CN1233285A - 家畜粘膜竞争性排斥培养以减少肠致病性细菌 - Google Patents
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Abstract
培养来自健康动物刮下碎屑并施用至动物。该制品赋予抵御随后由肠致病性细菌,包括沙门氏菌类、弯曲杆菌类和大肠杆菌0157:H7的定居以强有力的措施,其中所述的细菌导致人类异常高的发病率和致死率以及降低家畜种群的生产力。
Description
发明背景
发明领域
本发明涉及从无病原体哺乳动物肠道制备的细菌培养物。其也涉及该培养物的传代培养和用此传代培养物保护家畜免受肠致病性细菌定居的方法。
相关领域描述
肠病原体，如沙门氏菌和大肠杆菌0157:H7导致人类异常高的发病率和致死率并且降低家畜种群的生产力。人类胃肠病原体一般来自人类消费肉类的肠道污染，在1995年1月召开的有关从农场到餐桌追踪食物传染的病原体：数据需要评价对照组的专题讨论会上，提出的问题是“食物传染的疾病有多重要？”(从农场到餐桌追踪食物传染的病原体：数据需要评价对照组，华盛顿特区，3-29,1995)。宣称在美国，每年估计有650万到3,300万的食物传染病例，导致达9,000例死亡。USDA经济研究部估计美国用于7种食物传染病原体的医药费用和生产力损失达56亿到94亿美元。Menning估计在美国每年有超过500万肉类和家禽食物传染病例并且较大的比例可归就于沙门氏菌和弯曲杆菌感染(美国兽医协会会刊，192卷，494-497,1988)。Roberts估计每例沙门氏菌病损失700美元(美国农业经济杂志，71卷，468-474,1989)。根据对别的国家估计食物传染疾病的调查，作出以下的估计将不会是不合理的，即每年世界范围内可归就于沙门氏菌的食物传染腹泻的数量超过1000亿，估计损失超过250亿美元。这些病原体同时造成疼痛、痛苦和生命的丧失。此外，肠致病性细菌也可经家畜感染而造成实际的经济损失。
竞争性排斥(CE)技术用于减少肠致病性细菌在家禽中的定居。Nurmi等(自然，241卷，210-211,1973)发现来自成熟健康鸡的制品赋予还没有建立抵抗沙门氏菌定居的微生物区系(microflora)的小鸡以保护措施。施用未鉴定的CE制品至小鸡加速了新孵出鸟类肠道菌群的成熟并且提供了用于从成鸡传递微生物区系至其后代的自然过程的培养基。
Snoeyenbos等(美国专利No.4,335,107,1982年6月)通过冷冻干燥粪便并厌氧培养此制品而开发了用于预防沙门氏菌定居的CE微生物区系技术。Mikola等(美国专利No.4,657,762,1987年4月)用肠道粪便和盲肠内容物作为CE微生物区系的来源用于预防沙门氏菌定居。用此种培养物处理需要培养基无氧且pH达到平衡。
Stern等(美国专利Number5,451,400,1995年9月19日)公开了用于保护家禽免受沙门氏菌和弯曲杆菌定居的粘膜CE组合物，其中刮下预先洗过盲肠的粘蛋白层并且厌氧培养保持于无氧环境中的刮下来的碎屑。
Nisbet等(美国专利No.5,478,557；1996年12月26日)公开了一种微生态制剂，其可从多种家养动物，包括但不限于家禽(fowl)同时也包括马、猪和牛中获得。Nisbet等描述稳定而确定的微生态制剂优选通过直接从成年目标动物粪便、盲肠和/或大肠内容物制备的一批培养物的连续培养而获得。他们进一步描述大量的该微生态制剂可或者是批量培养或者是连续培养而制备，其中的批量培养一直持续到乙酸浓度大于或等于约20mM，丙酸浓度大于或等于约10mM并且丁酸加上异丁酸的浓度大于或等于15mM。
Asplund等(应用细菌学杂志，81卷，217-223,1996)报导了一种猪肠道的体外模型及其使用以显示猪回肠和盲肠微生物区系对小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)0∶3的抑制。收集盲肠及小肠的distil部分，保存于无菌条件下并且收集、合并和培养内容物。盲肠和回肠接种显示抑制培养的小肠结肠炎耶尔森氏菌的生长，其中盲肠系统较回肠系统更为有效一些。
本发明首次提供了用于减少体内和/或预防肠致病性细菌对哺乳动物，特别是家畜定居的组合物和方法。
发明概述
因此，本发明的一个目的是提供动物粘膜来源的传代培养用于控制肠致病性细菌在动物中的定居。
本发明的另一个目的是通过用来自粘膜培养物的制品处理动物以控制肠致病性细菌在动物中定居的方法。
通过下面的描述，进一步的目的和优势将变得显而易见。
发明详述
在过去的十几年内越来越认识到人类肠道感染的重要性。家畜污染和人类感染间关系同样受到详细记录。在生产和加工动物如家畜过程中，含有病原体的粪便物质可能被转移到肉中并一直维持到食物加工厨房。猪，与家禽、家畜和海产品一起为沙门氏菌重要的载体(Bean等食物保护杂志，53卷，804-817,1990；Lammerding等，食物保护杂志，51卷，47-52,1988)。幼小动物被污染的食物、导入该种群中的长期载体、感染的啮齿类或污染的农场员工所感染(Heard,Vet.Rec.,85卷，482-484,1969；Williams等，J.Hyg.Camb.,66卷，281-293,1968；Wilcock等，猪中的疾病，Leman等编，爱荷华州立大学出版社，Ames IA,570-583,1992；Duhamel等，第12届国际专题讨论会论文集，新的和正在出现的传染病，San Diego,CA,381,1992)。对于猪来说，在屠宰场，最初的污染源为载体猪，并认为传递通过猪-到-猪间的接触或暴露至污染的物理环境而发生(Newell等，美国兽医协会会刊，158卷，89-98,1971)。这些感染的动物反过来污染房屋、设备和员工导致终产品的污染(Williams等，美国大众健康杂志，60卷，926-929,1970；Newel等，见上；Morgan等，流行病学感染，98卷，323-330,1987)。然而，最初的来源保持该载体猪。由于缺乏有关家畜中沙门氏菌的流行病学和病原发生方面的信息，目前鉴定和根除家畜中载体种群的努力受到阻碍。因为沙门氏菌种类广泛分布并很好地存留于环境中，去除和控制困难。存在大量关于与人类病原发生有关沙门氏菌毒性的信息。然而，很少得到有关该感染物质动物来源的信息。对生产食物动物来源中感染过程的理解认为具有更大的优越性并且载体动物的控制和排除将阻止该疾病的寄生虫传播。食物传染疾病的控制可经鉴定和根除载体种群而最好地获得。既然载体状态可发生于整个动物生活周期中的任何时间，出生时的暴露将是被暴露至此病原体动物的第一次机会。应用粘膜培养用于控制病原体在生产食物动物中的定居已被发现。术语控制意为减少或预防肠致病性细菌的定居。术语生产食物动物意为由人类所消耗的任何动物。
从无病原体动物的肠道刮下的碎屑中获得独特的细菌培养物。此动物可以为任何的年龄，最优选的是使用年幼的动物以保护新生和更年长的动物。将起始的培养物传代培养且然后施用至年幼的动物。本发明方法可应用于无论是家养还是野生的任何动物且特别是饲养用于人类消耗并可用作靶病原体载体的家畜。家畜包括牛、小牛、食用猪、猪、绵羊、羔羊、水牛、山羊、兔、海产品等。在分娩后头24小时内二次施用家畜粘膜竞争性排斥传代培养物(LMCES)制品是优选的。然而，该制品可，例如，在动物生活中任何时间，如连续基础或整个动物生活周期的选定时间施用。术语“连续基础”意为LMCES的持续来源通过经饮水、食物口腔管饲法或雾化的施用来提供。对于连续基础，LMCES可每日、每周、每月等以食物或水施用。术语“动物整个生活周期的选定时间”意为在关键的控制点施用LCME，如在出生、断奶、疾病、抗生素施用、过热、脱水、冷、运输过程中如在生产过程中转移至其它建筑及运输至屠宰场等之前进行。
靶病原体包括所有能够定居在动物，尤其是饲养用于人类消耗家畜中的人类肠致病性细菌。如这里所用的，“人类肠致病性细菌”为能够或已知定居于人消化道或在其中散播毒素并能够导致人类宿主肠道疾病的细菌。人类肠致病性细菌的实例包括但不限于沙门氏菌类、弯曲杆菌类和大肠杆菌。
LMCES可与有效控制动物中沙门氏菌的其它培养物或处理物，例如乳酸杆菌、果糖寡糖(fructooligosaccharides)和酵母联合。只要其不影响LMCES制品的活性可将其它常规或已知的动物处理物，并且特别是用于肠病原体抑制的处理物加入到LMCES中。
在本发明方法中，家畜粘膜竞争性排斥传代培养物(LMCES)的组合物被施用至动物。如这里所使用的，“施用”包括本领域已知的用于口腔运送该组合物至动物的任何合适的方法，例如通过口腔管饲法、喂食、喷洒或经施用的牛奶等应用膏状物至母本乳头或人工乳头。LMCES也可经低位肠开口(lower intestinal opening)施用。该制剂可以为本领域已知的任何形式用于施用，如液态、膏状、凝胶帽(gel cap)或气溶胶形式。LMCES制品在任何年龄包括新出生的动物以至少有效减少在动物肠道中发现的人类肠致病性细菌的量施用至动物。如这里所使用的，‘细菌的减少’或‘至少减少人类肠致病性细菌’指与没有根据本发明方法接受治疗的动物中预期的情况相比细菌数量的减少。任何准确的测量、计数和比较存在于动物肠道中细菌的方法可用于此比较，这些方法对本领域的技术人员将是显而易见的。如这里所用的，“以有效量”、或“有效量”指施用的LMCES制品的量，其中施用的效应至少减少在所有年龄动物中发现的人肠致病性细菌。施用的量将随被处理动物的大小和施用方法而变化。对于小型动物，包括小型的新出生的动物，可通过口腔管饲法施用约4-8ml第二次或后来传代的48小时传代培养LMCES培养物，其中5ml为优选的剂量。对于大型动物，包括大型新生的动物，LMCES的第二次48小时传代培养物或后来的培养物可在液体悬液中不加稀释或稀释达大约10倍用于口腔施用，其中的稀释剂可以为，例如，牛奶、水等。其它的传代培养物也可利用但很可能将不太有效。稀释和未稀释的液态LMCES制品均可直接施用。对于新生的动物，在出生后约2-48小时内，更优选约出生后2-6小时给以LMCES制品，接着在大约18-24小时后给以第二次剂量。最优选的处理方案为出生后约6小时给以第一次剂量然后在出生后约24小时给以第二次剂量。一般地，第一次处理剂量在断奶、运输或转移至其它建筑物前2到48小时给予，优选的时间约2-6小时。在这些实例中，可能仅一次处理是需要的但第二次处理可在第一次处理后18-24小时施用。处理方案的变化将反映商业畜牧业的实践。在断奶、生产设备转移之前或运输至屠宰场之前可给以额外的剂量。如果以喂食或饮水给予，每日施用将发生。
LMCES制品通过无菌去除动物低位肠包括盲肠并将其置于无菌容器中而加以制备。如果这里所使用的，低位肠定义为从胃末端起始的部分并且包括盲肠。将此容器在制备培养物的整个过程中保存于无氧环境中。将选定长度的该肠通过本领域已知的任何方法加以内翻。通过联合清洗和刮擦去除肠的内容物。清洗用适当的无氧介质进行。清洗步骤可利用任何对所述目的有效的介质，包括水。优选的介质为无氧介质，特别优选的为预先还原的、Eh平衡的无氧介质。表面刮擦用钝端的工具，例如钝端的手术刀片进行。刮擦后，再次清洗里衬然后以锋利末端的工具，例如锋利端手术刀或其它合适的工具刮擦。以上述介质清洗此锋利末端的工具和里衬壁以获得上皮细胞和其固有的微生物区系并将清洗物收集于无菌瓶中。此组织也可不经第一次刮擦而直接切入培养基中。当开始此步骤时将组织维持于还原的环境中，即氮气环境中是优选的。悬浮具有附着上皮细胞和微生物区系的清洗物或切下的节段并将此内容物接种至无菌无氧培养基中培养。如这里所使用的，术语微生物区系欲包括固有的细菌。将该培养物于大约35-40℃无氧孵育约48小时，转移至新鲜无氧培养基中并再次孵育约48个多小时。此第二次孵育为第二个48小时传代培养并且为所用的最为优选的LMCES制品。其它传代培养物也可按上述使用。然后用任何适当的和常规的分离技术分析该培养物中人类肠病原体的存在。无病原体的培养物立即施用、冷冻干燥或用冷冻培养细胞的常规技术加以冷冻。应该血清学测试供体动物血液对永久宿主动物包括人、病原体的抗体水平。应该使用仅仅来自没有血清转变的动物的培养物。
下面的实施例仅仅意在进一步说明本发明且并不意在限制由权利要求所定义的本发明范围。
实施例1
家畜牛粘膜CE培养物的制备
从当地屠宰场获取健康成年牛的肠并于1小时内于塑料袋内的无菌无氧环境中运输至实验室。去除待用场的碎片之前，用线扎紧周围区域以防止肠内容物的泄漏。无菌取下约4到5英寸长度并置于无菌容器中。然后将容器置于一直充满无氧氮气的盆中。所有的操作在该盆边缘以下进行以保持该培养物在无氧环境中收获。将一段肠组织小心地内翻于无菌玻棒上而不触及内表面。一旦内翻出来，联合清洗和刮擦去除内容物。通过注射器应用预先还原的心脑灌注培养基(PR-BHIB)完成清洗。任何其它适当的无氧培养基可用于该清洗步骤。用无菌手术刀片的钝端完成刮擦。清洗、刮擦且然后再次清洗里衬。此时在刮擦中用手术刀锋利端轻轻刮下盲肠上皮是优选的。然而，该组织可直接切入到培养基中。刮擦内翻的肠之后，再次以PR-BHIB清洗手术刀和里衬壁末梢。将这最后一次清洗物收集于无菌瓶中。用无菌注射器和针头抽吸具有附着上皮和细菌细胞的清洗物并经橡皮中隔(rubber septum)用于接种至无菌PR-BHIB的管中。将这些管于35℃孵育48小时，转移并再孵育第二个48小时。检查培养物中人目的肠病原菌如沙门氏菌、大肠杆菌和弯曲杆菌种类的存在。如果该培养物既无人类又无动物病原体并认为是安全的，那么其可立即使用或保存供以后使用。
实施例2
牛LMCES效率的检测
将上述实施例1中所述的牛LMCES组合物施用至出生约头24个小时内的新生小牛约2次。通过用瓶和橡皮乳头口腔给以此培养物。每次施用中每只处理的小牛接受约500ml未稀释或以牛奶稀释约10倍的LMCES。施用后，让小牛正常取食。施用后约24小时，每只小牛通过口腔管饲法给以约108个细胞的萘啶酸抗性的大肠杆菌0157:H7。接种后，将这些小牛饲养于隔离室中约7天以让任何路过的大肠杆菌0157:H7细胞穿过(clear)肠道。然后杀死小牛，无菌取下盲肠并置于无菌塑料袋中。然后分析此盲肠大肠杆菌0157:H7的存在和水平。将整组每克盲肠的靶病原体平均对数值称为定居因子(CF)。将CF比率(未处理对照/CF(处理组))称为保护因子(PF)。通过比较一种粘膜CE培养物的PF与另一种培养物的PF，得到此培养物保护程度的相对值。
实施例3
猪粘膜CE培养物的制备
用本领域常用的混合药物将健康、约1到6月龄至完全成熟的小猪镇定。使用8mg/kg氯胺酮、6mg/kg和4mg/kg甲苯噻嗪的混合物。然后通过放血杀死该猪。无菌取下一段盲肠并置于无菌碟中。然后将该碟置于始终充满无氧氮气的盘中。所有操作必须在该盘的边缘以下完成以维持该培养物收获于无氧的环境中。将该段盲肠小心地内翻于无菌工具上而不触及内表面。一旦内翻，通过联合清洗和刮擦去除内容物。清洗通过注射器施用预还原的培养基完成。刮擦用无菌工具的钝端完成。清洗、刮擦且然后再次清洗里衬。此时盲肠上皮用手术刀锋利端轻轻刮下或可切成小段(约5cm)。刮擦翻转的盲肠后，再次以PR-BHIB清洗手术刀和里衬壁末梢。将此最后的清洗物或盲肠节段收集于无菌瓶中。用无菌注射器和针头抽吸具有附着细菌细胞的清洗物，用经橡皮中隔用于接种至无菌PR-BHIB的管中。将这些管于大约35℃孵育约48小时、转移并再次孵育约第二个48小时。检测该培养物人类目的肠病原体如沙门氏菌、大肠杆菌和弯曲杆菌种类的存在。如果该培养物无病原体并认为是安全的，那么其可立即施用或保存。
实施例4
家畜猪粘膜CE培养物(LMCES)效率的测定
将已知产仔日期的母猪保存于隔离的产仔箱中。在已知产仔日期之前的一天开始每4小时检查每只母猪以确保第一次LMCES培养物以及时的方式施用。产仔时，让小猪哺乳以确它们获得初乳并且在出生后约2和6小时间通过口腔管饲法给每只小猪施以约5ml的LMCES。在大约24小时施用约5ml的第二次剂量。出生后约48小时(最后一次LMCES施用后24小时)通过鼻内灌注给这些小猪接种以约103CFU的猪霍乱沙门氏菌。施用该制品后，让小猪正常取食。接种后7天内每天给每只小猪测直肠温度和取直肠棉拭培养沙门氏菌。约接种后第7天，杀死所有小猪并进行尸体解剖。收集组织用于定性细菌学并且包括扁桃体(ton)、下颌淋巴结(mln)、肺、臂(brachiale)淋巴结(bln)、肝脏、胰腺(spl)、中回肠、回肠结节(junction)(icj)、回肠淋巴结、盲肠(cec)、盲肠内容物(cc)、结肠(col)、结肠淋巴结和胃壁(sw)。定性细菌学也在盲肠内容物和回肠连接上进行以测定组织内沙门氏菌的水平。
为了分析母猪对小猪可能具有的影响，在产仔前、产仔后约48小时内以及小猪接种后约第7天也收集和培养母猪粪便(母猪从不直接接种猪霍乱沙门氏菌)。对照小猪没有给以LMCES但在约48小时龄接种。按上述收集和处理组织。
在整个实验过程中所有小猪的临床表现不明显。沙门氏菌从直肠棉拭的回收是可变的。然而，LMCES处理的小猪约有41％的组织为阳性而对照小猪约63％的组织为阳性(表1，试验1和2小结)。来源于阴性母猪(试验1-母猪1、2、3及试验2-母猪2)小猪的组织为阳性而对照母猪78％[47/60](实验1-对照母猪阴性)组织为阳性。CE处理较未处理小猪得到了沙门氏菌的减少。当与对照组比较时在LMCES处理小猪的盲肠内容物(CC)或回肠连结(ICJ)中观察到约2到5个沙门氏菌的对数减少(log reduction)(分别来自2和1号母猪的小猪的ICJ和CC中清除沙门氏菌)(表2，试验1和2)。在试验1中，所有的母猪均无病原体。所有母猪最初流出一个血清组(Shedding one serogroup)然后在产仔前停止。产仔时，母猪1和对照母猪流出血清组B。在试验2中，来自母猪1和2的小猪仅流出B型沙门氏菌并且没有接种物猪霍乱沙门氏菌。试验1和2的对照没有接受任何LMCES。仅有接种物有机体。如可见到的，不仅有接种有机体水平下降而且有本来定居水平的下降。虽然在已定居有沙门氏菌而不是从接种物接受病原体的小猪中观察到下降，但保护程度的下降表明在哺乳的小猪中，可确保以更早的施用。
前面的详细描述是用于说明的目的。这些细节仅是为了该目的并且本领域的技术人员在不偏离本发明精神和范围的情况下可作出变动。
表一
提供LMCE处理或未提供(对照)处理小猪中
沙门氏菌的出现率和水平
小结
Log10/g
棉拭 ％POS 组织 ％POS CC ICJ竞争排斥 57/281 20.3 157/380 41.3 3.19 3.13
对照 72/114 63.2 95/150 63.3 5.09 5.45
表二
在提供LMCE处理或未提供(对照)处理小猪中
接种后2天沙门氏菌的出现率和水平试验1：母猪/ NO.POS. NO.POS. ％POS. Log10 log10小猪编号Pass.No. 棉拭 组织 组织 CC ICJ1-//2 0 36/40 90 3.86 3.652-//2 1 21/60 35 2.51 3.353-/12 4/5 2 43/120 36 1.5 0和 Ns 100/220 45 3.16 3.14对照 C/6 0 47/60 79 5.39 5.74所有母猪阴性组织
扁桃体 臂淋 肺 肝脏 胰腺 结肠 回肠 盲肠 盲肠 胃臂
巴结 连接 内容物1(4) 3 4 4 3 4 4 4 3 4 32(6) 0 3 3 3 3 0 4 2 2 13(12) 2 12 9 7 6 0 3 1 3 0c(6) 4 4 5 5 5 5 5 5 5 4试验2：所有沙门氏菌母猪/ No.Pos. No.Pos. ％Pos. log10 log10小猪编号Pass.No. 棉拭 组织 组织 CC ICJ1+/7 4/4 50/56* 37/70 53 2.32 1.382-/9 6/7 4/49* 20/90 22 -0- -0-和 na 57/160 36 2.02 1.08C+/9 72/72* 48/90 53 3.33 4.23*仅流出B续表二组织
扁桃体 臂淋 肺 肝脏 胰腺 结肠 回肠 盲肠盲肠 胃臂
巴结 连接 内容物1(7) 2 6 6 5 4 4 4 2 4 02(9) 1 5 3 2 3 1 1 2 2 0c 2 3 3 3 2 6 9 9 9 2仅仅Cl：母猪/ No.Pos. No.Pos. ％Pos. log10 log10小猪编号 Pass.No.棉拭 组织 组织 CC ICJ1+/7 4/4 na 19/70 27 -0- -0-2-/9 6/7 na 18/90 20 -0- -0-和 na 37/160 23 -0- -0-C+/9 na 16/98 18 2.98 4.23组织
扁桃体 臂淋 肺 肝脏 胰腺 结肠 回肠 盲肠 盲肠 胃臂
巴结 连接 内容物1(7) 1 5 5 4 4 0 0 0 0 02(9) 1 5 3 2 3 1 1 1 1 0C 1 3 3 2 2 1 1 1 1 1
Claims (9)
1．用于处理家畜的方法包括
提供来自无病原体动物的家畜粘膜竞争性排斥培养物，和
施用所述的培养物至动物，
其中所述动物与预期没有所述施用步骤的动物相比具有至少降低水平的人类肠致病性细菌。
2．权利要求1的方法，其中所述的培养物在至少出生约48小时内施用至所述的动物。
3．权利要求1的方法，其中所述的培养物在生命的大约头24小时内施用约2次。
4．权利要求1的方法，其中所述的培养物在出生后约6小时内施用至所述的动物且然后在出生后约24小时内再次施用。
5．权利要求1的方法，其中所述的培养物在应急的时候施用。
6．权利要求1的方法，其中所述的培养物在动物的整个生命周期中施用。
7．权利要求1的方法，其中所述的培养物为厌氧培养物。
8．权利要求1的方法，其中所述的人类肠致病性细菌选自沙门氏菌、弯曲杆菌、大肠杆菌及其混合物。
9．权利要求1的方法，其中所述的培养物以至少减少人类肠致病性细菌在所述动物内定居的有效量施用。
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