CN1857326A - 一种乳酸芽孢杆菌微生态制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体公开了一种乳酸芽孢杆菌微生态制剂及其制备方法与应用。本发明采用产芽孢乳酸杆菌为出发菌种，利用液体发酵法进行菌种培养。先对菌种进行扩大培养，然后接种到发酵罐中发酵，结束后采用离心机离心收集菌体，然后添加载体进行气流干燥，最大限度的实现了菌体含量和产量的稳定。在饲料中添加该微生态制剂可以代替目前作为生长促进剂的抗生素或激素类产品，不仅可以解决畜产品药物残留的问题，还可以起到促进动物健康，改善动物肉质等多项功能。

Description

一种乳酸芽孢杆菌微生态制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种乳酸芽孢杆菌微生态制剂及其制备方法与应用。

背景技术

微生态制剂是指摄入动物体内可以促进动物胃肠道微生态平衡或增强非特异性免疫功能来预防疾病，间接起到促进动物生长作用和提高饲料转化率的活性微生物培养物。研究表明，以乳酸菌为主的微生态制剂可以替代饲料中添加的抗生素。饲喂含微生态制剂的饲料可以大大减少抗生素的使用量，避免抗生素在动物体内的高残留问题，提高肉类产品的质量，对我国养殖业和肉类出口有重大的意义。

乳酸菌是微生态制剂中最重要的一类，可以促进营养物的消化吸收，产生乳酸等物质抑制肠道腐败菌、致病菌的繁殖，抑制肠道感染，解除腹泻，并具有免疫赋活等作用。但一般乳酸菌对干燥、高温、胃酸和胆汁等不良环境因子的抗性差，能活着进入肠道的乳酸菌种类和数量不多，目前市场上大部分产品都存在活菌数衰减的问题。

由于抗生素的药残问题，微生态制剂取代抗生素作为饲料添加剂越来越普及。微生态制剂作为安全的生物制品，在饲料中添加可以预防和治疗动物胃肠道感染，增强动物免疫力，促进动物生长，不存在使用抗生素时的体内药物残留问题，美国准许直接饲喂的微生物已有40多种，年使用量在10000吨以上；在欧洲仅法国市场上销售的微生态制剂品种就不下50个；日本估计使用量也在1000吨以上；我国对微生态制剂的开发利用起步比较晚，尽管发展比较快，但一直都没有比较理想的产品面世，进口的产品价格比较昂贵，所以用量并不高，目前年使用量也在1000吨左右。

乳酸菌在维护人和高等动物机体健康方面的作用为越来越多的研究工作者所注目，目前在食品、饮料、饲料、医药等方面已广泛应用。目前我国市场上的微生态制剂产品大部分都为性能较差的枯草芽孢杆菌制剂或地衣芽孢杆菌制剂，现有的乳酸菌制剂也大都因对不良环境抗性差而产品性状极不稳定，因而在对抗生素的取代方面无根本性进展。我国饲料行业微生态制剂的生产除菌种比较落后外，生产厂家大都采用固体发酵法生产微生态制剂，生产出来的产品稳定性较差。

发明内容

本发明的目的是克服上述现有微生态制剂存在活菌数衰减的问题，采用能够耐热、耐干燥和耐酸的乳酸芽孢杆菌制备新的微生态制剂，以克服活菌数衰减的问题。

本发明的另一个目的提供上述微生态制剂的制备方法，利用该方法生产的微生态制剂产品稳定性比较好。

本发明的进一步目的是提供上述微生态制剂在制备动物生长促进剂或胃肠药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用产芽孢乳酸杆菌为出发菌种，利用液体发酵法进行菌种培养。先对菌种进行扩大培养，然后接种到发酵罐中发酵，结束后采用离心机离心收集菌体，然后添加载体进行气流干燥，最大限度的实现了菌体含量和产量的稳定。在饲料中添加该微生态制剂可以代替目前作为生长促进剂的抗生素或激素类产品，不仅可以解决畜产品药物残留的问题，还可以起到促进动物健康，改善动物肉质等多项功能。

上述扩大培养的条件是：温度37℃，pH6.8，培养时间20小时；所述发酵的条件是：温度37℃，pH6.8，培养36小时。

本发明所采用的乳酸芽孢杆菌不仅具备普通乳酸菌的优点，而且能够耐热、耐干燥和耐酸，与常见的乳酸菌相比，有很高的耐胃酸和胆汁的能力，同时具有生长速度快等优点，这就保证了该菌株可以顺利通过胃进入动物肠道并迅速发挥作用，抑制肠道内腐败菌的生长，在饲料中添加使用可以促进动物生长和提高饲料转化率，可达到取代抗生素或激素类产品的目的。从而解决畜产品药物残留的问题，促进动物健康生长。

经过实验表明芽孢乳酸杆菌对大鼠高血脂症有一定的治疗作用，对正常大鼠的空腹血糖水平基本无影响，可降低实验性糖尿病大鼠的血糖水平，对糖耐量的Cmax有明显的降低作用，使糖耐量减低现象好转。芽孢乳酸杆菌db-1在高剂量时可提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，对吞噬细胞功能有一定增强作用。芽孢乳酸杆菌db-1对小鼠溶血素试验表明，该制剂对小鼠体液免疫功能有一定的增强作用。根据芽孢乳酸杆菌db-1对小鼠NK细胞活性影响试验表明，在高剂量时，对ConA诱导下的小鼠淋巴细胞转化有增强作用。在中高剂量时，可增强小鼠NK细胞活性。

与现有微生态制剂相比，本发明具有如下有益效果：本发明利用乳酸芽孢杆菌生产新的微生态制剂，与市场现有产品相比，有更高的活力，能避免在贮存运输和加工使用过程中常见的活菌数衰减问题，对饲料加工过程中的逆环境有很高的抗性。该微生态制剂可以顺利通过胃进入动物肠道并迅速发挥作用，抑制肠道内腐败菌的生长，在饲料中添加使用可达到取代抗生素时目的。本发明乳酸芽孢杆菌微生态制剂的制备采用液体发酵法跟现有的固体发酵法相比，具有更高的稳定性。另外，本发明的乳酸芽孢杆菌微生态制剂能促进胃肠道微生态平衡，增强非特异性免疫功能；在饲料中添加使用可以促进动物生长和提高饲料转化率，可达到取代抗生素或激素类产品的目的。从而解决畜产品药物残留的问题，促进动物健康生长。

具体实施方式

实施例1  乳酸芽孢杆菌微生态制剂的制备

将试管中的乳酸芽孢杆菌D-1接种至三角瓶中扩培(37℃，pH6.8，培养20小时)，然后接种至500L发酵罐中发酵(接种量10％，温度pH同上，培养36小时)，离心分离菌体，添加玉米淀粉载体混和(菌体与玉米淀粉的体积比为1∶2)，气流干燥制得芽孢乳酸杆菌菌粉。扩培和发酵的培养基为营养肉汤培养基。

实施例2  乳酸芽孢杆菌的耐热耐盐耐酸实验

表1、乳酸芽孢杆菌耐热性试验

热处理时间(min)	干热80℃处理后菌体含量(CFU)	干热100℃处理后菌体含量(CFU)	湿热80℃处理后菌体含量(CFU)	湿热100℃处理后菌体含量(CFU)
					0	2.54×1010	2.54×1010	2.54×1010	2.54×1010
10	2.52×1010	1.41×1010	2.52×1010	2.39×1010

20	2.46×1010	1.21×1010	2.33×1010	8.12×109
					30	2.39×1010	8.15×109	2.21×1010	7.01×109

表2、乳酸芽孢杆菌耐盐度试验

NaCL浓度	1％	2％	3％	4％	5％
						25℃存放12h菌体存活率	99％	95％	94％	92％	91％
25℃存放24h菌体存活率	99％	94％	94％	85％	82％
						25℃存放48h菌体存活率	97％	89％	81％	76％	74％

表3、乳酸芽孢杆菌耐酸度试验

pH	1	2	3	4	5	6	7	8	9
										37℃存放2h菌体存活率	94％	94％	97％	99％	100％	100％	100％	92％	91％
37℃存放4h菌体存活率	94％	94％	96％	99％	100％	100％	100％	91％	90％
										37℃存放8h菌体存活率	93％	93％	96％	96％	92％	90％	91％	90％	90％
37℃存放12h菌体存活率	82％	86％	92％	94％	89％	89％	88％	85％	82％
										37℃存放16h菌体存活率	75％	76％	88％	84％	80％	78％	72％	76％	74％

从表1、表2、表3可见，乳酸芽孢杆菌能够耐酸、耐热、耐盐，可以抵抗动物体内不良环境因子对其的影响，活着进入肠道，克服了现有微生态制剂存在活菌数衰减的问题。

实施例3  芽孢乳酸杆菌db-1安全性毒理学试验

一、材料：

昆明种小鼠(中山医科大学动物中心提供)，杆菌(db-1)发酵液

二、方法：

以Karber氏法测定小鼠经口LD₅₀，选用18-22g健康昆明小鼠50只，随机分为五组。每组雌雄各半，将杆菌原液按10、5、2.5、1.25、0.625g/kg体重五种剂量分别给小鼠灌喂染毒，灌喂后观察并记录一周内各组实验动物的症状及死亡情况。

剂量(g/kg)	菌数(个/kg)	动物数(n)	死亡数(n)
				0.6250	5.25×1010	10	0
1.2500	1.05×1010	10	0
				2.5000	2.10×1011	10	0
5.0000	4.20×1011	10	0
				10.0000	8.40×1011	10	0

三、结果与结论：

观察期间各组小鼠均无异常表现，亦均未发生死亡，见表4。

表4

表明该样品小鼠经口LD₅₀＞10.0g/kg b.w.按急性毒性分级标准属无毒物质。

实施例4  芽孢乳酸杆菌db-1粉剂饲养试验

1.芽孢乳酸杆菌制剂对乳猪黄白痢的预防

试验组：2～3天龄(剪牙断尾时)乳猪，取芽孢乳酸杆菌db-1粉剂6g(菌体含量＞10¹¹CFU/g)溶于30ml生理盐水中，按每头3ml灌服一次。10天龄按每2g灌10头的量再灌服一次。

对照组：不灌服药物。

各组试验条件相同，其他饲养管理均按猪场原有正常饲养管理制度进行，结果见表5，可见芽孢乳酸杆菌制剂对乳猪黄白痢有预防作用。

表5

试验组别	数量：头	1～22d黄白痢发生次数	初生均重(Kg)	22日龄均重(Kg)	1～22平均日增重(g)
						db-1组	217	0	1.46	7.12	257
对照组	233	20	1.56	6.62	230

2.芽孢乳酸杆菌制剂对乳猪黄白痢的治疗试验组：下痢乳猪，取芽孢乳酸杆菌粉剂2g(菌体含量＞10¹¹CFU/g)溶于20ml生理盐水中，按每头2ml灌服，每日一次，灌服三次。

对照组：采用常规抗菌素药物“痢菌净”治疗

各组试验条件相同，其他饲养管理均按猪场原有正常饲养管理制度进行，结果见表6，可见芽孢乳酸杆菌制剂对乳猪黄白痢有很好的治疗作用，效果比“痢菌净”要好。

表6

	对照	试验
			治疗头数	40	11
0～24小时	60.0％	54.5％
			24～48小时	90.0％	100.0％
48～72小时	95.0％

3.芽孢乳酸杆菌制剂对仔猪生产性能的影响(广东肇庆)

3.1试验材料：

芽孢乳酸杆菌db-1粉剂：中试产品，活菌总数≥2×10¹⁰CFU/g。

试验动物：选用21日龄左右断奶的体重相近杜大长三元杂仔猪120头。

基础日粮：对照组与试验组猪均使用营养水平相同的教槽料、断奶仔猪料及小猪料配制的配合饲料。

3.2试验方法：

28日龄杜大长三元杂仔猪120头，按平均体重相近的原则随机均分为对照组和试验组。对照组断奶仔猪及小猪按常规添加抗生素类促生长剂。试验组饲料中均不添加抗生素类促生长剂，添加0.08％的乳酸杆菌粉剂。试验组以及对照组均在断奶至断奶后5~7天用抗生素(支原净+金霉素+强力霉素)饮水预防腹泻以及呼吸道疾病，各组试验期均为42天，各组饲养条件相同，饲养管理按猪场正常饲养管理制度进行。

3.3试验内容

试验开始时、70日龄早上空腹称猪只体重及料重(称重前一天晚上断料，并将料槽中的料收回称重)，记录饲料消耗、体重变化、腹泻情况及死淘头数，计算饲料转化率、平均日增重和育成率。观察猪只健康状况、粪便稀稠及气味等情况。

3.4试验结果

芽孢乳酸杆菌粉剂对仔猪平均体重(kg)、平均日增重(g)的影响见表7。

表7

组别	28日龄重	70日龄重	28～70d平均日增重
				对照组	7.00	20.80	328.57
0.08％db-1	7.40	22.20	353.38

芽孢乳酸杆菌粉剂对仔猪日料重比、腹泻率、成活率的影响见表8。

表8

组别	28～70d料重比	全期腹泻次数	全期肺炎次数	死淘率
					对照组	1.70	28	30	18.0％
0.08％db-1	1.53	15	22	9.4％

从以上结果可以看出，仔猪饲料中添加适量的芽孢乳酸杆菌制剂，可明显降低仔猪的腹泻，日增重明显提高，饲料转化率提高，成活率也有较明显的提高。而且在试验过程中观察到，添加“乳酸杆菌粉剂”的试验组仔猪较添加抗生素的对照组精神状态好，食欲旺盛，患病次数很少，皮毛光滑，所拉粪便臭味降低。试验结果说明添加适量的乳酸杆菌制剂，不仅可以提高仔猪的生产性能，而且还可以增进仔猪健康状况及改善猪舍及猪场的饲养环境，在仔猪日粮中添加0.08％的芽孢乳酸杆菌db-1效果明显。

4.芽孢乳酸杆菌制剂对AA肉鸡生产性能和健康状况的影响(山东)

4.1试验动物

选用刚出生的商品AA肉鸡5000只，试验组2600只，对照组2400只。对照组选用山东六合生产的已添加抗生素的30％肉鸡浓缩料配制的全价料。试验组肉鸡饲料使用潍坊美林生产的不含抗生素的5％肉鸡预混料配制的全价料，并在饲料中添加0.05％芽孢乳酸杆菌制剂(含菌量≥2×10¹⁰CFU/g)。两组肉鸡饲料的营养水平相同，试验期均为7周。

4.2饲养管理及疾病控制

各组饲养条件相同，免疫程序相同(7日龄，新城疫喘支双联苗；14日龄，法氏囊疫苗；18日龄，球虫；25日龄，新城疫疫苗)，对照组按常规使用抗生素预防和治疗疾病，试验组在1日龄开始，按400只/2g连续3天使用乳酸杆菌制剂饮水预防雏鸡白痢等消化道疾病，使用纯中药制剂(广州广牧动物保健品厂生产的清肺散、清瘟败毒药)预防和治疗呼吸道疾病，其它饲养管理按鸡场常规饲养管理制度进行。

4.3结果与讨论

与添加抗生素的对照组相比，试验组肉鸡精神状态好，食欲旺盛，生长速度快，均匀度较好，普遍健康体壮，而对照组则易患消化道疾病，尤其是雏鸡白痢等消化道疾病发生较多。试验组肉鸡在7周龄时，平均体重超过对照组，全期饲料转化率也高于对照组。

表9.芽孢乳酸杆菌制剂对AA肉鸡增重的影响(g)

表10.芽孢乳酸杆菌制剂对AA肉鸡料肉比及成活率的影响

在AA肉鸡日粮中添加0.05％的芽孢乳酸杆菌制剂，饲养的肉鸡在7周龄达到要求体重，且肉鸡消化道疾病发生减少，而且饲料转化率较对照组高。本试验证明乳酸杆菌制剂可预防雏鸡白痢，并对肉鸡生产性能有较明显的改善作用，使用效果明显。总体来看，添加乳酸杆菌制剂的试验组成本较低，效益更高。

本批试验组肉鸡由山东烟台检验检疫局检测结果显示，该批肉鸡胴体及内脏中无任何抗生素药物残留，完全达到出口欧盟、日本的标准。

实施例6  芽孢乳酸杆菌db-1粉剂小范围人群饮用试验结果：

由表11可见，芽孢乳酸杆菌db-1粉剂对增加小肠蠕动速度，改善肠道功能有较好的疗效。

表11

性别	年龄	服用时间	原病情	服药后情况
					女	38	30天	幽门螺杆菌性慢性胃炎	痊愈
女	65	长期	胃出血术后	感觉良好食量增加
					女	14	1天	腹泻	痊愈
女	47	长期	食欲不好，消化不良	胃口好，体重增加
					男	39	20天	慢性胃炎、结肠炎	痊愈，且可喝冰冻饮料及胃口增加
男	29	3天	饮酒过量厌食	胃口好，常觉得饿
					男	41	长期	胃口不好，偏瘦	胃口好，体重增加
男	26	2天	腹泻	痊愈

Claims (6)

1、一种乳酸芽孢杆菌微生态制剂，包括菌种和载体，其特征在于所述菌种为乳酸芽孢杆菌。

2、根据权利要求1所述的乳酸芽孢杆菌微生态制剂，其特征在于所述载体为淀粉。

3、权利要求1所述的乳酸芽孢杆菌微生态制剂的制备方法，其特征在于采用液体发酵法制备乳酸芽孢杆菌微生态制剂。

4、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述采用液体发酵法制备乳酸芽孢杆菌微生态制剂为：将乳酸芽孢杆菌扩大培养，然后在发酵罐中发酵，离心分离菌体，添加载体，干燥得到乳酸芽孢杆菌微生态制剂。

5、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述扩大培养的条件是：温度37℃，pH6.8，培养时间20小时；所述发酵的条件是：温度37℃，pH6.8，培养36小时。

6、权利要求1所述乳酸芽孢杆菌微生态制剂在制备动物生长促进剂或胃肠药物中的应用。