数は少なかった。
1週令のヒナに S. enteritidisを投与した場合
の盲腸内容中 1 g当たりの S. enteritidis数
Figure imgf000014_0001
* P< 0. 05 a ) : S. enteritidis数対数値平均土標準誤差 b ) : S. enteritidis陽性鶏数 Z用いた鶏数
* : 5 %の危険率でコ ン ト ロール群と有意差あり。 実施例 6 : ブロイラー ' サルモネラ攻撃試験 方法: 1日齢のブロイラー (Arbor Acres) 1群 3 0匹、 2群を用意し. 下記のように群分けし、 処置した。
1) コントロール群: ブロイラー用飼料を実験終了時まで与える群
2) 組成物群: 実施例 3の組成物を 0. 3%添加したブロイ ラー用飼料を実験終了まで給与する群 両群とも 1日齢〜 19曰齢まで配合飼料と水を自由摂取させた。 13、 18日目に、 Salmonella enteritidisを、 それぞれ 108個経口投与し、 翌日解剖して腸粘膜侵襲の程度と盲腸糞の p Hを測定した。
結果: 1) 腸粘膜の侵襲 (表一 2)
14日齢における S. enteritidisの攻撃では、 コントロール 群で 26Z30羽 (86. 6%) 、 組成物群で 15/30羽
(50%) であった。
19日齢における S. enteritidisの攻撃では、 コントロール 群で 25Z30羽 (83. 3%) 、 組成物群で 16Z30羽 (53. 3%) であった。
14. 19日齢とも、 組成物群は、 コン トロール群と比べい ずれの菌による腸粘膜の侵襲を有意に抑制した。
2) 盲腸糞の p H (表一 3)
14日齢における S. enteritidisの攻撃では、 コントロール 群で 6. 5±0. 3、 組成物群で 5. 6±0. 2であった。 19日齢における S. enteritidisの攻撃では、 コントロール 群で 6. 6±0. 5、 組成物群で 5. 7±0. 3であった。 14、 19曰齢とも、 組成物群は、 コントロール群と比べ盲 腸糞の p Hを有意に低下させた。 表一 2 腸粘膜の侵襲
Figure imgf000016_0001
*P< 0.05 表一 3 盲腸糞の pH
Figure imgf000016_0002
*P< 0.05 実施例 7 :鶏 ·サルモネラ攻撃における死亡率の改善効果
方法:体重 40 g前後の鶏を、 1群 45匹、 3群を用意し、 下記のよう に群分けし、 処置した。
1) コントロール群:鶏用飼料を実験終了時まで与える群
2) 組成物群: 実施例 3の組成物を 0. 1%添加した鶏用 (0.1%添加)
飼料を実験終了時まで与える群
3) 組成物群: 実施例 3の組成物を 0. 3%添加した鶏用 (0.3%添加)
飼料を実験終了時まで与える群
3群とも実験開始 10日後に、 Salmonella enteritidis 2.7 1011 CFUを経口投与し、 2、 4、 6週後に糞便中のサル モネラ菌数を測定した。
6週間後の死亡率と便 pH (6匹) を調べた。
また、 3群とも実験開始から終了まで 6週間のあいだ、 上記飼 料と水を自由摂取させた。 結果: 1) 糞便中のサルモネラ菌数:
6週間後の糞便中のサルモネラ菌数は、 コントロール群の 2、 4、 6週間後で 0.95、 0.34、 0.20 x 10、 組成物群 ( 0 . 1%添加) の 2、 4、 6週間後で 0.6、 0.29、 0. 10 x 1 0、 組成物群 (0.3%添加) の 2、 4、 6週間後で 0.48、 0. 21、 0.00 X 10となり抑制傾向を認めた。
2) 死亡率:
6週間後の死亡率は、 コントロール群で 17.78%、 組成物 群 (0. 1%添加) で 1 1. 1 1%、 組成物群 (0.3%添加) で 6.67%となり抑制傾向を認めた。
3) 便 pH :
6週間後の便 p Hは、 コントロール群で 7. 17、 組成物群 (0 . 1 %添加) で 6.22、 組成物群 (0.3 %添加) で 6.05で有 意差を認めた。 表一 4 サルモネラ菌数、 死亡率及び便 pH
Figure imgf000017_0001
* 有意差有り 実施例 8 : ヒー トス ト レスにおける死亡率の改善効果
方法: 体重 40 g前後の鶏を、 1群 45匹、 3群を用意し、 下記のよう に群分けし、 処置した。
1) コン トロール群:鶏用飼料を実験終了時まで与える群
2) 組成物群: 実施例 3の組成物を 0. 1%添加した鶏用 (0.1%添加)
飼料を実験終了時まで与える群
3) 組成物群: 実施例 3の組成物を 0. 3%添加した鶏用 (0.3%添加)
飼料を実験終了時まで与える群 3群とも実験開始から終了まで 6週間のあいだ、 ヒートストレ スとして、 1曰の内 12時間を温度 40 ± 1°C、 湿度 75 ± 5%、 残りの 12時間を 24〜26 °Cで飼育した。 また、 3群とも実験開始から終了まで 6週間のあいだ、 上記飼 料と水を自由摂取させた。
6週間後の死亡率と便 pH (6匹) を調べた。 (表一 5) 結果 1) 死亡率:
6週間後の死亡率は、 コントロール群で 33.33%、 組成物 群 (0. 1%添加) で 1 7.78%、 組成物群 (0.3%添加) で 1 1. 1 1%となり抑制傾向を認めた。
2) 便 pH :
6週間後の便 p Hは、 コントロール群で 7. 12、 組成物群 (0 . 1 %添加) で 6.28、 組成物群 ( 0.3 %添加) で 6.23で有 意差を認めた。 表一 5 死亡率と便 pH
Figure imgf000019_0001
* 有意差有り
産業上の利用可能性 本発明に従うと、 生後間もない幼少時や、 成体になった動物に給餌す る配合飼料に、 前記調製を 0. 01〜 10%、 好ましくは、 0. 05〜 5. 0 %添加して経口投与すると、 盲腸便中のサルモネラ感染や腸粘膜 の侵襲を予防および治療し、 畜産物のサルモネラフリ一の生産を可能に する効果がある。 従って、 本発明は、 例えば、 養鶏業において利用でき る。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ロイコノス ト ック (Leuconostoc) 属、 ス ト レプトコッカス (Str eptococcus) 属、 ス 卜レプ卜ノくクテリゥム (Streptobacterium) 属から なる群より選ばれる乳酸菌に属する少なく とも 1種の菌株をショ糖含有 栄養培地で発酵させて得られた発酵ブロスに由来する調製物を、 有効成 分とするサルモネラ抑制組成物。
2. 発酵ブロスに由来する調製物が、 発酵ブロスを水混和性有機溶媒 で分別沈殿処理した後に得られる上澄に由来するものである請求項 1記 載の組成物。
3 . ロイコノス ト ッ ク属の乳酸菌がロイコノス トック メセンテロィ デス (Leuconostoc mesenteroides) である請求項 1または 2記載の組 成物。
4. ストレプトコッカス属の乳酸菌がストレプトコッカス ボビス (S treptococcus bovis) である請求項 1または 2記載の組成物。
5 . 前記調製物が、 さらに菌体が除去されたものである請求項 1また は 2に記載の組成物。
6 . 顆粒化剤を組み合わせることにより固形化された請求項 2記載の 組成物。
7 . ロイコノス ト ック (Leuconostoc) 属、 ス ト レプトコッカス (Str eptococcus; 属、 ス 卜 レプ 卜ノく'クテリゥム (Streptobacterium) 属から なる群より選ばれる乳酸菌に属する少なく とも 1種の菌株をショ糖含有 栄養培地で発酵させて得られた発酵ブロスに由来する調製物を、 有効成 分とする家禽または家畜のサルモネラ症を予防または治療するための組 成物。
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