DK172252B1 - Præparat til fremme af vedhæftningen af bakterier til mave-tarmkanal i mennesker og dyr samt fremgangsmåde til fremstilling af et protein med samme egenskaber - Google Patents

Description

i DK 172252 B1

Den foreliggende opfindelse angår et præparat til fremme af mikrobiel kolonisering af spiserør, mave og tarme hos dyr og mennesker ved indgivelse af bakterier, som er gavnlige for værtsorganismen.

5

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af et protein, som forstærker vedhæftningsmekanismen for de ønskede, anvendte bakteriearter.

10 Opfindelsen vil blive beskrevet for og er anvendelig på både dyr og mennesker. Udtrykket "dyr" refererer heri til husdyr, såsom grise, kalve og fjerkræ, såsom kyllinger, kalkuner, gæs og ænder.

15 For tiden er dødeligheden blandt ovennævnte dyr høj ved etablering og kolonisering forårsaget af patogene bakterier i mave-tarmkanalen. De patogene bakterier udkonkurrerer den normale bakterieflora, hæfter sig til tarmens vægge, fremkalder sygdomssymptomer, såsom diarré, 20 og resulterer i forøget dødelighed. Tabene i nogle hjorde eller flokke som følge af udbrud af sygdomme forårsaget af patogene bakterier, såsom Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Salmonella sp., Shigella sp. og Clostridium perfringens, er betragtelige.

25

Der er løbende blevet udført talrige forsøg på at introducere ikke-patogene bakterier i mave-tarmkanalen til forebyggelse eller fjernelse af kolonisationen af patogene bakterier. Oral indgivelse af forskellige 30 Bacillus-typer i mennesker har vist sig at reducere risikoen for cancer i tyktarmen og fremme fjernelsen eller udkonkurreringen af patogene tarmorganismer såvel som værende af terapeutisk værdi hos ældre patienter. Ækvivalente studier hos dyr og mennesker er blevet udført 35 med den fælles faktor, at bakterier introduceres i mavetarmkanalen til forbedring af sundhedstilstanden og 2 DK 172252 B1 forøget overlevelse i værtsorganismen. Kolonisering med disse bakterier er mulig forudsat, at bakteriecellerne er i stand til at hæfte sig til værtsorganismens epithelvægge.

5

Der kræves imidlertid en næsten kontinuerlig tilførsel af store bakteriekulturer til opnåelse af ovennævnte resultater, hvilket gør fremgangsmåden upraktiserbar.

10 De fleste undersøgelser af ovennævnte type er blevet udført på dyr og har givet negative resultater med hensyn til vedhæftning og kolonisering med den anvendte, specifikke bakterietype. Eksisterende fremgangsmåder er behæftet med nedenstående problemer, som også forhindrer 15 vellykkede forsøg: 1. Indgivelse af ikke-specifikke typer af bakteriestammer, som ikke udviser selektiv kolonisering eller overlevelse.

20 2. Indgivelse af bakteriestammer, hvis vedhæftnings- evne er blevet undersøgt og bestemt ved in vitro forsøg. Begrænsningen er her den, at vedhæftningsmekanismen ikke er defineret, og der 25 kan ikke bestemmes specifik (lectinformidlet) binding.

Nogle eksempler illustrerer disse begrænsninger: 30 I grise: 1. Lactobacillus acidophilus fra fødevarer blev indgivet på normal måde.

35 2. Lactobacillus sp., som var blevet isoleret fra dyret, blev indgivet oralt.

3 DK 172252 B1

Der blev ikke opnået kolonisering i noget tilfælde.

I mennesker: 5 3. Lactobacillus acidophilus og L. bulgaricus blev indgivet oralt og fremviste til at begynde med gunstige resultater, men uden at der opnåedes kolonisering. Resultaterne forsvandt almindeligvis 10 efter 3 dage, hvilket er et tilbageskridt, som stemmer godt overens med reduktionen i antallet af Lactobacillus-celler i værtsorganismen.

Ved undersøgelse af mælkesyrebakteriers vedhæftning, 15 f.eks. Lactobacillus-slægten og Streptococcus-slægten, til mave-tarmkanalen i laboratoriedyr viste det sig i modsætning til almindelig anerkendt formodning, at specifik binding af bakterien til epithelceller i værtsorganismen ikke formidles af polysaccharider men 20 snarere af et protein.

De følgende punkter udgør den basis, på hvilken nærværende opfindelse bygger.

25 a) Mekanismen til specifik binding af mælkesyrebakterier, f.eks. Lactobacillus-slægten og Streptococcus-slægten, til spiserøret og mavetarmkanalen består af et extracellulært protein, som i det følgende omtales som det adhæsionsfrem- 30 mende protein (APP, engelsk: adhesive promoting protein), på bakterieoverfladen.

b) APP gives medens der samtidig indgives mælkesyrebakterier, hvilket forøger bakteriecel- 35 lernes vedhæftning.

4 DK 172252 B1 c) Dyrkningsforhold og behandling af bakterier til oral indgivelse kan modificeres til frembringelse af maksimal produktion af APP.

5 d) Fremgangsmåden til effektiv fremstilling af APP kan anvendes på andre bakteriestammer, som skal benyttes til kolonisering af spiserøret og/eller mave-tarmkanalen.

10 I overensstemmelser hermed angår opfindelsen et præparat til fremme af vedhæftningen af bakterier til mavetarmkanalen i mennesker og dyr, der er ejendommeligt ved, at det indeholder et vedhæftningsfremmende protein, som 15 er fremstillet ved dyrkning af mælkesyrebakterier i et medium, der indeholder en eller flere sukkerarter i forhøjet koncentration, idet sukkerindholdet ligger ca.

2% over sukkerindholdet i vækstmedium.

20 Endvidere angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af et sådant vedhæftningsfremmende protein, der er ejendommeligt ved, at mælkesyrebakterier dyrkes i et medium, der indeholder en eller flere sukkerarter i forhøjede koncentrationer, fortrinsvis ca. 2% over 25 sukkerindholdet i vækstmedium.

Opfindelsen illustreres yderligere af følgende ikke-begrænsende eksempler, som angår forsøg med dyr.

30 Eksempel 1

De dyrkningsforhold, som angår mælkesyrebakteriers indhøstnings- og vedhæftningsevne, blev undersøgt.

Vedhæftningen blev bestemt i et in vitro 35 vedhæftningssystem under anvendelse af bakteriefrie dele af mave-tarmkanalen fra mus eller grise. Omfanget af 5 DK 172252 B1 bakteriecellebinding blev bestemt ved anvendelse af både en fremgangsmåde med radioaktiv isotopmærkning og ved lysmikroskopi og scanderingselektronmikroskopi.

Vedhæftningen aftog mærkbart ved subdyrkning, især i 5 normalt anvendte medier til dyrkning af mælke syrebakterier. Tilsætning af saccharider i større omfang forøgede vedhæftningen med en faktor på 3. Hjerne-hjerte-infusionsmedier indeholder normalt 0,2% glucose. Bakteriecellerne udviste ingen vedhæftning efter at være 10 blevet subdyrket i komplekse næringsmedier. På den anden side resulterede et nærmere bestemt casaminosyremedium med tilsætning af 2% sucrose i mælkesyrebakterier med god vedhæftningsevne til epithelcellerne i mave-tarmkanalen (tabel 1). Andre sukkertyper, f.eks. glucose og lactose, 15 kan anvendes lige så vel som sucrose. Der kan også anvendes andre aminosyresammensætninger, som er forskellige fra casaminosyre. De bakterieceller, som dyrkes i et komplekst medium, kunne vedhæfte, hvis de behandledes således, at APP blev bevaret sammen med 20 cellerne. Dette illustreres yderligere i eksempel 2.

Eksempel 2

Anvendelse af CAS-medium med forhøjede indhold af 25 saccharider muliggjorde indvinding af en proteinholdig forbindelse APP, som fremmer den vedhæftning, der frembringes af mælkesyrebakterier, fra supernatanten efter dyrkningen. Der udskilles adskillige proteinholdige molekyler fra bakteriecellerne under vækst i CAS-medium 30 med forøgede indhold af saccharider. Proteinfraktionering af dyrkningssupernatanten fra mælkesyrebakterier, som er dyrket i CAS-mediet, har vist, at APP kan identificeres og isoleres.

35 Da det en gang var blevet identificeret, blev dette APP også påvist, når mælkesyrebakterier blev dyrket i en 6 DK 172252 B1 kompleks hjerne-hjerte-infusionsbouillon (BHI).

Molekylvægten af APP er blevet bestemt til ca. 14.000 under anvendelse af et FPLC-system fra Pharmacia. De bakterier, som ikke kan hæfte sig til mave-tarmkanalen, 5 er imidlertid i stand til at vedhæfte sig i nærværelse af dette APP. Ved siden af dette opnås der en 4-folds forøgelse i vedhæftningen af bakterier, som allerede besidder evnen til binding, når der tilsættes APP. Dette APP er blevet påvist ved anvendelse af værtsspecifikke 10 stammer af mælkesyrebakterier, f.eks. Lactobacillus-slægten og Streptococcus-slægten, til væv fra mavetarmkanalen fra både mus og grise.

DK 172252 B1

Tabel 1 7

Vedhæftning af Lactobacillus fermentum til musemave, in vitro.

5

Tilsætning af vedhæft-

Vask af ningsfremmende Ved-

Medium bakterier protein APP hæftning 10 BHI-agar - + " + + BHI-bouillon - + 15 " + " + 2% sucrose - - +++ 20 " + 2% sucrose +- + BHI-bouillon + + +++ CAS-bouillon 25 + 2% sucrose + + ++++ CAS-bouillon + 2% sucrose +- +

Claims (11)

1. Præparat til fremme af vedhæftningen af bakterier til mave-tarmkanalen i mennesker og dyr, kende- 5 tegnet ved, at det indeholder et vedhæftnings-fremmende protein, som er fremstillet ved dyrkning af mælkesyrebakterier i et medium, der indeholder en eller flere sukkerarter i forhøjet koncentration, idet sukkerindholdet ligger ca. 2% over sukkerindholdet i 10 vækstmedium.

2. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det vedhæftningsfremmende protein er fremstillet ved dyrkning i et casaminosyremedium eller i andre 15 aminosyresammensætninger med tilsætning af sukkerarter i forhøjede koncentrationer, fortrinsvis i en koncentration på ca. 2% over sukkerindholdet i vækstmedium.

3. Præparat ifølge krav 1 eller 2, kendeteg-20 net ved, at de anvendte sukkerarter er sucrose og/eller glucose.

4. Præparat ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at den anvendte sukkerart er lactose. 25

5. Præparat ifølge et af kravene 1-4, kendetegnet ved, at det indeholder ikke-patogene tarmbakterier, der er dyrket i et medium, som indeholder sukkerarter i forhøjede koncentrationer, fortrinsvis ca. 30 2% over sukkerindholdet i tilvækstmedium, under dannelse af vedhæftningsfremmende protein, således at præparatet indeholder det vedhæftningsfremmende protein, som er dannet under dyrkningen. DK 172252 B1

6. Præparat ifølge et af kravene 1-4, kendetegnet ved, at det vedhæftningsfremmende protein er fremstillet særskilt og derefter er tilsat præparatet.

7. Præparat ifølge et af kravene 1-4, kendetegnet ved, at det indeholder ikke-patogene tarmbakterier, som er dyrket i et medium, der indeholder sukkerarter i forhøjede koncentrationer, fortrinsvis ca. 2% over sukkerindholdet i vækstmedium, til dannelse af 10 vedhæftningsfremmende protein, og desuden indeholder særskilt tilsat vedhæftningsfremmende protein.

8. Fremgangsmåde til fremstilling af protein, som fremmer vedhæftningen af bakterier til mave-tarmkanalen i 15 mennesker og dyr, kendetegnet ved, at mælkesyrebakterier dyrkes i et medium, der indeholder et eller flere sukkerarter i forhøjede koncentrationer, fortrinsvis ca. 2% over sukkerindholdet i vækstmedium.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at dyrkningen gennemføres i et casaminosyremedium eller i nærværelse af andre aminosyrer med tilsætning af sukkerarter i forhøjede koncentrationer, fortrinsvis ca. 2% over sukkerindholdet i vækstmedium. 25

10. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 8 eller 9, kendetegnet ved, at de anvendte sukkerarter er sucrose og/eller glucose.

11. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 8 eller 9, kendetegnet ved, at den anvendte sukkerart er lactose.