SE463598B - Preparat, avsett att oeka vidhaeftningen av bakterier till mag-tarmkanalen hos maenniskor och djur, samt ett framstaellningsfoerfarande foer detta - Google Patents

Description

A E) 10 15 20 25 2 59.8. . .. ._ _. . nisering av dessa bakterier är möjlig under forutsattning att baküafiecellerna förmår binda till epitelväggarna hos värdorganismen.

För att uppnå ovannämnda effekter erfordras nära nog kon- tinuerlig tillförsel av stora bakteriekulturer. Detta gör det i praktiken svårt att använda detta förfaringssätt.

Flertalet studier av ovan nämnda slag har utförts på djur och uppvisar negativa resultat med avseende på vidhäftning och kolonisering av den specifika bakterieart som använts.

Existerande metoder har följande problem, vilka också omöj- liggör framgångsrika försök: 1.' Administrering av icke artspecifika bakteriestammar, vilka inte uppvisar selektiv kolonisering eller över- levnad. 2. Administrering av bakteriestammar vilkas vidhäftnings- förmàga har undersökts och bestämts i in vitro försök.

Begränsningen häri beror av att mekanismen för adhe- sion inte är definierad och specifik (lektinmedierad) bindning inte kan bestämmas.

Några exempel belyser dessa begränsningar: Hos svin: 1. Lactobacillus acidophilus från livsmedel administrera- des på vanligt sätt.

Lactobacillus sp. som isolerats från djuret administre- rades oralt. ~ Kolonisering erhölls inte i något av dessa fall. 10 15 20 25 30 -P> CN LN U1 KC C30 Hos människa: 3.

Lactobacillus acidophilus och L. bukaricus har admi- nistrerats oralt och initialt visat fördelaktiga ef- fekter dock utan att kolonisering erhållits. Effekter- na försvann dock i regel efter 3 dagar, en nedgång som är i god överensstämmelse med minskningen i antalet Lactobacillusceller i värdorganismen.

Vid vår forskning rörande vidhäftning av mjölksyrebakte- rier, t.ex. Lactobacillus och Streptococcus till mag- tarm- kanalen hos försöksdjur fann vi att den specifika bindningen av bakterierna till epitelceller hos värdorganismen tvärt- emot gängse uppfattning inte medieras av polysackarider utan snarare av ett protein.

Följande punkter utgör basen för den process som ligger till grund för föreliggande uppfinning: a) b) C) d) Mekanismen för specifik bindning av mjölksyrebakterier, t.ex. Lactobacillus och Streptococcus till matstru- pe och mag- tarmkanalen utgörs av ett extracellulärt protein, i fortsättningen refererat till som APP (ad- hesivepromoting protein) på bakterieytan.

APP tillsättes samtidigt med administrering av mjölk- syrebakterier och ökar därmed vidhäftningen av bakte- rieceller.

Odlingsbetingelser och behandlingen av bakterierna för oral administrering kan modifieras för att ge maximal produktion av APP.

Förfarandet för effektiv produktion av APP kan till- lämpas på andra bakteriestammar som skall användas för att kolonisera matstrupen och/eller mag- tarmkanalen.

Uppfinningen belyses ytterligare under hänvisning till följande icke begränsade utföringsexempel, avseende för- sök med djur. 4 63 10 15 20 25 30 598 4 Exempel 1 Odlingsförhàllanden, avseende skörd av och adhesionsbenä- genhet av mjölksyrebakterier har undersökts. Adhesionen bestämdes med ett in vitro adhesionssystem där bakterie- fria delar av mag- tarmkanalen från mus eller svin använ- des. Graden av bindning av bakterfixxfllerna till epitel- ytan bestämdes med både radioaktiv isotopinmärkningsmeto- dik samt med ljusmikroskopi och svepelektronmikroskopi.

I successiva odlingar med ympmaterial från närmast föregåen- de odling minskade adhesionsbenägenheten tydligt, särskilt i normalt använda media för odling av mjölksyrebakterier.

Tillsats av ökade koncentrationer av sackarider ökade emel- lertid adhesionen med en faktor 3. Brain-heart-infusion me- dia innehåller normalt 0,2% glukos. Bakteriecellerna visar ingen adhesion efter successiva odlingar i ett komplext näringsmedium. Däremot gav ett definierat casaminosyrame- dium (CAS), med tillsats av 2% sukros, mjölksyrebakterier med utmärkt adhesionskapacitet till epitelytan i mag- tarm- kanalen (Tabell 1). Förutom sukros kan andra sockerarter, t.ex. glukos och laktos, användas. Andra aminosyrakomposi- tioner än en casaminosyrapreparation kan också användas.

Bakterieceller odlade i ett komplext medium kunde fås att binda om processen genomfördes så att APP bevarades med cellerna. Detta framgår vidare av exempel 2.

Exempel 2 Genom att använda CAS-mediet med förhöjd halt av sackarider kunde en adhesionsbefrämjande proteinínnehâllande förening, APP, som produceras av mjölksyrebakterierna, skördas i supernatanten efter odling. Flera proteinínnehâllande mole- kyler frigöres från bakteriecellerna när de växer i CAS- medium med förhöjd mängd av sackarider. 10 15 20 25 463 598 Med proteinfraktionering av det cellfria odlingsmediet från mjölksyrebakterier, som växt i CAS-medium har APP isole- rats och identifierats. Efter identifiering av APP har APP också påvisats när mjölksyrebakterier har odlats i ett komplefi:brain-heart-infusion (BHI) medium. Molekylvikten av APP har.bestämts till approximativt 14000 med användan- de av ett FPLC-system (Pharmacia).

Bakterier_som inte kan adherera till mag- tarmkanalen kan fås att adherera i närvaro av detta APP. Dessutom erhålles en 4-faldig ökning i adhesion av bakterier, som sedan har förmåga att binda,när APP tillsättes. Detta APP har påvi- sats med användande av värdspecifika stammar av mjölksyre- hkterier, t.ex. släktena Lactobacillus och Streptococcus med vävnader från mag- tarmkanalen från både mus och svin.

TABELL Adhesion av Lactobacillus fermentum till musmage, in vitro Medium Tvätt av Tillsats av adhe- Adhesion bakterier sionsbefrämjande submæms,APP HH æym - - + -"- + - + BHItmoth - - + _".. .|. .... , _.. -"- + 2% sukros - - +++ -"- +-2% mflmos + - + Bflltzoth + + +++ CAS " + 2% sucros + + ++++ CAS " + 2% sucros + - +

Claims (6)

1. A C09 f' l\l \J_ _) PATENTKRAV l. Preparat för att öka vidhäftningen av bakterier till mag-tarmkanalen hos människor och djur, k ä n n e t e c k n a t av att preparatet inne- håller ett vidhäftningsbefrämjande protein, fram- ställt genom odling av mjölksyrabakterier i ett medium innehållande en eller flera sockerarter i förhöjd koncentration, varvid sockerhalten är om- kring 2% över sockerhalten i tillväxtmedium.

2. Preparat enligt patentkrav l, 10 k ä n n e t e c k n a t av att det vidhäftningsbe- främjande proteinet framställts genom odling i ett casaminosyramedium eller i andra aminosyrakomposi- tioner med tillsats av sockerarter i förhöjd kon- centration, företrädesvis i koncentrationer c:a 15 2% över sockerhalten i tillväxtmedium.

3. Preparat enligt patentkrav l - 2, k ä n n e t e c k n a t av att de använda socker- arterna är sukros och/eller glukos.

4. Preparat enligt patentkraven l - 2, 20 k ä n n e t e c k n a t av att använd sockerart är laktos.

5. Preparat enligt patentkrav l - 4, k ä n n e t e c k n a t av att det innehåller icke- patogena tarmbakterier, odlade i ett medium, inne- 25 hållande sockerarter i förhöjd koncentration, före- trädesvis c:a 2% över sockerhalten i tillväxtmedium för bildning av vidhäftningsbefrämjande protein, så att preparatet innehåller det vidhäftningsbe- främjande protein, som bildats under odlingen. 30

6. Preparat enligt patentkrav l -4, k ä n n e t e c k n a t av att det vidhäftningsbe- 'HI 10 l5 20 25 10. ll. l :v98 främjande proteinet framställts separat och där- 465 efter tillförts preparatet. Preparat enligt patentkrav 1 - 4, k ä n n e t e c k n a t av att det innehåller icke- patogena tarmbakterier, odlade i ett medium inne- hållande sockerarter i förhöjd koncentration, före- trädesvis c:a 2% över sockerhalten i tillväxtmedium för bildning av vidhäftningsbefrämjande protein och dessutom innehåller separat tillsatt vidhäft- ningsbefrämjande protein. Förfarande för framställning av protein, som ökar vidhäftningen av bakterier till mag-tarmkanalen hos människor och djur, k ä n n e t e c k n a t av att mjölksyrabakterier odlas i ett medium innehållande en eller flera socker- arter i förhöjd koncentration, företrädesvis c:a 2% över sockerhalten i tillväxtmedium. Förfarande enligt patentkrav 8, k ä n n e t e c k n a t av att odlingen genomföres i ett casaminosyramedium eller i närvaro av andra aminosyror med tillsats av sockerarter i förhöjd koncentration, företrädesvis c:a 2% över sockerhal- ten i tillväxtmedium. Förfarande enligt patentkrav 8 - 9, k ä n n e t e c k n a t av att de använda socker- arterna är sukros och/eller glukos. Förfarande enligt patentkrav 8 - 9, k ä n n e t e c k n a t av att använd sockerart är laktos.